摘 要：【目的】探究轉(zhuǎn)錄因子AGL11在紫薇屬紫薇自交及川黔紫薇與紫薇雜交過程中不同時(shí)間的差異性表達(dá)及其在酵母中的轉(zhuǎn)錄自激活特性，為研究紫薇遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實(shí)率低的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳浴享崱限弊越皇诜酆?‘紫韻’紫薇ב川黔1號(hào)’川黔紫薇雜交授粉后 24、48 和72 h的雌蕊為材料，克隆LeAGL11基因，通過生物信息學(xué)分析其理化性質(zhì)等，采用實(shí)時(shí)熒光定量方法分析該基因在不同授粉方式和不同階段的相對(duì)表達(dá)量，通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建LeAGL11的酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)?！窘Y(jié)果】從川黔紫薇中克隆得到LeAGL11基因，該基因的編碼序列長(zhǎng)666 bp，編碼221個(gè)氨基酸，LeAGL11蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于膜蛋白，屬于親水性蛋白。氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析顯示其與紫薇、石榴和葡萄的AGL11蛋白都有較高的相似度；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和序列分析表明其具有MADS-box基因家族中典型的MADS-box和K-box保守結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)分析不同階段的相對(duì)表達(dá)量表明LeAGL11基因在雜交后呈現(xiàn)出上調(diào)的趨勢(shì)，在自交后呈現(xiàn)出先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)，在自交授粉24 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高，自激活檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pGBKT7-LeAGL11重組質(zhì)粒在缺色氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在SD/-Trp+AbA+X-α-gal培養(yǎng)基中沒有發(fā)生顏色變化?！窘Y(jié)論】LeAGL11基因在紫薇自交過程及川黔紫薇和紫薇雜交過程中的相對(duì)表達(dá)量具有一定的差異性，且LeAGL11無(wú)轉(zhuǎn)錄自激活活性，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：紫薇屬；遠(yuǎn)緣雜交；AGL11；基因克??；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S718.46 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-923X（2024）06-0197-10

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2023JJ30338）；湖南省科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2022RC1012）；長(zhǎng)沙市杰出創(chuàng)新青年培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（kq2106090）。

Cloning， expression analysis and autonomous transcriptional activation testing of transcription factor LeAGL11 from Lagerstroemia excelsa （Dode） Chun

LI Xuelu1， LU Liushu1， DENG Fuyuan2， LI Lu1， LEI Yuxing1， PENG Jiqing1， HE Gang1， QIAO Zhongquan2

（1. College of Life and Environmental Sciences， Central South University of Forestry Technology， Changsha 410004， Hunan， China； 2. Hunan Provincial Key Laboratory of Tree Clone Breeding， Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004， Hunan， China）

Abstract：【Objective】To investigate the differential expression of AGL11 in self- and cross pollinations between Lagerstroemia indica and Lagerstroemia excelsa （Dode） Chun， and self-activation characteristics of the transcription factor AGL11， it can lay a foundation for the study of the biological function of LeAGL11 in the distant cross incompatibility between L. excelsa and L. indica.【Method】We cloned the LeAGL11 and analyzed its physicochemical property through bioinformatics， RT-qPCR was used to assess and compare the expression of LeAGL11 in pistils of different developmental stages （24 h， 48 h and 72 h after ‘Ziyun’בZiyun’ and ‘Ziyun’בL. excelsa No.1’）， a pGBKT7-AGL11 yeast expression vector was constructed by DNA recombination technology and transformed into the Y2HGold yeast strain.【Result】The coding sequence of LeAGL11 was 666 bp， translating 221 amino acids， it had no signal peptide and transmembrane domain， it was hydrophilic protein but not membrane protein， the sequence alignments of amino acids and phylogenetic analysis showed that it had a high degree of similarity with the AGL11 protein of L. indica， Punica granatum and Vitis vinifera. The protein structure prediction and sequence analysis indicated that it had a typical MADS-box and K-box conserved domains of the MADS-box gene family. The relative expression of this gene was highest expressed at 24 h after self-pollination， showing an upward trend in selfing， and firstly decreased and then increased up in hybridization. Self-activation showed pGBKT7-LeAGL11 plasmid did not turn blue in SD/-Trp + AbA + X-α-gal medium.【Conclusion】The relative expression of the LeAGL11 gene during selfing in L. indica and hybridization between L. indica and L. excelsa is characterized by a certain degree of variability， the LeAGL11 gene has no selfactivation activity and could be used for subsequent yeast two hybrid experiments.

