程曉曉，張邈馨，王 嫚，耿旭芳，胡京藝，王 振，高佳萌，王亞文，李 麗，趙 丁

（河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北石家莊 050017）

肥胖（obesity）是體內(nèi)脂肪積聚過(guò)多而致體重超常的一種慢性疾病[1]。隨著人們飲食習(xí)慣及生活方式的改變，肥胖發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2]，并會(huì)引起糖尿病、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種代謝性疾病，危害人類健康[3]。目前已上市減肥藥多存在導(dǎo)致惡心、嘔吐、便秘、降低血糖等副作用，因此，開(kāi)發(fā)安全性高、毒副作用低的減肥藥物及保健產(chǎn)品是很有必要的?！八幨惩础鳖愔兴幨且活惣瓤勺魉幱糜挚墒秤玫闹兴帲骖櫚踩?、營(yíng)養(yǎng)、保健和治療的功能。因其安全性高，副作用小，在世界范圍內(nèi)廣受歡迎，亦對(duì)減肥藥物及保健產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有重要意義。

苦瓜（bitter melon）是葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜（Momordica charantia）的未成熟果實(shí), 廣泛種植于中國(guó)及東南亞國(guó)家，是一味傳統(tǒng)的藥食同源類中藥?？喙虾锌喙显碥?、苦瓜多糖、苦瓜蛋白、多肽和黃酮等多種生物活性成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)、保健及藥用價(jià)值，可降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及抗病毒等，對(duì)糖尿病、心臟病等均有一定治療作用[4?6]。桑葉（mulberry leaf）是?？浦参锷?shù)（Mori folium）的干燥葉，內(nèi)含多種維生素、微量元素、氨基酸、黃酮及生物堿，亦具有降血糖、降血脂、減肥等功效[7?9]。研究證明，苦瓜、桑葉合用可有效調(diào)控正常小鼠及糖尿病小鼠的血糖血脂水平[10?13]，且未見(jiàn)毒副作用[14]，顯示出較好的安全性。苦瓜、桑葉等藥食同源類中藥，安全有效，其共同作用將更有利于脂糖代謝紊亂相關(guān)疾病的預(yù)防[15?16]。然而，雖然苦瓜、桑葉在調(diào)節(jié)脂糖代謝中具有重要作用，但兩者合用治療肥胖的相關(guān)研究，目前尚未見(jiàn)報(bào)道，有待進(jìn)一步探索。

基于此，本研究將苦瓜、桑葉合用，聯(lián)合其他幾味相同功效藥食同源類中藥（葛根、金銀花等[17?19]），共同制成苦瓜桑葉復(fù)合顆粒，以此為研究對(duì)象，采用高脂飲食引起的肥胖大鼠模型，進(jìn)一步考察苦瓜桑葉復(fù)合顆粒對(duì)肥胖大鼠脂糖代謝及腸粘膜屏障異常的改善作用。通過(guò)體重、血糖血脂水平、肝腸組織病理切片及腸粘膜蛋白表達(dá)等多方面檢測(cè)，探討苦瓜桑葉復(fù)合顆粒改善肥胖的作用機(jī)制，為苦瓜、桑葉合用制劑的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持及方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級(jí)SD大鼠 雄性，體重200～250 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（冀）2018-004；基礎(chǔ)飼料、高脂飼料 河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；RIPA裂解液、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride）、5×蛋白上樣緩沖液（還原型）、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、PBS、BSA、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、吐溫?20（Tween-20）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗、Anti-Occludin抗體、Anti-GAPDH抗體 武漢賽維爾生物科技有限公司；苦瓜桑葉復(fù)合顆粒 河北康平健康產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司。

PL-203電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；JY92-IIn超聲細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；KH-III全自動(dòng)研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司；Epoch全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；Chemray 240全自動(dòng)生化分析儀 深圳雷杜生命科技股份有限公司；RM2135型切片機(jī) 德國(guó)LEICA公司；CX31型顯微鏡 日本Olympus公司；Bio-Rad小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（包括垂直電泳槽、轉(zhuǎn)印芯及基礎(chǔ)電源）、ChemiDocTM XRS+凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦瓜桑葉復(fù)合顆粒的制備 苦瓜桑葉復(fù)合顆粒由河北康平健康產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司制備，配方包括苦瓜、桑葉、百合、山藥、葛根、山楂、甜葉菊（質(zhì)量比為250:150:24:50:60:40:7）。制備步驟如下：稱取原料混合，以料液比1:10加入蒸餾水，加熱回流提取1.5 h，過(guò)濾得濾液，藥渣加8倍量蒸餾水加熱回流提取45 min，過(guò)濾，合并兩次濾液，得總提取液。總提取液減壓濃縮至相對(duì)密度1.09～1.1，加原料量10%的麥芽糊精，噴霧干燥，收集噴霧干燥粉，即得本實(shí)驗(yàn)用苦瓜桑葉復(fù)合顆粒。

