楊 博，朱宇軒，繆曉青，徐曉蘭2,, ，楊文超,2,,

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350000；2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福建福州 350000；3.蜂產(chǎn)品加工與應(yīng)用教育部工程中心，福建福州 350000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是目前常見的心腦血管疾病發(fā)病的主要原因。它的發(fā)生機理主要是代謝障礙導(dǎo)致脂質(zhì)在血管中積累，形成斑塊，使得動脈腔隙變窄，進而導(dǎo)致組織或器官的缺血或壞死[1?2]。血管內(nèi)皮細胞的損傷是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，血管內(nèi)皮細胞的損傷會分泌大量的促炎因子和黏附因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進而加速AS進程[3?4]。

蜂膠是工蜂采集膠源植物的樹脂與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合而成的具有黏性的固體膠狀物[5]。蜂膠的化學(xué)成分因膠源植物的不同而不同，其中，中國蜂膠主要的膠源植物為楊樹屬，目前已從中國蜂膠中鑒定出300多種化學(xué)成分，包括酚酸類、黃酮類、萜烯類、醇類、香豆素類和脂類等[6?8]。課題組前期的實驗已分析過中國蜂膠的化學(xué)成分，主要有喬松素、短松葉素、高良姜素、白楊素等，含量最多的化學(xué)成分為黃酮類化合物，占71.92%[9]。現(xiàn)代藥理研究表明，蜂膠具有抗微生物，抗腫瘤，調(diào)節(jié)血糖，抗氧化以及抗炎活性[10?13]。有研究表明蜂膠具有明顯的抗炎作用，可以預(yù)防動脈粥樣硬化，減少血脂，影響血管生成，并在預(yù)防和治療心血管疾病中發(fā)揮重要作用[14?15]。Kitamura等[16]的證明蜂膠可以誘導(dǎo)M1型巨噬細胞向髓源性抑制細胞（MDSC）分化，有效減少M1細胞，從而抑制M1分泌重要的促炎細胞因子，如TNF-α和IL-6，將炎癥過程轉(zhuǎn)向消退。蜂膠提取物能降低飼喂高脂飲食的ApoE-/小鼠的總膽固醇（TC）、甘油三酸酯（TG）、非高密度脂蛋白膽固醇（non-HDL-C）的水平以及炎癥因子IL-6和IL-17的產(chǎn)生[17]。蜂膠中的主要成分白楊素也可以減輕內(nèi)皮細胞間的黏附，并降低IL-1β?lián)p傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中炎癥因子的表達[18]。

本實驗用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠主動脈內(nèi)皮細胞構(gòu)建損傷模型，研究蜂膠乙醇提取物（ethanol extracts of propolis，EEP）對LPS誘導(dǎo)的小鼠主動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)炎癥因子的影響，為治療心腦血管疾病提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂膠 膠源植物楊樹屬，?20 ℃保存，福建省神蜂科技開發(fā)有限公司；CP-M075小鼠主動脈內(nèi)皮細胞、CM-M075小鼠主動脈細胞完全培養(yǎng)基 普諾賽生命科技有限公司；A3160802胎牛血清 賽默飛世爾科技有限公司；胰酶-EDTA、PBS、D-Hanks 吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；小鼠IL-6、TNF-αELISA試劑盒 欣博盛生物科技有限公司；一抗GAPDH、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1兔 抗abcam公司；二抗 HRP-Goat anti Rabbit Elabscience公司。

SCO6WE CO2恒溫培養(yǎng)箱 SHEL LAB實驗器材有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇凈安泰公司；IX51倒置顯微鏡 OLYMPUS有限公司；DR-200Bs酶標(biāo)檢測儀 無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司；TD6低速離心機 湖南平凡科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EEP的制備 參照Xu等[9]的方法進行EEP的制備：蜂膠溶于70%乙醇（v/v），室溫浸泡2 d，60 ℃，20 min，40 kHz超聲提取3次，得到的混合液離心，棄上清，真空濃縮至溶劑蒸發(fā)，儲于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將凍有MAEC的細胞凍存管從液氮中拿出，37 ℃水浴中快速解凍后迅速轉(zhuǎn)移至裝有3 mL培養(yǎng)液的5 mL離心管中，1400 r/min離心4 min。離心后倒掉上清液，加1 mL培養(yǎng)基重懸細胞，轉(zhuǎn)移至含有3 mL培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%的CO2，37 ℃。