Keywords： Lagerstroemia； distant hybridization； AGL11； gene cloning； gene expression

MADS-box基因家族是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，幾乎存在于所有真核生物中，其特征是每個(gè)MADS-box蛋白在N端上都包含一個(gè)MADS結(jié)構(gòu)域[1]。MADS-box基因家族作為一類廣泛存在于植物中序列特異的同源異型基因，其編碼的蛋白質(zhì)主要包含MADS-box域、K-box域、I-box域、保守的C端以及非保守的N端等結(jié)構(gòu)域[2-3]。MADS-box蛋白主要由2種類型組成，包括I型和II型，I型MADS-box蛋白可進(jìn)一步分為Mα、Mβ和Mγ三個(gè)亞族；II型MADS-box蛋白由MEF2型和MIKC型組成，MIKC型蛋白由于K-box結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)差異和I結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度差異，可細(xì)分為MIKCC型和MIKC*型[4-5]。MIKCC型進(jìn)一步分為更多的亞族，包括A、AP3/PI、C/D、E、SVP、FLC、ANR1和TM3等[6]。這些基因以二聚體或多聚體的形式與特定的DNA序列結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)花發(fā)育過程直接或間接的調(diào)控[7]。

目前ABCDE模型已被廣泛接受并用于解釋高等植物花器官特征決定的分子機(jī)制，其中植物雌蕊的發(fā)育主要受C類和D類基因的調(diào)控[8-9]。AG亞族基因在一次古老的基因組復(fù)制事件中分為2個(gè)分支，這2個(gè)分支為AGAMOUS分支和AGL11分支[10-11]。AGL11分支在調(diào)控胚珠發(fā)育方面表現(xiàn)出一定的功能，熊書等[12]在油茶中發(fā)現(xiàn)AGL11在種子發(fā)育過程中高表達(dá)，而在油茶胚發(fā)育中發(fā)揮著重要作用；陳利娜等[13]發(fā)現(xiàn)AGL11轉(zhuǎn)基因擬南芥花雄蕊和花瓣變小，雌蕊花柱高度和柱頭表面乳突狀細(xì)胞的長(zhǎng)度變長(zhǎng)；陳會(huì)鮮等[14]在木薯中挖掘出AGL11是調(diào)控木薯雌花的心皮和子房發(fā)育的關(guān)鍵基因；何卓遠(yuǎn)等[15]發(fā)現(xiàn)AGL11基因在向日葵花發(fā)育后期子房和果實(shí)的發(fā)育進(jìn)程中具有重要的調(diào)控作用；崔夢(mèng)杰等[16]發(fā)現(xiàn)葡萄AGL11在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期的種子區(qū)表達(dá)量較高，與胚乳發(fā)育有關(guān)。可以推斷 AGL11 是胚珠發(fā)育的關(guān)鍵基因。

紫薇Lagerstroemia indica是千屈菜科紫薇屬落葉灌木或小喬木，栽培歷史悠久，品種繁多、色彩豐富，紫薇用途廣泛，觀賞價(jià)值高。因其通常在盛夏開花且花期較長(zhǎng)被廣泛用于公園、庭院建設(shè)和城市的綠化與裝飾等，同時(shí)植株還可入藥，花朵可提取香精，對(duì)紫薇的研究與選育具有重要的意義[17-18]。與紫薇同科同屬的川黔紫薇Lagerstroemia excelsa （Dode） Chun是一種罕見的落葉喬木，花多為白色或淡黃色，這2個(gè)物種之間的雜交可以產(chǎn)生有意義的雜交后代，但雜交存在障礙，結(jié)實(shí)率低且種子無(wú)法萌發(fā)得到雜交后代苗。雜交育種通過不同種或同一種不同種源、家系、無(wú)性系間的交配獲得雜種，可以創(chuàng)造新的變異，是聚合優(yōu)良性狀的重要途徑[19-20]。關(guān)于紫薇屬中這2種紫薇雜交種子敗育在分子生物學(xué)方面的研究極少，本研究以‘川黔1號(hào)’川黔紫薇和‘紫韻’紫薇雜交授粉24 h后的雌蕊為試驗(yàn)材料，克隆出了川黔紫薇中的LeAGL11（L. excelsa （Dode） Chun Agamous-like 11）基因，分析其序列特征，用qRTPCR分析該基因在紫薇屬自交與雜交授粉后3個(gè)不同時(shí)期24、48和72 h的表達(dá)情況，并檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄自激活情況，為進(jìn)一步探索LeAGL11 基因的功能互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與紫薇屬遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實(shí)率低的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材 料

