■孔祎頔 徐 晴 李 民 尹 壯 吳雪芹 趙倩茹 竇曙光 王桂芹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130118）

烏鱧（Channa argus）屬鱸形目、鱧科、鱧屬，是一類肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富的經(jīng)濟(jì)型魚類，在我國大部分地區(qū)均有養(yǎng)殖[1-4]。近年來，由于集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，烏鱧在養(yǎng)殖過程中易患各類疾病，嚴(yán)重威脅其健康[5-7]。傳統(tǒng)方式是使用化學(xué)藥物或抗生素藥物治療，而抗生素導(dǎo)致的諸多缺點(diǎn)逐漸暴露[8-10]，因此，當(dāng)下迫切需要尋求一類有效的替抗添加劑來防控水產(chǎn)動物疾病。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類具有益生潛力的革蘭氏陽性菌，也是水產(chǎn)動物腸道中的常見菌群之一，具有促生長、降脂、提高機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)腸道菌群組成及凈化水質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。糞腸球菌（Enterococcusfaecalis,E.faecalis）屬腸球菌科，腸球菌屬，對胃液、腸液及膽鹽具有較強(qiáng)耐受能力，是《飼料添加劑品種目錄（2013）》中規(guī)定的可添加到飼料中的菌種[11-14]。E.faecalis在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的研究仍較少，僅在吉富羅非魚（GIFT O.niloticus）[15]、奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus♂×Oreochromis aureus♀)[16]、尼羅羅非魚（Oreochromisniloticus）[17]、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）[18]、鋸緣青蟹（Scylla paramamosain）[19]等有所報(bào)道，而目前關(guān)于E.faecalis的適宜添加水平在烏鱧飼料中的研究未見報(bào)道。本研究擬通過在烏鱧飼料中添加不同濃度的E.faecalis，探究其對烏鱧的生長、抗氧化及免疫的影響，明確E.faecalis在烏鱧飼料中的適宜添加濃度，為烏鱧的健康養(yǎng)殖及E.faecalis在實(shí)際生產(chǎn)中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及飼料

E.faecalisW24（GenBank：MT102746.1）從健康烏鱧腸道內(nèi)容物中篩選獲得并由本實(shí)驗(yàn)室保存；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基，均購自北京索萊寶公司；試驗(yàn)用烏鱧，購自山東臨沂某養(yǎng)殖場，試驗(yàn)前暫養(yǎng)于塑料水族箱中，馴化2周，期間投喂基礎(chǔ)飼料?；A(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料制成1.5 mm的顆粒，將菌懸液均勻噴灑于基礎(chǔ)飼料，配制成6種菌液終濃度為0、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109、1.0×1010CFU/g含E.faecalisW24試驗(yàn)飼料(表2及圖1～圖2分組時(shí)分別簡寫為CK、106、107、108、109、1010組)，基礎(chǔ)飼料噴灑等體積PBS溶液作為對照組飼料，在25℃空調(diào)房晾干，每3 d制備一批新的飼料并檢測飼料中E.faecalisW24活性，保存在4℃單獨(dú)密封的塑料容器中。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平（%，干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

暫養(yǎng)結(jié)束后，將540尾體質(zhì)健康、大小一致、初始體重為（8.91±0.02）g的烏鱧，隨機(jī)分配到18個(gè)塑料水族箱中，6個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾。每天9：00和16：00飽食投喂2次，飼養(yǎng)8周。養(yǎng)殖期間水溫（26±2）℃；pH 7.5±0.1；氨氮＜0.5 mg/L；亞硝酸鹽＜0.05 mg/L；溶解氧＞7.0 mg/L。

1.3 樣品收集

8周飼養(yǎng)試驗(yàn)后，禁食24 h，計(jì)數(shù)并稱重，每桶隨機(jī)取10尾魚，用100 mg/L MS-222將魚麻醉后，于尾靜脈采血，4℃靜置12 h，4 000 r/min離心15 min收集血清，-20℃保存?zhèn)溆?。在冰上快速收集腸道置于無酶離心管，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生長指標(biāo)測定