1.2.3 藥物配制及細胞分組 用小鼠主動脈細胞完全培養(yǎng)基溶解LPS，配制成終濃度為10 μg/mL的LPS藥液；用小鼠主動脈細胞完全培養(yǎng)基溶解EEP，根據(jù)后續(xù)實驗配制成相應(yīng)濃度的EEP藥液。使用處于生長對數(shù)期（細胞狀態(tài)好）的細胞進行實驗，濃度調(diào)整為1×105個/mL，接種于96孔板中，分為五組，空白組、LPS模型組，蜂膠低劑量組（LPS+2.5 μg/mL EEP）、中劑量組（LPS+5 μg/mL EEP）、高劑量組（LPS+10 μg/mL EEP），每組設(shè)置5個復(fù)孔?？瞻捉M給予100 μL的完全培養(yǎng)基，LPS模型組給予10 μg/mL的LPS藥液，蜂膠低、中、高劑量組給予10 μg/mL的LPS和2.5、5、10 μg/mL的EEP藥液共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37 ℃，5%的CO2。

1.2.4 細胞增殖率檢測 采用CCK-8檢測MAEC的增殖活性：按照1.2.3的方式培養(yǎng)細胞，24 h后將10 μLCCK-8溶液添加到每個孔中，并在37 ℃的5% CO2中培養(yǎng)4 h。然后，在450 nm處測量吸光度。通過以下公式計算細胞增殖率：

細胞增殖率=實驗孔的吸光度/對照孔的吸光度

1.2.5 ELISA實驗測定TNF-α、IL-6的含量 將處理后的各組細胞樣品和ELISA試劑盒取出平衡至室溫。配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后進行蛋白測定?？瞻卓字屑尤霕?biāo)準(zhǔn)品，其余孔中加入待測樣品（100 μL/孔），封板，37 ℃孵育90 min。洗板5次。依次加入生物素化抗體工作液，封孔，37 ℃孵育60 min。洗板5次。加入酶結(jié)合物工作液，封板，37 ℃避光孵育30 min。洗板，加入顯色底物37 ℃孵育15 min。加入終止液100 μL/孔，混勻后立即在3 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測量OD450值，每組三個平行。隨后將OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算得到相對含量。

1.2.6 Western Blot法 測 定ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表達水平 經(jīng)處理后的各組細胞用TBS緩沖液洗滌3次，加入總蛋白提取試劑裂解3～5 min。收集細胞于離心管冰浴30 min后4 ℃12000 g離心5 min?？偟鞍诐舛扔肂CA試劑盒測定，每組三個平行。處理好的樣品以每組上樣量10 μL開始電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓130 V，待條帶到玻璃板底部時結(jié)束電泳。隨后將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，放入適量5%脫脂奶粉中，振蕩封閉1 h。然后與一抗封閉4 ℃孵育過夜。TBST洗滌5次，每次5 min。再于二抗中孵育1 h，TBST洗滌5次，每次5 min。隨后進行發(fā)光檢測，Alpha Ease FC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。結(jié)果以與上樣對照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）[18]的光密度值的比值表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，Graph Pad Prism 8.0.2作圖，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，各組間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 EEP對MAEC細胞增殖的影響

結(jié)果如圖1所示，LPS模型組MAEC的細胞增殖率下降21%，與空白組相比差異極其顯著（P＜0.001），經(jīng)不同濃度的EEP處理后MAEC的增殖率均有上升，與LPS組相比，10 μg/mL EEP組差異顯著（P＜0.05），2.5 μg/mL 和5 μg/mL EEP差異極顯著（P＜0.01）。

圖1 EEP對LPS處理的MAEC細胞增殖率的影響（n=5）Fig.1 Effects of EEP on LPS-stimulated MACE proliferation rate (n=5)

2.2 EEP對MAEC細胞中IL-6、TNF-α的影響

結(jié)果如圖2所示，空白對照組中，IL-6、TNF-α有極少量的表達，經(jīng)LPS刺激后的MAEC中IL-6、TNF-α的表達明顯升高，其中IL-6由空白組的29.950 pg/mL升高到126.437 pg/mL升高至原來的4.22倍，TNF-α由空白 組的37.407 pg/mL升高到123.613 pg/mL，升高至原來的3.3倍，與空白對照組相比差異極其顯著（P＜0.001），EEP的處理極其顯著降低了IL-6、TNF-α的表達（P＜0.001），且呈劑量依賴性。

圖2 EEP對小鼠主動脈內(nèi)皮細胞IL-6、TNF-α表達的影響（n=3）Fig.2 Effect of EEP on the expression levels of IL-6、TNF-α in MAEC (n=3)

2.3 EEP對MAEC細胞中ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達的影響

結(jié)果如圖3所示，空白對照組的MAEC中ICAM-1、VCAM-1、MCP-1均 有 少 量 表 達，當(dāng)LPS刺激細胞后ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表達均有極其顯著的上升（P＜0.001）。經(jīng)不同濃度的EEP處理后，ICAM-1、VCAM-1、MCP-1均有明顯下降，且它們的表達量隨著EEP濃度的增加而降低，各蜂膠給藥組與LPS組均有不同程度的顯著差異（P＜0.01或P＜0.001）。