選用湖南省林業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地的紫薇品種‘紫韻’紫薇和‘川黔1號(hào)’川黔紫薇作為試驗(yàn)材料進(jìn)行雜交，‘紫韻’進(jìn)行自交，紫薇花蕾逐漸展開時(shí)間為早上05：30—07：00。從05：30開始，選擇將要開放的‘紫韻’花蕾，去除花瓣和雄蕊，套袋。去雄后2 h左右，柱頭出現(xiàn)黏液，花藥出現(xiàn)粉狀顆粒，以‘紫韻’和‘川黔1號(hào)’為父本進(jìn)行人工授粉，套袋保護(hù)。取雜交和自交授粉后24 h、48 h、72 h的雌蕊置于液氮速凍，后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試 劑

EASYspin Plus多糖多酚復(fù)雜植物RNA提取試劑盒購(gòu)買于艾德萊（北京）生物科技有限公司，高保真酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、同源重組試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑購(gòu)買于喏唯贊生物科技有限公司，2 000 bp DNA Marker購(gòu)于Takara公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于上海唯地生物公司，Y2HGOLD酵母感受態(tài)細(xì)胞等購(gòu)于北京酷來搏科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

從川黔紫薇基因組數(shù)據(jù)中篩選出一條序列，根據(jù)該序列用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。其中，LeAGL11-F和LeAGL11-R用于LeAGL11基因克隆；LeAGL11-q-F和LeAGL11-q-R用于熒光定量PCR試驗(yàn)；LeEF-eα-qF和LeEF-eα-qR為內(nèi)參基因的引物；pGBKT7-LeAGL11-F和 pGBKT7-LeAGL11-R用于構(gòu)建酵母表達(dá)載體進(jìn)行自激活檢測(cè)。

1.2.2 總RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）分析

使用EASYspin Plus多糖多酚復(fù)雜植物RNA提取試劑盒進(jìn)行雜交和自交授粉后24、48、72 h的總RNA。使用逆反轉(zhuǎn)錄試劑盒將高質(zhì)量的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA用作實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)模板，用ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix試劑盒（Vazyme）進(jìn)行 qRT-PCR 試驗(yàn)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。使用Primer 3.0工具（https：// bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)LeMADS基因的特異性擴(kuò)增引物，以LeEF-eα為內(nèi)參基因[21]，利用2–ΔΔCT法計(jì)算基因雜交和自交后不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量[22]。

1.2.3 目的基因克隆

以cDNA為模板，按照高保真酶說明書的擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增，使用20 μL的擴(kuò)增體系：cDNA 2 μL，Primer F/R各0.5 μL，2×Rapid Master Mix 10 μL，加ddH2O至總體積為20 μL。將PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將目的條帶進(jìn)行切膠回收，隨后連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性克隆送到華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 LeAGL11的生物信息學(xué)分析

將LeAGL11基因的堿基序列翻譯成氨基酸序列，在NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）使用BlastP檢索，然后將同源性高的氨基酸序列導(dǎo)入軟件DNAMAN V6進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA11軟件進(jìn)行不同物種AGL11氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。通過 ExPASy在線網(wǎng)站（https：// web.expasy.org/protparam/）得到LeAGL11的分子量、等電點(diǎn)、親水性基本理化性質(zhì)，Signal6.0 （https：// services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）預(yù)測(cè)LeAGL11是否含有信號(hào)肽位點(diǎn)，TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析預(yù)測(cè)LeAGL11的跨膜結(jié)構(gòu)域，利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？page=npsa%20_sopma.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy.org/interactive）進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型建立。