1.2.2 大鼠肥胖模型建立 32只SD雄性大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、高脂肥胖模型組、苦瓜桑葉復(fù)合顆粒低劑量組和苦瓜桑葉復(fù)合顆粒高劑量組，每組8只?？瞻讓?duì)照組（Control）給予基礎(chǔ)飼料，高脂肥胖模型組（Model）及苦瓜桑葉復(fù)合顆粒低、高劑量組（Low dosage、High dosage）均喂養(yǎng)高脂飼料（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心監(jiān)制；主要成分質(zhì)量比：豬油11.0%，蛋黃8.0%，膽固醇1.5%及基礎(chǔ)飼料79.5%）。苦瓜桑葉復(fù)合顆粒低、高劑量組在給予高脂飼料的同時(shí)，按照大鼠體重比，每日分別灌胃0.5及1 g/kg苦瓜桑葉復(fù)合顆粒，給藥8周；空白對(duì)照組及高脂肥胖模型組以相同方法灌胃等體積生理鹽水。飼養(yǎng)溫度20～24 ℃，12 h 明暗輪換。第8周結(jié)束后，獲取實(shí)驗(yàn)材料用于后續(xù)分析。

1.2.3 大鼠體重監(jiān)測(cè) 每周記錄大鼠體重，自由攝食、飲水。

1.2.4 血糖血脂檢測(cè) 第8周結(jié)束后，所有大鼠禁食不禁水過(guò)夜，10%（m/v）水合氯醛腹腔注射（100 μL/10 g）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫放置30 min后，3000 r/min離心10 min，收集血清，于?80 ℃保存?zhèn)溆?；血糖（葡萄糖、糖化血清蛋白）、血脂（總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇）等生化指?biāo)采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定[20]。

1.2.5 組織形態(tài)學(xué)觀察 取各組大鼠肝臟及結(jié)腸組織，經(jīng)過(guò)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟制成蠟塊。使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)制作大鼠肝臟組織切片及結(jié)腸組織切片，對(duì)其進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE染色），并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察大鼠肝臟及結(jié)腸組織形態(tài)[21?22]。

1.2.6 大鼠結(jié)腸粘膜緊密連接蛋白Occludin檢測(cè)

1.2.6.1 蛋白樣本制備 取結(jié)腸樣本加入RIPA裂解液（含1% PMSF），使用裂解儀（3 mm×3 mm鋼珠，60 Hz，120 s）進(jìn)行裂解，冰浴孵育30 min，4 °C，12000 r/min離心10 min，取上清，加入5×蛋白上樣緩沖液（還原型），體積為蛋白樣品的1/4，渦旋后100 ℃水浴5 min，降至室溫后置于?20 ℃保存。

1.2.6.2 Western Blot免疫印跡檢測(cè) 配制10%SDS分離膠，蛋白上樣量為20～35 μg，進(jìn)行SDSPAGE電泳，60～80 V。電泳結(jié)束后，將含目標(biāo)蛋白的SDS膠條帶利用濕轉(zhuǎn)法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至已經(jīng)甲醇活化的0.22 μm PVDF膜上，電壓為110 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為100 min。PVDF膜轉(zhuǎn)移于5% BSA封閉液中室溫振蕩封閉2 h。分別加入Anti-GAPDH抗體（1:4000）及Anti-Occludin抗 體（1:3000）室 溫 振蕩孵育2 h后，4 ℃過(guò)夜孵育。TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗兔抗室溫孵育2 h，按上述方法用TBST洗滌。加ECL顯色液利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

1.2.6.3 半定量分析 采用Image Lab分析軟件對(duì)目標(biāo)蛋白條帶進(jìn)行采集分析，并通過(guò)灰度值進(jìn)行半定量計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示。采用ttest進(jìn)行各組間差異分析，以P＜0.05為差異顯著。與肥胖模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜桑葉復(fù)合顆粒對(duì)肥胖大鼠體重的影響

