劉宇光，王 歡 ，王淑敏 ，劉志新，張 岳

（1.長春中醫(yī)藥大學，吉林長春 130117；2.吉林凱萊英醫(yī)院化學有限公司，吉林敦化 133700）

偏頭痛是一種使大腦神經(jīng)系統(tǒng)高度衰弱的疾病，其發(fā)病機制十分復雜，至今尚不清楚[1]，目前研究認為偏頭痛是一種血管-神經(jīng)-遞質(zhì)調(diào)節(jié)障礙性神經(jīng)內(nèi)科疾病，發(fā)病機制以三叉神經(jīng)血管反射學說為主流[2]。當三叉神經(jīng)末梢受到內(nèi)、外刺激興奮后，隨之釋放降鈣素基因相關肽等血管活性物質(zhì)，舒張血管，使血漿外滲、肥大細胞脫顆粒，神經(jīng)源性炎癥產(chǎn)生。同時三叉神經(jīng)末梢傷害性感受器將痛覺沖動通過神經(jīng)纖維傳入腦內(nèi)，引起頭痛[3?4]。在現(xiàn)階段臨床研究中發(fā)現(xiàn)，偏頭痛患者發(fā)病先兆期，血小板會釋放血管收縮胺5-HT引起外周5-HT升高，導致血管痙攣收縮，但隨著單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT被代謝成5-HIAA后，血管反跳性擴張，引起血管壁傷害痛覺神經(jīng)纖維興奮，導致偏頭痛發(fā)作[5?6]。5-HT 等血管活性物質(zhì)的變化及NE、DA 等神經(jīng)遞質(zhì)異常變化，也會促進偏頭痛的發(fā)生。

麥角甾醇是真菌細胞膜及線粒體膜上的重要組成成分，影響細胞膜的通透性、膜的完整性及細胞的活力[7]，另外，麥角甾醇參與細胞膜上功能結構域的形成，調(diào)控細胞周期、物質(zhì)運輸、細胞間信息交流、菌絲生長發(fā)育等多個生物學過程[8]。麥角甾醇具有真菌特異性，廣泛存在于藥用真菌冬蟲夏草、樺褐孔菌、靈芝、香菇等食藥用真菌中，是食藥用菌中存在的一種重要的活性物質(zhì)[9?12]，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降低膽固醇等多種生物活性[13?14],其對偏頭痛的藥理作用，尚未見報道。

因此，本研究從藥用真菌馬勃中分離純化得到麥角甾醇，利用硝酸甘油誘導的偏頭痛大鼠模型，考察麥角甾醇的鎮(zhèn)痛抗炎作用，并探索其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動物 健康合格級雄性SD大鼠50只（160～200 g），由遼寧長生生物技術有限公司提供，許可證號SCXK（遼）2015-0001，合格證編號：211002300019705，長春中醫(yī)藥大學動物中心飼養(yǎng)，遵守倫理審查，由動物實驗中心進行無害化處理；硝酸甘油注射液 北京益民藥業(yè)有限公司，5 mg/mL，國藥準字H11020289；苯甲酸利扎曲普坦片 湖北歐力制藥有限公司，5 mg/片，國藥準字H20080740，用前以蒸餾水配置成混懸液；麥角甾醇 馬勃提取物的石油醚層，經(jīng)反復硅膠柱層析及制備液相色譜（石油醚-乙酸乙酯，9:1）制備得到，經(jīng)HPLC定量分析，其純度為98%；NO試劑盒 南京建成生物工程研究所，批號20170424；白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、5-HT、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所，批號20170505；RIPA 裂解液、BCA蛋白定量試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；抗體P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3、P-NF-κB p65、NF-κB p65 英國Abcam公司。

Rayto RT-6000酶標儀 上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司；UV-2450雙光束紫外可見分光光度計、AUY220精密電子天平 島津制作所；F6/10手持式勻漿機 上海凈信科技；TGL16M 臺式高速冷凍離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)美國BIO-RAD 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 將健康合格大鼠在溫度：（23±1）℃，相對濕度：55%±5%，12 h光暗循環(huán)條件下自由攝食、飲水，實驗嚴格按照實驗動物倫理學規(guī)則進行，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準。適應性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機等分成5組：空白對照（生理鹽水1 mL/100 g）組，模型（生理鹽水1 mL/100 g）組，陽性藥（苯甲酸利扎曲普坦1 mg/kg）組，麥角甾醇低劑量（15 mg/kg）組，麥角甾醇高劑量（30 mg/kg）組，每組10只，每只編號并記錄體重。每日于大致相同時間按體重分別給每鼠灌胃相應的藥物，受試組灌胃給藥1 次/d，連續(xù)灌胃7 d[15?17]。