1.2.5 pGBKT7-LeAGL11載體的構(gòu)建

以cDNA為模板，用pGBKT7-AGL11-F和pGBKT7-AGL11-R引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到插入片段。選擇合適的酶切位點(diǎn)EcoR I和BamH I，使用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pGBKT7進(jìn)行雙酶切，37 ℃孵育30 min得到線性化載體。將目的片段和線性化載體分別進(jìn)行純化，回收產(chǎn)物用重組酶在37 ℃下反應(yīng)30 min，重組產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化，菌液PCR后送至華大基因公司測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果，結(jié)果正確，提取質(zhì)粒置于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 自激活與毒性檢測(cè)

將pGBKT7-LeAGL11重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到Y(jié)2HGOLD感受態(tài)細(xì)胞中，將陽(yáng)性菌液分別稀釋10倍、100倍、1 000倍后涂布在SD/-Trp和SD/-Trp+AbA+X-α-gal培養(yǎng)基上，放置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d，觀察SD/-Trp+AbA+X-α-gal平板菌落是否變藍(lán)，判斷 LeAGL11是否存在自激活。

2 結(jié)果與分析

2.1 LeAGL11基因克隆

提取雜交和自交后24、48和72 h的雌蕊總 RNA（圖1A），將成功提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)表1中相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后得到清晰的目的條帶（圖1B），送至華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，得到636 bp的序列，與目的片段相似度為93.84%。在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示該基因序列與其他多種植物中的AGL11具有較高的同源性，表明成功克隆并將該基因命名為L(zhǎng)eAGL11，以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。通過ORF finder 分析顯示，LeAGL11 基因的 ORF 為 666 bp，共編碼221個(gè)氨基酸，其序列及推導(dǎo)的氨基酸序列如圖2所示，具有MADS-box基因家族中典型的MADS-box和K-box保守結(jié)構(gòu)域。

2.2 LeAGL11的理化性質(zhì)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

LeAGL11的CDS序列長(zhǎng)666 bp，編碼221個(gè)氨基酸。在ExPASy中進(jìn)行蛋白基本理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示LeAGL11的蛋白分子式為C1101H1809N327O346S13，分子量為25 580.24 Da，理論等電點(diǎn)pI 為 9.25，總原子個(gè)數(shù)為3 596，氨基酸含量占比最高的是谷氨酸，為10.4%。不穩(wěn)定指數(shù)為54.90，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。帶負(fù)電殘基總數(shù)為28，帶正電殘基總數(shù)為35，脂肪系數(shù)為80.36。親水性指數(shù)-0.729，屬于親水性蛋白。信號(hào)肽位點(diǎn)預(yù)測(cè)LeAGL11無(wú)信號(hào)肽位點(diǎn)，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于膜蛋白。在NCBI中Conserverd Domain Search在線分析LeAGL11蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖3所示，LeAGL11蛋白在第2～78 位之間存在典型的MADS-MEF2-Like 特定位點(diǎn)，屬于MADS超家族，在第88～172 位之間存在典型的 K-box 結(jié)構(gòu)域，K-box 結(jié)構(gòu)域是MADS轉(zhuǎn)錄因子里面典型的結(jié)構(gòu)域。MADS轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)節(jié)植物花的發(fā)育。

2.3 LeAGL11的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

LeAGL11蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果分析如圖4。LeAGL11 蛋白的221個(gè)氨基酸中49個(gè)氨基酸形成無(wú)規(guī)則卷曲，占22.17%；133個(gè)為α螺旋，占60.18%；β轉(zhuǎn)角有9個(gè)，占4.07%；延伸鏈有30個(gè)，占13.75%。LeAGL11蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示，LeAGL11蛋白三維圖像顯示呈3個(gè)β片層結(jié)構(gòu)，4個(gè)α螺旋，還有一些無(wú)規(guī)則卷曲。