由表1可知，隨著時(shí)間的推移，各組大鼠體重均呈增加狀態(tài)。在第6周后，肥胖模型組大鼠的體重極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01）；苦瓜桑葉復(fù)合顆粒低劑量組大鼠在第4周后，體重顯著低于肥胖模型組（P＜0.05）；苦瓜桑葉復(fù)合顆粒高劑量組大鼠在第5周后，體重顯著低于肥胖模型組（P＜0.05）。結(jié)果顯示，苦瓜桑葉復(fù)合顆粒低劑量組及高劑量組，均可將高脂飲食引起的體重增加恢復(fù)至正常水平，并與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。綜上結(jié)果表明，苦瓜桑葉復(fù)合顆?？捎行Э刂品逝执笫蟮捏w重增高現(xiàn)象，提示其對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠的糖脂代謝紊亂現(xiàn)象有潛在調(diào)節(jié)能力。

表1 桑葉苦瓜復(fù)合顆粒對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠體重的影響（n=8,g）Table 1 Effects of the composite granules of bitter melon and mulberry leaf （CGBM） on the body weight of high-fat diet-induced obese rats （n=8,g）

2.2 苦瓜桑葉復(fù)合顆粒對(duì)肥胖大鼠血糖及血脂的影響

對(duì)各組大鼠的血糖及血脂進(jìn)行檢測(cè)，葡萄糖（GLU）、糖化血清蛋白（GSP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 苦瓜桑葉復(fù)合顆粒對(duì)肥胖大鼠血清葡萄糖（A）、糖化血清蛋白（B）、總膽固醇（C）、甘油三酯（D）、高密度脂蛋白膽固醇（E）及低密度脂蛋白膽固醇（F）的影響Fig.1 Effects of CGBM on the serum GLU （A）, GSP （B）, TC （C）, TG （D）, HDL-C （E） and LDL-C （F） in high-fat diet-induced obese rats

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組大鼠相比，肥胖模型組大鼠血清中GLU和GSP含量顯著升高（P＜0.05）。給予苦瓜桑葉復(fù)合顆粒后，低劑量組及高劑量組大鼠血清GLU和GSP水平顯著降低（P＜0.05），并可恢復(fù)至正常值。

與空白對(duì)照組大鼠相比，肥胖模型組大鼠血清HDL-C含量顯著升高（P＜0.05）。給予苦瓜桑葉復(fù)合顆粒后，肥胖大鼠血清HDL-C含量有所降低，并可逐步恢復(fù)至正常水平。與空白對(duì)照組大鼠相比，肥胖模型組大鼠血清LDL-C含量顯著降低（P＜0.05）。給予苦瓜桑葉復(fù)合顆粒后，肥胖大鼠血清LDL-C含量回升，高劑量下大鼠血清LDL-C水平可恢復(fù)至正常值。血清TC、TG含量在各組大鼠間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。前期研究指出，苦瓜可下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)的脂肪堆積，進(jìn)而調(diào)控并改善肥胖引起的糖脂代謝異?，F(xiàn)象[23?24]。其中PPAR-γ是一種脂肪細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)控因子，在脂肪細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)[25]，而苦瓜桑葉復(fù)合顆粒改善肥胖糖脂代謝紊亂現(xiàn)象的機(jī)制亦可能與調(diào)控PPAR-γ表達(dá)有關(guān)，但有待進(jìn)一步研究。

2.3 苦瓜桑葉復(fù)合顆粒對(duì)肥胖大鼠肝臟組織形態(tài)的影響

肝臟作為機(jī)體的代謝器官，在脂肪的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)等多方面具有重要調(diào)節(jié)作用[26]。將各組大鼠肝臟組織切片進(jìn)行HE染色，結(jié)果如圖2所示。肥胖模型組大鼠肝臟組織脂肪滴增多，空泡化加重。給予苦瓜桑葉復(fù)合顆粒后，肝臟組織空泡化減輕，脂肪滴減少，肝臟脂肪變性有所改善。高脂飲食易引起脂質(zhì)代謝動(dòng)態(tài)失衡，導(dǎo)致肝臟攝取游離脂肪酸增加或甘油三酯運(yùn)轉(zhuǎn)障礙，最終導(dǎo)致甘油三酯堆積在肝臟細(xì)胞中，發(fā)生肝臟脂肪變性[27]?？喙仙Ｈ~復(fù)合顆?？蓽p少高脂飲食引起的肝臟脂肪變性現(xiàn)象，再次提示其對(duì)調(diào)節(jié)肥胖大鼠脂質(zhì)代謝的重要作用。

圖2 苦瓜桑葉復(fù)合顆粒對(duì)大鼠肝臟組織形態(tài)的影響（HE染色，200×）Fig.2 Effects of CGBM on the pathological changes of liver tissues in high-fat diet-induced obese rats （H&E staining, 200×）