1.2.2 造模 末次給藥前禁食16 h，自由飲水。于最后一次給藥30 min后，除空白組外，將其余各組大鼠按給藥順序分別皮下注射硝酸甘油，給藥劑量10 mg/kg，造模30 min后，大鼠出現(xiàn)甩頭、前肢撓頭、躁動不安、雙耳發(fā)紅、蜷臥活動減少等現(xiàn)象，證明造模成功[18?20]。

1.2.3 樣本采集與處理 造模4 h后，按造模前后順序麻醉大鼠（腹腔注射水合氯醛0.3 g/kg），將其固定于解剖臺上，分別自腹主動脈取血樣，收集血液后，4 ℃離心（3000 r/min，10 min）；大鼠取全腦，冰上分離下丘腦，剝離附著的組織，直接稱重（天平精密度為0.1 mg），加入PBS勻漿，制成1:9的供試液，4 ℃離心（3000 r/ min，10 min），取上清分裝小管，?20 ℃保存。

1.2.4 生化指標檢測 ELISA法檢測血清中NO、IL-1β、IL-6的水平及下丘腦組織中NE、DA、5-HT的含量。

1.2.5 Western blot 檢測下丘腦組織中JAK2、STAT3、NF-κB p65蛋白含量的表達 收集下丘腦組織，提取總蛋白，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。上樣，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移到PVDF膜上，室溫條件下封閉1 h。一抗在4 ℃條件下孵育過夜，然后與二抗在室溫條件下用TBST溶液沖洗PVDF膜3次，然后以同樣的方法敷育二抗，孵育時間為1 h?；瘜W發(fā)光法（ECL）發(fā)光試劑顯影，圖像分析軟件掃描，分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)結果用xˉ±s表示，組間評估使用單因素方差分析（ANOVA）的Tukey多重比較檢驗進行分析。P＜0.05表明具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 對偏頭痛大鼠行為等影響

正常組大鼠飲食正常，狀態(tài)良好，活動靈敏；造模30 min后，模型組大鼠出現(xiàn)甩頭、前肢撓頭、躁動不安、雙耳發(fā)紅、蜷臥活動減少等現(xiàn)象，經(jīng)預防性給藥后，模型大鼠的上述現(xiàn)場明顯減少或改善。

2.2 麥角甾醇對實驗性偏頭痛大鼠血清中NO、IL-1β、IL-6水平的影響

研究考察麥角甾醇對偏頭痛大鼠血清中NO水平的影響，與空白組比較，模型組大鼠血清中NO水平極顯著升高（P＜0.001）。與模型組比較，陽性藥組和麥角甾醇給藥組的NO的水平均顯著降低（P＜0.01；P＜0.05），結果見下表1。NO可以使血管擴張，同時也可以通過激活三叉神經(jīng)末梢釋放 CGRP 誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥反應引起偏頭痛。因此，麥角甾醇可以有效減緩血管擴張或神經(jīng)源性炎癥引起的偏頭痛。

表1 麥角甾醇對偏頭痛大鼠血清中NO水平的影響（xˉ±s，n=10）Table 1 The effect of ergosterol on the NO level in serum of the migraine rats (xˉ±s, n=10)

由表2可知，與空白對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.001），具有統(tǒng)計學差異。與模型組比較，陽性藥組大鼠血清中IL-1β、IL-6的水平降低（P＜0.05），麥角甾醇低劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6的水平顯著降低（P＜0.001，P＜0.05），麥角甾醇高劑量可以極顯著降低大鼠血清中IL-1β、IL-6水平（P＜0.001）。研究表明，麥角甾醇給藥組可顯著降低偏頭痛大鼠血清中上述炎癥因子的水平，減輕神經(jīng)源性炎癥反應。

表2 麥角甾醇對偏頭痛大鼠血清中IL-1β、IL-6水平的影響（xˉ±s，n=10）Table 2 The effect of ergosterol on the IL-1β and IL-6 levels in serum of the migraine rats (xˉ±s, n=10)

2.3 麥角甾醇對實驗性偏頭痛大鼠下丘腦中5-HT、NE、DA水平的影響

由表3可知，與空白對照組比較，模型組大鼠下丘腦中5-HT水平極顯著降低（P＜0.001）。與模型組比較，陽性藥組大鼠下丘腦中5-HT水平極顯著升高（P＜0.001），麥角甾醇低劑量組大鼠下丘腦中5-HT水平顯著升高（P＜0.05）。5-HT 是一種與偏頭痛的發(fā)生緊密相關的神經(jīng)遞質(zhì)，偏頭痛發(fā)作前，血漿中5-HT迅速升高，偏頭痛發(fā)作時，血液中 5-HT 被迅速代謝為 5-HIAA，大量減少[21]，因此麥角甾醇可提高偏頭痛大鼠發(fā)作時血漿中5-HT的水平。

表3 麥角甾醇對偏頭痛大鼠下丘腦中5-HT水平的影響（xˉ±s，n=10）Table 3 The effect of ergosterol on the 5-HT level in brain tissue of the migraine rats (xˉ±s, n=10)