2.4 LeAGL11的多序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析

將川黔紫薇AGL11的蛋白序列與紫薇（MW714394.1）、石榴（KX378137.1）、木薯（XP_021614256.1）、蓖麻（XP_015572387.1）、榴蓮（XP_022718367.1）、葡萄（MG581423.1）和擬南芥（AAC49080.1）共7個(gè)物種的MADS-box基因AGLL11蛋白序列進(jìn)行比較，分析結(jié)果顯示總相似度為82.33%（圖6），其中和紫薇的相似度結(jié)果最高為98.19%。這些發(fā)現(xiàn)表明，LeAGL11和其他物種的AGL11具有較高的同源性，可能具有相似的功能，可以通過功能驗(yàn)證來進(jìn)一步探索川黔紫薇和紫薇遠(yuǎn)緣雜交障礙的調(diào)控機(jī)制。

選擇紫薇Lagerstroemia indica、石榴Punica granatum、木薯Manihot esculenta、蓖麻Ricinus communis、榴蓮Durio zibethinus和擬南芥Arabidopsis thaliana共6種植物的AGL11蛋白序列作為參照，采用 Neighbor Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并利用Bootstrap 進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)抽樣1 000次。進(jìn)化分析結(jié)果顯示（圖7），川黔紫薇與紫薇、石榴和葡萄親緣關(guān)系較近，LeAGL11 與紫薇 LiAGL11歸為同一分支，說明二者的同源蛋白可能具有相似的功能。

2.5 LeAGL11基因的表達(dá)分析

對(duì)比‘紫韻’紫薇ב川黔1號(hào)’川黔紫薇遠(yuǎn)緣雜交授粉和‘紫韻’自交授粉24、48、72 h后雌蕊中LeAGL11基因的表達(dá)水平。熒光定量試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，對(duì)比雜交與自交結(jié)果可以看出，LeAGL11基因在自交授粉24 h后雌蕊中的相對(duì)表達(dá)量高于雜交授粉24 h后的相對(duì)表達(dá)量，在自交授粉48和72 h后的相對(duì)表達(dá)量均低于同時(shí)期的雜交雌蕊；對(duì)自交處理不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，自交授粉48 h后的相對(duì)表達(dá)量低于自交授粉24和72 h后的相對(duì)表達(dá)量，但自交授粉24 h后的相對(duì)表達(dá)量在3個(gè)階段中最高，呈現(xiàn)出先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)；對(duì)雜交處理不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雜交授粉72 h后的相對(duì)表達(dá)量比雜交授粉48 h后更高，雜交授粉48 h后的相對(duì)表達(dá)量比雜交授粉24 h后更高，目的基因表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯上調(diào)的趨勢(shì)。

2.6 酵母自激活檢測(cè)

將成功轉(zhuǎn)化的pGBKT7-LeAGL11質(zhì)粒和空載BD轉(zhuǎn)到Y(jié)2HGOLD感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在SD/-Trp和SD/-Trp+AbA+X-α-gal培養(yǎng)基上，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃下培養(yǎng)3～5 d，觀察其生長(zhǎng)情況（圖9）。結(jié)果表明，空載BD在SD/-Trp培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，在SD/-Trp+AbA+X-α-gal的培養(yǎng)基上菌落沒有變藍(lán)，pGBKT7-LeAGL11在缺色氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在加了AbA和X-α-gal的培養(yǎng)基上沒有發(fā)生顏色變化，因此插入誘餌載體的基因LeAGL11不存在自激活活性，可用于后續(xù)酵母雙雜交試驗(yàn)進(jìn)行互作蛋白的篩選。

3 討 論

紫薇與川黔紫薇的遠(yuǎn)緣雜交存在明顯的障礙，雜交授粉的結(jié)實(shí)率非常低，沒有可存活的雜交種子萌發(fā)，也無(wú)法獲得雜交后代幼苗[23]。本研究在川黔紫薇中克隆了AG同源基因AGL11。AGL11是AG基因亞族之一，調(diào)控胚珠發(fā)育[24]。此外，已有研究表明AGL11不僅在擬南芥中，而且在其他物種如番茄、葡萄和水稻中，在調(diào)控胚珠發(fā)育和種子形成中起著關(guān)鍵作用[25-27]。本研究成功克隆得到的川黔紫薇LeAGL11基因，長(zhǎng)度為666 bp，由221個(gè)氨基酸組成，含有典型的MADS-box和K-box保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示LeAGL11與同屬的紫薇LiAGL11、同為桃金娘目的石榴PgAGL11氨基酸序列的親緣關(guān)系都很近，LeAGL11和其他物種的AGL11具有較高的同源性，極有可能發(fā)揮相似的功能，可以通過功能驗(yàn)證研究來進(jìn)一步探索川黔紫薇和紫薇遠(yuǎn)緣雜交障礙的調(diào)控機(jī)制。

