劉宇光,王 歡 ,王淑敏 ,劉志新,張 岳
(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),吉林長(zhǎng)春 130117;2.吉林凱萊英醫(yī)院化學(xué)有限公司,吉林敦化 133700)
偏頭痛是一種使大腦神經(jīng)系統(tǒng)高度衰弱的疾病,其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,至今尚不清楚[1],目前研究認(rèn)為偏頭痛是一種血管-神經(jīng)-遞質(zhì)調(diào)節(jié)障礙性神經(jīng)內(nèi)科疾病,發(fā)病機(jī)制以三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說為主流[2]。當(dāng)三叉神經(jīng)末梢受到內(nèi)、外刺激興奮后,隨之釋放降鈣素基因相關(guān)肽等血管活性物質(zhì),舒張血管,使血漿外滲、肥大細(xì)胞脫顆粒,神經(jīng)源性炎癥產(chǎn)生。同時(shí)三叉神經(jīng)末梢傷害性感受器將痛覺沖動(dòng)通過神經(jīng)纖維傳入腦內(nèi),引起頭痛[3?4]。在現(xiàn)階段臨床研究中發(fā)現(xiàn),偏頭痛患者發(fā)病先兆期,血小板會(huì)釋放血管收縮胺5-HT引起外周5-HT升高,導(dǎo)致血管痙攣收縮,但隨著單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT被代謝成5-HIAA后,血管反跳性擴(kuò)張,引起血管壁傷害痛覺神經(jīng)纖維興奮,導(dǎo)致偏頭痛發(fā)作[5?6]。5-HT 等血管活性物質(zhì)的變化及NE、DA 等神經(jīng)遞質(zhì)異常變化,也會(huì)促進(jìn)偏頭痛的發(fā)生。
麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜及線粒體膜上的重要組成成分,影響細(xì)胞膜的通透性、膜的完整性及細(xì)胞的活力[7],另外,麥角甾醇參與細(xì)胞膜上功能結(jié)構(gòu)域的形成,調(diào)控細(xì)胞周期、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞間信息交流、菌絲生長(zhǎng)發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)過程[8]。麥角甾醇具有真菌特異性,廣泛存在于藥用真菌冬蟲夏草、樺褐孔菌、靈芝、香菇等食藥用真菌中,是食藥用菌中存在的一種重要的活性物質(zhì)[9?12],具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降低膽固醇等多種生物活性[13?14],其對(duì)偏頭痛的藥理作用,尚未見報(bào)道。
因此,本研究從藥用真菌馬勃中分離純化得到麥角甾醇,利用硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛大鼠模型,考察麥角甾醇的鎮(zhèn)痛抗炎作用,并探索其可能的作用機(jī)制。
動(dòng)物 健康合格級(jí)雄性SD大鼠50只(160~200 g),由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001,合格證編號(hào):211002300019705,長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng),遵守倫理審查,由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行無害化處理;硝酸甘油注射液 北京益民藥業(yè)有限公司,5 mg/mL,國(guó)藥準(zhǔn)字H11020289;苯甲酸利扎曲普坦片 湖北歐力制藥有限公司,5 mg/片,國(guó)藥準(zhǔn)字H20080740,用前以蒸餾水配置成混懸液;麥角甾醇 馬勃提取物的石油醚層,經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析及制備液相色譜(石油醚-乙酸乙酯,9:1)制備得到,經(jīng)HPLC定量分析,其純度為98%;NO試劑盒 南京建成生物工程研究所,批號(hào)20170424;白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、5-HT、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所,批號(hào)20170505;RIPA 裂解液、BCA蛋白定量試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;抗體P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3、P-NF-κB p65、NF-κB p65 英國(guó)Abcam公司。
Rayto RT-6000酶標(biāo)儀 上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司;UV-2450雙光束紫外可見分光光度計(jì)、AUY220精密電子天平 島津制作所;F6/10手持式勻漿機(jī) 上海凈信科技;TGL16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)BIO-RAD 公司。
1.2.1 分組與給藥 將健康合格大鼠在溫度:(23±1)℃,相對(duì)濕度:55%±5%,12 h光暗循環(huán)條件下自由攝食、飲水,實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)則進(jìn)行,經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按體重隨機(jī)等分成5組:空白對(duì)照(生理鹽水1 mL/100 g)組,模型(生理鹽水1 mL/100 g)組,陽(yáng)性藥(苯甲酸利扎曲普坦1 mg/kg)組,麥角甾醇低劑量(15 mg/kg)組,麥角甾醇高劑量(30 mg/kg)組,每組10只,每只編號(hào)并記錄體重。每日于大致相同時(shí)間按體重分別給每鼠灌胃相應(yīng)的藥物,受試組灌胃給藥1 次/d,連續(xù)灌胃7 d[15?17]。