圖3 EEP對小鼠主動脈內(nèi)皮細胞ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達的影響（n=3）Fig.3 Effects of EEP on the expression levels of ICAM-1,VCAM-1 and MCP-1 in MAEC (n=3)

3 討論

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，進入血液的LPS可與單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等的細胞膜的受體相結(jié)合，通過胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激機體細胞合成和釋放多種炎癥因子，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的損傷[19]。當(dāng)內(nèi)皮細胞受到LPS、ox-LDL等刺激時，可釋放多種細胞因子刺激平滑肌細胞增殖，內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞相互作用推動血管損傷和動脈粥樣硬化的發(fā)展[20]。

腫瘤壞死因子TNF-α是一種由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生的促炎因子，在機體的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起重要的作用[21]。之前的研究構(gòu)建了LPS損傷的MAEC模型，證實了LPS可以刺激MAEC產(chǎn)生TNF-α引發(fā)炎癥，TNF-α還可以誘導(dǎo)黏附分子的表達與IL-6、IL-8等細胞因子的激活，使損傷的內(nèi)皮細胞通透性增加、脂質(zhì)更容易穿過血管膜造成脂質(zhì)堆積，形成斑塊，在炎癥反應(yīng)和AS的發(fā)展過程中起關(guān)鍵性作用[22?24]。IL-6也屬于促炎因子，它可以通過激活免疫系統(tǒng)，募集單核細胞，刺激內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞表達，抑制調(diào)節(jié)性T細胞分化和凋亡，起到促炎作用[25?26]。本研究中Elisa的檢測結(jié)果表明LPS的刺激可以大量增加MAEC中TNF-α和IL-6的釋放，經(jīng)EEP處理后MAEC中的TNF-α和IL-6的表達量與LPS模型組相比均有明顯下降。由此可見，EEP可以減少血管內(nèi)皮細胞中炎癥反因子的分泌，起到抗炎作用保護內(nèi)皮細胞免受損傷。

ICAM-1和VCAM-1是免疫球蛋白超家族中的黏附分子，在受損部位介導(dǎo)白細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附[27]。正常生理狀況下，ICAM-1在血管內(nèi)皮細胞中的表達水平極低，在細胞損傷或腫瘤壞死因子TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)的刺激下其表達水平上調(diào)，使白細胞和單核細胞不斷附著內(nèi)皮細胞于[28?29]，VCAM-1也能在炎癥刺激的內(nèi)皮細胞中過量表達，與其配體VLA-4共同作用，將炎性細胞更牢固地附著于血管內(nèi)皮細胞上[30]。之前的研究表明去除ICAM-1后，高脂喂養(yǎng)的小鼠 AS 斑塊總量與對照組相比減少了50%左右[31]，研究證明 ApoE小鼠的VCAM-1基因沉默會減少AS斑塊的體積及斑塊內(nèi)脂質(zhì)的含量[32]。兩者的高表達是內(nèi)皮細胞損傷的重要標(biāo)志，在動脈粥樣硬化的發(fā)展的過程中也起著重要作用。本實驗中LPS的刺激下ICAM-1和VCAM-1的表達顯著增加，而EEP處理能有效降低受損MAEC中ICAM-1和VCAM-1的 表 達，說 明EEP可以減少炎性細胞的黏附，從而減輕內(nèi)皮細胞的損傷。

細胞單核細胞趨化蛋白MCP-1是化學(xué)趨化因子β亞組代表，主要在炎癥細胞和內(nèi)皮細胞表達，具有募集和活化特定蛋白細胞的功能[33]。LPS對MCP-1的影響主要通過激活Pyk2活化 p38 MAPK激酶，P38MAPK激酶進而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB來驅(qū)動的[34]。受損的內(nèi)皮細胞中MCP-1與其受體結(jié)合可以引導(dǎo)單核細胞的聚集并在黏附因子的作用下黏附于損傷部位，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重[35?36]。本實驗Western Blot結(jié)果表明LPS的刺激可引起MAEC中MCP-1的表達明顯增加，經(jīng)EEP處理后可以有效降低MCP-1的表達，說明EEP有抑制炎癥處單核細胞的聚集，減輕血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)論

綜上所述，LPS的刺激可以誘導(dǎo)MAEC炎癥的發(fā)生并降低其細胞活性。EEP能降低促炎因子IL-6、TNF-α的含量，抑制黏附因子ICAM-1、VCAM-1和趨化因子MCP-1的表達，抑制炎性細胞在血管內(nèi)膜的遷移及其在病變部位的趨化作用，減少單核細胞的黏附，緩解血管內(nèi)膜的炎性損傷，發(fā)揮了良好的抗炎作用。