對(duì)LeAGL11基因在自交和雜交2種不同授粉方式不同時(shí)期的實(shí)時(shí)熒光定量分析顯示了LeAGL11的差異性表達(dá)，LeAGL11基因在自交授粉24 h后雌蕊中的相對(duì)表達(dá)量高于雜交授粉24 h后的相對(duì)表達(dá)量，在自交授粉48和72 h后的相對(duì)表達(dá)量均低于同時(shí)期的雜交雌蕊；在自交中授粉24 h后的相對(duì)表達(dá)量在3個(gè)階段中最高，呈現(xiàn)出先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)；在雜交中授粉72 h后的相對(duì)表達(dá)量最高，LeAGL11基因表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯上調(diào)的趨勢(shì)。紫薇自交親和且能得到較多雜交后代可育苗，而川黔紫薇和紫薇雜交種子結(jié)實(shí)率低，沒有獲得雜交后代可育苗，從LeAGL11在雜交授粉后的表達(dá)量逐漸增高的趨勢(shì)推測(cè)其參與調(diào)控了種子敗育的過程。

已有研究表明乙烯作為上游調(diào)控因子可以通過抑制AG類基因表達(dá)而影響植物胚珠發(fā)育[28]。酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白質(zhì)相互作用的有效方法。如果誘餌蛋白本身具有轉(zhuǎn)錄激活功能會(huì)激活下游啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的報(bào)告基因，所以在利用誘餌蛋白進(jìn)行酵母雙雜篩選前，為降低假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的概率，首先要排除蛋白的自激活功能[29]。本研究構(gòu)建了pGBKT7-LeAGL11載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到Y(jié)2HGOLD酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)，結(jié)果表明LeAGL11不存在轉(zhuǎn)錄自激活活性，可進(jìn)行后續(xù)的酵母雙雜交試驗(yàn)篩選其互作蛋白，探究LeAGL11在遠(yuǎn)緣雜交不親和過程中的互作網(wǎng)絡(luò)及功能調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究克隆了川黔紫薇LeAGL11基因，對(duì)其序列特征和表達(dá)特征進(jìn)行了分析，可為研究LeAGL11基因提供了科學(xué)依據(jù)，但尚未明確該基因的具體功能，后續(xù)將通過互作試驗(yàn)和遺傳轉(zhuǎn)化解析川黔紫薇AGL11基因的功能。目前川黔紫薇的遺傳轉(zhuǎn)化體系未建立，下一步工作是建立川黔紫薇高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，同時(shí)進(jìn)行該基因互作蛋白的篩選，進(jìn)一步明確紫薇遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實(shí)率低的分子機(jī)制，為豐富紫薇屬品種奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究從川黔紫薇中成功克隆LeAGL11基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，檢測(cè)其在紫薇屬自交和雜交授粉后不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該基因在雜交授粉后上調(diào)，構(gòu)建了pGBKT7-LeAGL11酵母誘餌載體。通過觀察酵母生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，該基因無(wú)轉(zhuǎn)錄自激活活性，可為后續(xù)篩選與LeAGL11蛋白相互作用的蛋白奠定研究基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究LeAGL11基因在紫薇和川黔紫薇雜交不親和過程中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] GUAN H L， WANG H， HUANG J J， et al. Genome-wide identification and expression analysis of MADS-box family genes in litchi （Litchi chinensis Sonn.） and their involvement in floral sex determination[J]. Plants （Basel），2021，10：2142.

[2] THEISSEN G， KIM J T， SAEDLER H. Classification and phylogeny of the MADS-box multigene family suggest defined roles of MADS-box gene subfamilies in the morphological evolution of eukaryotes[J]. Journal of Molecular Evolution，1996，43（5）： 484-516.