1.2.2 造模 末次給藥前禁食16 h,自由飲水。于最后一次給藥30 min后,除空白組外,將其余各組大鼠按給藥順序分別皮下注射硝酸甘油,給藥劑量10 mg/kg,造模30 min后,大鼠出現(xiàn)甩頭、前肢撓頭、躁動(dòng)不安、雙耳發(fā)紅、蜷臥活動(dòng)減少等現(xiàn)象,證明造模成功[18?20]。
1.2.3 樣本采集與處理 造模4 h后,按造模前后順序麻醉大鼠(腹腔注射水合氯醛0.3 g/kg),將其固定于解剖臺(tái)上,分別自腹主動(dòng)脈取血樣,收集血液后,4 ℃離心(3000 r/min,10 min);大鼠取全腦,冰上分離下丘腦,剝離附著的組織,直接稱重(天平精密度為0.1 mg),加入PBS勻漿,制成1:9的供試液,4 ℃離心(3000 r/ min,10 min),取上清分裝小管,?20 ℃保存。
1.2.4 生化指標(biāo)檢測(cè) ELISA法檢測(cè)血清中NO、IL-1β、IL-6的水平及下丘腦組織中NE、DA、5-HT的含量。
1.2.5 Western blot 檢測(cè)下丘腦組織中JAK2、STAT3、NF-κB p65蛋白含量的表達(dá) 收集下丘腦組織,提取總蛋白,使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。上樣,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,室溫條件下封閉1 h。一抗在4 ℃條件下孵育過夜,然后與二抗在室溫條件下用TBST溶液沖洗PVDF膜3次,然后以同樣的方法敷育二抗,孵育時(shí)間為1 h?;瘜W(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑顯影,圖像分析軟件掃描,分析。
采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)結(jié)果用xˉ±s表示,組間評(píng)估使用單因素方差分析(ANOVA)的Tukey多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05表明具有顯著性差異。
正常組大鼠飲食正常,狀態(tài)良好,活動(dòng)靈敏;造模30 min后,模型組大鼠出現(xiàn)甩頭、前肢撓頭、躁動(dòng)不安、雙耳發(fā)紅、蜷臥活動(dòng)減少等現(xiàn)象,經(jīng)預(yù)防性給藥后,模型大鼠的上述現(xiàn)場(chǎng)明顯減少或改善。
研究考察麥角甾醇對(duì)偏頭痛大鼠血清中NO水平的影響,與空白組比較,模型組大鼠血清中NO水平極顯著升高(P<0.001)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組和麥角甾醇給藥組的NO的水平均顯著降低(P<0.01;P<0.05),結(jié)果見下表1。NO可以使血管擴(kuò)張,同時(shí)也可以通過激活三叉神經(jīng)末梢釋放 CGRP 誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)引起偏頭痛。因此,麥角甾醇可以有效減緩血管擴(kuò)張或神經(jīng)源性炎癥引起的偏頭痛。
表1 麥角甾醇對(duì)偏頭痛大鼠血清中NO水平的影響(xˉ±s,n=10)Table 1 The effect of ergosterol on the NO level in serum of the migraine rats (xˉ±s, n=10)
由表2可知,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05,P<0.001),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與模型組比較,陽(yáng)性藥組大鼠血清中IL-1β、IL-6的水平降低(P<0.05),麥角甾醇低劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6的水平顯著降低(P<0.001,P<0.05),麥角甾醇高劑量可以極顯著降低大鼠血清中IL-1β、IL-6水平(P<0.001)。研究表明,麥角甾醇給藥組可顯著降低偏頭痛大鼠血清中上述炎癥因子的水平,減輕神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)。
表2 麥角甾醇對(duì)偏頭痛大鼠血清中IL-1β、IL-6水平的影響(xˉ±s,n=10)Table 2 The effect of ergosterol on the IL-1β and IL-6 levels in serum of the migraine rats (xˉ±s, n=10)
由表3可知,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠下丘腦中5-HT水平極顯著降低(P<0.001)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組大鼠下丘腦中5-HT水平極顯著升高(P<0.001),麥角甾醇低劑量組大鼠下丘腦中5-HT水平顯著升高(P<0.05)。5-HT 是一種與偏頭痛的發(fā)生緊密相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì),偏頭痛發(fā)作前,血漿中5-HT迅速升高,偏頭痛發(fā)作時(shí),血液中 5-HT 被迅速代謝為 5-HIAA,大量減少[21],因此麥角甾醇可提高偏頭痛大鼠發(fā)作時(shí)血漿中5-HT的水平。
表3 麥角甾醇對(duì)偏頭痛大鼠下丘腦中5-HT水平的影響(xˉ±s,n=10)Table 3 The effect of ergosterol on the 5-HT level in brain tissue of the migraine rats (xˉ±s, n=10)