2.4 苦瓜桑葉復(fù)合顆粒對(duì)肥胖大鼠結(jié)腸粘膜組織形態(tài)的影響

各組大鼠結(jié)腸粘膜組織切片HE染色結(jié)果（圖3）顯示，空白對(duì)照組結(jié)腸粘膜層腺體排列整齊、直立、緊貼粘膜肌層。肥胖模型組結(jié)腸粘膜腺體形狀萎縮，數(shù)量減少或消失，腺體間距增大，腺體底部與粘膜下的肌層距離增加?？喙仙Ｈ~復(fù)合顆粒給藥組的腺體形狀有所恢復(fù)，與空白對(duì)照組的腺體相似。以上結(jié)果表明，高脂飲食引發(fā)的肥胖可造成大鼠結(jié)腸粘膜形態(tài)發(fā)生改變，而苦瓜桑葉復(fù)合顆粒可改善肥胖大鼠的腸粘膜腺體形態(tài)、數(shù)量及肌層狀態(tài)異常，具有較好修復(fù)效果。前期研究表明，肥胖可引發(fā)人類腸道菌群失調(diào)，破壞腸道粘膜屏障，進(jìn)而引發(fā)炎癥[28?29]。本研究中苦瓜桑葉復(fù)合顆粒對(duì)肥胖引起的腸道粘膜損傷具有保護(hù)作用，提示其可能對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能具有一定調(diào)節(jié)作用。

2.5 苦瓜桑葉復(fù)合顆粒對(duì)肥胖大鼠結(jié)腸粘膜緊密連接蛋白Occludin的影響

通過(guò)免疫印跡法（Western blot）對(duì)各組大鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)進(jìn)行半定量檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。肥胖模型組大鼠結(jié)腸粘膜Occludin蛋白表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），而苦瓜桑葉復(fù)合顆粒低劑量組及高劑量組均可顯著提高大鼠結(jié)腸粘膜Occludin蛋白的表達(dá)量（P＜0.05），8周后恢復(fù)至正常水平。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)苦瓜粉可明顯降低肥胖大鼠結(jié)腸粘膜脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，并顯著上調(diào)結(jié)腸緊密連接蛋白Occludin的mRNA水平[30]，另外桑葉主要成分桑黃酮G亦可緩解LPS誘導(dǎo)的體外腸道上皮屏障損傷[31]。以上結(jié)果提示苦瓜桑葉復(fù)合顆?？梢欢ǔ潭壬匣謴?fù)肥胖引起的粘膜屏障損傷，對(duì)結(jié)腸功能重塑及脂糖代謝有重要調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)論

本研究采取高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型，探討苦瓜桑葉復(fù)合顆粒對(duì)肥胖大鼠脂糖代謝及腸粘膜屏障異常的影響。通過(guò)8周的干預(yù)治療，苦瓜桑葉復(fù)合顆粒可有效降低肥胖大鼠體重，改善肥胖引起的血糖血脂水平失衡現(xiàn)象，調(diào)控肥胖大鼠血清GLU、GSP、TC、TG、HDL-C及LDL-C 含量趨向正常。苦瓜桑葉復(fù)合顆粒亦可減少高脂飲食引起的肝臟脂肪堆積現(xiàn)象，減少肝臟脂滴產(chǎn)生。肥胖大鼠結(jié)腸粘膜完整性受到破壞，腺體損傷伴隨著緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)減少，最終導(dǎo)致腸道屏障作用受損。苦瓜桑葉復(fù)合顆?？筛纳品逝忠鸬哪c屏障異?，F(xiàn)象，修復(fù)腸粘膜腺體、肌層及緊密連接，具有較好腸道保護(hù)作用。

苦瓜桑葉等藥食同源中藥在食品和制藥領(lǐng)域的應(yīng)用仍處于起步階段，其益處遠(yuǎn)沒(méi)有得到充分利用。在確保安全性的前提下，苦瓜、桑葉具有降血糖，降血脂等作用，在開(kāi)發(fā)抗肥胖藥物及保健產(chǎn)品方面具有廣闊前景[32]。本研究闡述了苦瓜桑葉復(fù)合顆粒對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠疾病狀態(tài)的改善作用，從脂糖代謝及腸粘膜屏障等方面探討了其作用機(jī)制，可為后續(xù)苦瓜桑葉復(fù)合顆粒相關(guān)制劑的開(kāi)發(fā)及機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支持及方法參考。