[3] KAUFMANN K， MELZER R， THEISSEN G. MIKC-type MADS-domain proteins： structural modularity， protein interactions and network evolution in land plants[J]. Gene，2005，347（2）： 183-198.

[4] HENSCHEL K， KOFUJI R， HASEBE M， et al. Two ancient classes of MIKC-type MADS-box genes are present in the moss Physcomitrella patens[J]. Molecular Biology and Evolution， 2002，19（6）：801-814.

[5] DíAZ-RIQUELME J， LIJAVETZKY D， MARTíNEZ-ZAPATER J M， et al. Genome-wide analysis of MIKCC-type MADS box genes in grapevine[J]. Plant Physiology，2009，149（1）：354-369.

[6] ZHAO W， ZHANG L L， XU Z S， et al. Genome-wide analysis of MADS-box genes in Foxtail Millet （Setaria italica L.） and functional assessment of the role of SiMADS51 in the drought stress response[J]. Frontiers in Plant Science，2021，12：659474.

[7] 趙夏云，鮮登宇，宋明，等.MIKC型MADS-box蛋白對(duì)開花調(diào)控作用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2014（7）：8-15. ZHAO X Y， XIAN D Y， SONG M， et al. Research progress of MIKC-type MADS-box protein regulation on flowering[J]. Biotechnology Bulletin，2014（7）：8-15.

[8] 李建安，孫穎.林木成花分子基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)林研究， 2007，25（2）：66-70. LI J A， SUN Y. Literature review of researches on molecular mechanisms of flowering development of forest trees[J]. Nonwood Forest Research，2007，25（2）：66-70.

[9] 王鵬洋，付澤元，曲姍姍，等.被子植物MADS-box基因研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工，2019（13）：94-96. WANG P Y， FU Z Y， QU S S， et al. Advances in the study of angiosperm MADS-box gene[J]. Farm Products Processing， 2019（13）：94-96.

[10] BECKER A， THEISSEN G. The major clades of MADS-box genes and their role in the development and evolution of flowering plants[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2003，29（3）： 464-489.

[11] KRAMER E M， JARAMILLO M A， DISTILIO VS. Patterns of gene duplication and functional evolution during the diversification of the AGAMOUS subfamily of MADS box genes in angiosperms[J]. Genetics，2004，166（2）：1011-1023.

[12] 熊書，李彥杰，周大祥.油菜MADS-box家族基因AGL11的克隆、表達(dá)及轉(zhuǎn)化油菜的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，30（10）： 2174-2178. XIONG S， LI Y J， ZHOU D X. Cloning and expression and transformation of MADS-box family gene AGL11 in Brassica napus[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 2017，30（10）：2174-2178.

[13] 陳利娜，張杰，牛娟，等. 石榴花發(fā)育相關(guān)基因PgAGL11的克隆及功能驗(yàn)證[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2017，44（11）：2089-2098. CHEN L N， ZHANG J， NIU J， et al. Cloning and functional verification of gene PgAGL11 associated with the development of flower organs in Pomegranate plant[J]. Horticultural Plant Journal，2017，44（11）：2089-2098.

[14] 陳會(huì)鮮，梁振華，黃珍玲，等.木薯花性別分化關(guān)鍵時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組分析及雌花分化相關(guān)候選基因的篩選[J].作物學(xué)報(bào)，2023， 49（12）：3250-3260. CHEN H X， LIANG Z H， HUANG Z L， et al. Transcriptomic profile of key stages of sex differentiation in cassava flowers and discovery of candidate genes related to female flower differentiation[J]. Acta Agronomica Sinica，2023，49（12）： 3250-3260.

[15] 何卓遠(yuǎn)，韋小英，蘇周，等. 向日葵MADS-box家族基因HaAGL11的克隆及表達(dá)分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2020，21（1）： 260-268. HE Z Y， WEI X Y， SU Z， et al. Cloning and expression analysis of the MADS-box family gene HaAGL11 in Sunflower[J]. Journal of Plant Genetic Resources，2020，21（1）：260-268.