由表4可知,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠下丘腦中NE、DA水平顯著降低(P<0.05,P<0.001)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組大鼠下丘腦中NE和DA水平顯著升高(P<0.05),麥角甾醇低劑量組大鼠下丘腦中NE、DA水平顯著升高(P<0.001,P<0.05),麥角甾醇高劑量可以顯著升高造模后大鼠下丘腦中NE、DA水平(P<0.001,P<0.05)。腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA的代謝紊亂會(huì)促進(jìn)偏頭痛的發(fā)生和發(fā)展[22],結(jié)果表明麥角甾醇可有效調(diào)節(jié)下丘腦中NE和DA的水平。
表4 麥角甾醇對(duì)偏頭痛大鼠下丘腦中NE、DA水平的影響(xˉ±s,n=10)Table 4 The effect of ergosterol on NE and DA levels in brain tissue of the migraine rats (xˉ±s, n=10)
如圖1所示,與空白組相比,模型組P-JAK2、PSTAT3、P-NF-κB p65蛋白含量顯著升高(P<0.001)。與模型組比,陽(yáng)性藥和麥角甾醇各給藥組均可顯著抑制下丘腦組織中P-JAK2、P-STAT3、P-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平(P<0.001)。JAK2/STAT3 信號(hào)通路是多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子在細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)的途徑,同時(shí),JAK2/STAT3 通路的激活也促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生[23]。本研究結(jié)果表明,麥角甾醇可能通過抑制 JAK2/STAT3/NF-κB信號(hào)通路,減少IL-1β、IL-6等炎癥因子,減輕由炎癥所致的頭痛。
圖1 麥角甾醇對(duì)下丘腦組織中P-JAK2、T-JAK2、P-STAT3、T-STAT3、P-NF-κB p65、T-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響Fig.1 The effect of ergosterol on P-JAK2、T-JAK2、P-STAT3、T-STAT3、P-NF-κB p65、T-NF-κB p65 expression in brain tissue of the migraine rats
本次實(shí)驗(yàn)中采用硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛大鼠模型,其行為表現(xiàn)與發(fā)病機(jī)制同臨床患者偏頭痛發(fā)作時(shí)的癥狀表現(xiàn)和病理變化具備一定程度的相似性,可以很好地仿效偏頭痛發(fā)作的病理生理過程。當(dāng)硝酸甘油吸收入血后,經(jīng)代謝、分解釋放NO,而NO兼有內(nèi)源性擴(kuò)張因子和神經(jīng)遞質(zhì)的雙重作用,所以通過擴(kuò)張顱內(nèi)血管、激發(fā)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)以及興奮傷害覺神經(jīng)纖維從而誘發(fā)偏頭痛[24]。
本試驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)硝酸甘油誘導(dǎo)后,血清NO水平和炎癥因子IL-1β、IL-6水平均升高,證明大鼠偏頭痛模型建立成功。說明硝酸甘油既可以刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的NO、IL-1β、IL-6,引起炎癥反應(yīng),進(jìn)而引發(fā)頭痛,又說明硝酸甘油能夠直接刺激大腦皮層及血管擴(kuò)張,使頭痛產(chǎn)生。而造模后的偏頭痛大鼠經(jīng)不同劑量麥角甾醇治療后,與模型組比較,血清5-HT水平升高(P<0.05),血清NO水平(P<0.05)、炎癥因子IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05;P<0.001),同時(shí)下丘腦中DA和NE水平也明顯升高(P<0.001;P<0.05),并且麥角甾醇促進(jìn)了p-JAK2、p-STAT3和P- NF-κBp65的表達(dá),這說明麥角甾醇不僅能調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)代謝平衡,降低炎癥因子水平,還可以減弱疼痛信號(hào)傳遞。
NF-κB是一種多亞基轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)多種與炎癥相關(guān)的靶基因[25?26]。同時(shí)STAT蛋白也是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,STAT信號(hào)通路通常被JAKs激活,調(diào)控著細(xì)胞因子的基因表達(dá)。研究結(jié)果表明麥角甾醇可以抑制NF-κBp65易位至其誘導(dǎo)的細(xì)胞核激活各種炎癥相關(guān)基因,減弱JAK/STAT信號(hào)通路的激活,減輕由炎癥所致的頭痛。
綜上所述真菌來源的麥角甾醇可能通過改善顱內(nèi)外血管舒縮功能,減輕神經(jīng)源性炎癥反應(yīng),抑制傷害痛覺中樞傳遞來發(fā)揮治療偏頭痛的作用,其作用機(jī)制可能是抑制下丘腦中NF-κB和JAK2/STAT3 信號(hào)通路,減輕炎癥及疼痛反應(yīng),從而達(dá)到緩解或治療偏頭痛的目的。