由表4可知，與空白對照組比較，模型組大鼠下丘腦中NE、DA水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.001）。與模型組比較，陽性藥組大鼠下丘腦中NE和DA水平顯著升高（P＜0.05），麥角甾醇低劑量組大鼠下丘腦中NE、DA水平顯著升高（P＜0.001，P＜0.05），麥角甾醇高劑量可以顯著升高造模后大鼠下丘腦中NE、DA水平（P＜0.001，P＜0.05）。腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA的代謝紊亂會促進偏頭痛的發(fā)生和發(fā)展[22]，結果表明麥角甾醇可有效調(diào)節(jié)下丘腦中NE和DA的水平。

表4 麥角甾醇對偏頭痛大鼠下丘腦中NE、DA水平的影響（xˉ±s，n=10）Table 4 The effect of ergosterol on NE and DA levels in brain tissue of the migraine rats (xˉ±s, n=10)

2.4 麥角甾醇對實驗性偏頭痛大鼠下丘腦中PJAK2、T-JAK2、P-STAT3、T-STAT3、P-NF-κB p65、T-NF-κB p65蛋白表達的影響

如圖1所示，與空白組相比，模型組P-JAK2、PSTAT3、P-NF-κB p65蛋白含量顯著升高（P＜0.001）。與模型組比，陽性藥和麥角甾醇各給藥組均可顯著抑制下丘腦組織中P-JAK2、P-STAT3、P-NF-κB p65蛋白表達水平（P＜0.001）。JAK2/STAT3 信號通路是多種細胞因子和生長因子在細胞內(nèi)傳遞信號的途徑，同時，JAK2/STAT3 通路的激活也促進炎癥的產(chǎn)生[23]。本研究結果表明，麥角甾醇可能通過抑制 JAK2/STAT3/NF-κB信號通路，減少IL-1β、IL-6等炎癥因子，減輕由炎癥所致的頭痛。

圖1 麥角甾醇對下丘腦組織中P-JAK2、T-JAK2、P-STAT3、T-STAT3、P-NF-κB p65、T-NF-κB p65蛋白表達的影響Fig.1 The effect of ergosterol on P-JAK2、T-JAK2、P-STAT3、T-STAT3、P-NF-κB p65、T-NF-κB p65 expression in brain tissue of the migraine rats

3 結論

本次實驗中采用硝酸甘油誘導的偏頭痛大鼠模型，其行為表現(xiàn)與發(fā)病機制同臨床患者偏頭痛發(fā)作時的癥狀表現(xiàn)和病理變化具備一定程度的相似性，可以很好地仿效偏頭痛發(fā)作的病理生理過程。當硝酸甘油吸收入血后，經(jīng)代謝、分解釋放NO，而NO兼有內(nèi)源性擴張因子和神經(jīng)遞質(zhì)的雙重作用，所以通過擴張顱內(nèi)血管、激發(fā)神經(jīng)源性炎癥反應以及興奮傷害覺神經(jīng)纖維從而誘發(fā)偏頭痛[24]。

本試驗結果表明，實驗組大鼠經(jīng)硝酸甘油誘導后，血清NO水平和炎癥因子IL-1β、IL-6水平均升高，證明大鼠偏頭痛模型建立成功。說明硝酸甘油既可以刺激機體產(chǎn)生大量的NO、IL-1β、IL-6，引起炎癥反應，進而引發(fā)頭痛，又說明硝酸甘油能夠直接刺激大腦皮層及血管擴張，使頭痛產(chǎn)生。而造模后的偏頭痛大鼠經(jīng)不同劑量麥角甾醇治療后，與模型組比較，血清5-HT水平升高（P＜0.05），血清NO水平（P＜0.05）、炎癥因子IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05；P＜0.001），同時下丘腦中DA和NE水平也明顯升高（P＜0.001；P＜0.05），并且麥角甾醇促進了p-JAK2、p-STAT3和P- NF-κBp65的表達，這說明麥角甾醇不僅能調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)代謝平衡，降低炎癥因子水平，還可以減弱疼痛信號傳遞。

NF-κB是一種多亞基轉錄因子，可調(diào)節(jié)多種與炎癥相關的靶基因[25?26]。同時STAT蛋白也是炎癥反應的關鍵轉錄因子，STAT信號通路通常被JAKs激活，調(diào)控著細胞因子的基因表達。研究結果表明麥角甾醇可以抑制NF-κBp65易位至其誘導的細胞核激活各種炎癥相關基因，減弱JAK/STAT信號通路的激活，減輕由炎癥所致的頭痛。

綜上所述真菌來源的麥角甾醇可能通過改善顱內(nèi)外血管舒縮功能，減輕神經(jīng)源性炎癥反應，抑制傷害痛覺中樞傳遞來發(fā)揮治療偏頭痛的作用，其作用機制可能是抑制下丘腦中NF-κB和JAK2/STAT3 信號通路，減輕炎癥及疼痛反應，從而達到緩解或治療偏頭痛的目的。