[16] 崔夢(mèng)杰，郭鳳菲，王晨，等.葡萄VvAGL11和VvAGL15基因的鑒定及其在赤霉素誘導(dǎo)葡萄無(wú)核果實(shí)發(fā)育過程中的作用[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，42（2）：261-269. CUI M J， GUO F F， WANG C， et al. Identification and roles of VvAGL11 and VvAGL15 gene in the development process of seedless grape berry induced by gibberellin[J]. Journal of Nanjing Agricultural University，2019，42（2）：261-269.

[17] 周圍，陳建華，王曉明，等.結(jié)實(shí)與不結(jié)實(shí)紫薇花芽發(fā)育形態(tài)及生理特性[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，43（10）：148-157. ZHOU W， CHEN J H， WANG X M， et al. Developmental morphology and physiological characteristics of the flower buds of fruiting and unfruiting Lagerstroemia indica[J]. Journal of Central South University of Forestry Technology，2023，43（10）： 148-157.

[18] 鄧涪元，喬中全，王曉明，等.紫薇LiHY5基因的克隆、亞細(xì)胞定位與不同光質(zhì)下的表達(dá)分析[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2022，44（6）：1546-1554. DENG F Y， QIAO Z Q， WANG X M， et al. Cloning， subcellular localization and expression analysis of LiHY5 gene in Lagerstroemia indica under different light quality[J]. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis，2022，44（6）：1546-1554.

[19] 呂歡歡，伍岳峰，李煜，等.普通油茶雜交子代重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳分析與選擇[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2022，40（3）：14-26. LYU H H， WU Y F， LI Y， et al. Genetic analysis and selection for important traits of the crossing offspring in Camellia oleifera[J]. Non-wood Forest Research，2022，40（3）：14-26.

[20] 謝歡，王中堂，李明玥，等.棗雜交后代果實(shí)性狀遺傳分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2022，40（2）：125-134. XIE H， WANG Z T， LI M Y， et al. Genetic analysis of fruit characters in hybrid progeny of Chinese jujube[J]. Non-wood Forest Research，2022，40（2）：125-134.

[21] ZHENG T， CHEN Z， JU Y， et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis of flower development in Lagerstroemia indica and L. speciosa[J]. PLoS ONE，2018，13（3）：e0195004.

[22] LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[23] 王甜.紫薇和川黔紫薇遠(yuǎn)緣雜交親和性及種子萌發(fā)特性研究[D].長(zhǎng)沙：中南林業(yè)科技大學(xué)，2022. WANG T. Studies on compatibility and seed germination characteristics of the distant hybridization of Lagerstroemia indica and Lagerstroemia excelsa （Dode） Chun[D]. Changsha： Central South University of Forestry Technology，2022.

[24] COLOMBO L， FRANKEN J， KOETJE E， et al. The petunia MADS box gene FBP11 determines ovule identity[J]. The Plant Cell， 1995，7（11）：1859-1868.

[25] BUSI M V， BUSTAMANTE C， D’ANGELO C， et al. MADS-box genes expressed during tomato seed and fruit development[J]. Plant Molecular Biology，2003，52（4）：801-815.

[26] DRENI L， OSNATO M， KATER M M. The ins and outs of the rice AGAMOUS subfamily[J]. Molecular Plant，2013，6（3）： 650-664.

[27] OCAREZ N， MEJíA N. Suppression of the D-class MADS-box AGL11 gene triggers seedlessness in fleshy fruits[J]. Plant Cell Reports，2016，35（1）：239-254.

[28] DE M D， MARIANI C. Silencing gene expression of the ethylene-forming enzyme results in a reversible inhibition of ovule development in transgenic tobacco plants[J]. The Plant Cell， 1999，11（6）：1061-1071.

[29] 王欣怡，王曉倩，劉亞玲，等.紫花苜蓿MsMYB33基因克隆、亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)[J].草地學(xué)報(bào)，2023，31（5）：1331-1337. WANG X Y， WANG X Q， LIU Y L， et al. Cloning， subcellular localization and autonomous transcriptional activation testing of MsMYB33 gene from Medicago sativa[J]. Acta Agrectir Sinica， 2023，31（5）：1331-1337.

[本文編校：吳 彬]