使用以下公式計(jì)算成活率（SR）、平均增重率（WG）、飼料效率（FER）、特定生長率（SGR）及蛋白質(zhì)效率（PER）。

成活率（SR，%）=100×（試驗(yàn)?zāi)┐婊铘~總數(shù)/試驗(yàn)初存活魚總數(shù)）

平均增重率（WG，%）=100×（Wt-W0）/W0

飼料效率（FER，%）=100×（Wt-W0）/I

特定生長率（SGR，%/d）=100×（lnWt-lnW0）/t

蛋白質(zhì)效率(PER)=（Wt-W0）/(I×C)

式中：I——攝入飼料的重量（g）；

t——試驗(yàn)時(shí)間（d）；

W0——試驗(yàn)初始時(shí)烏鱧的總重量（g）；

Wt——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)烏鱧的總重量（g）；

C——飼料蛋白質(zhì)的含量（%）。

1.5 抗氧化及免疫相關(guān)指標(biāo)測定

肝臟和腸道中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量，血清中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）活性及免疫球蛋白M（IgM）、補(bǔ)體3（C3）、補(bǔ)體4（C4）含量，均通過南京建成生物工程研究所試劑盒測定[20-22]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's法多重比較分析組間差異顯著性程度，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，P＜0.05表示顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 E.faecalis W24對烏鱧生長和飼料利用的影響（見表2）

表2 E.faecalis W24對烏鱧生長和飼料利用的影響

由表2可知，8周試驗(yàn)結(jié)束后，添加1.0×107、1.0×108CFU/g組和1.0×109CFU/g組烏鱧的終末體重(FBW)、WG及SGR均顯著高于對照組（P＜0.05），但組間差異不顯著(P＞0.05)；添加1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g組烏鱧的FER顯著高于對照組(P＜0.05)，但組間的差異不顯著(P＞0.05)；添加1.0×107、1.0×108CFU/g組烏鱧的PER顯著高于對照組(P＜0.05)，但組間差異不顯著(P＞0.05)；其中，添加1.0×108CFU/g組各指標(biāo)值達(dá)到最高。而與對照組相比，添加1.0×106CFU/g組的FBW、WG、SGR、FER及PER均無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 E.faecalis W24對烏鱧抗氧化能力的影響(見圖1)

由圖1A可知，8周試驗(yàn)結(jié)束后，添加1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g組烏鱧肝臟和腸道中的SOD活性均顯著高于對照組(P＜0.05)，但組間差異不顯著(P＞0.05)；由圖1B和圖1C可知，添加1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g組烏鱧肝臟和腸道中的CAT活性及腸道中的GSH-Px活性均顯著高于對照組(P＜0.05)，而與對照組相比，1.0×106、1.0×1010CFU/g組差異不顯著(P＞0.05)，此外，與對照組相比，僅1.0×108CFU/g組肝臟中的GSH-Px活性顯著升高(P＜0.05)，其余各組均差異不顯著(P＞0.05)。由圖1D可知，與對照組相比，添加1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g組和1.0×1010CFU/g組烏鱧肝臟和腸道中的MDA含量均顯著下降(P＜0.05)，其中，添加1.0×108CFU/g組達(dá)到最低值，而添加1.0×109CFU/g組和1.0×1010CFU/g組的MDA含量逐漸上升。

圖1 E.faecalis W24對烏鱧肝臟和腸道抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 E.faecalis W24對烏鱧免疫功能的影響(見圖2)

由圖2A、C和F可知，8周試驗(yàn)結(jié)束后，添加1.0×107、1.0×108CFU/g和1.0×109CFU/g組烏鱧血清中的IgM含量及ACP和LZM活性均顯著高于對照組（P＜0.05），但1.0×106、1.0×1010CFU/g組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；由圖2B、D可知，與對照組相比，添加1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g和1.0×1010CFU/gE.faecalisW24組烏鱧血清中的C4含量及AKP活性均顯著升高（P＜0.05），但組間差異不顯著（P＞0.05）；由圖2E可知，僅添加1.0×107CFU/g和1.0×108CFU/g組烏鱧血清中的C3含量顯著高于對照組（P＜0.05），而1.0×106、1.0×109、1.0×1010CFU/g組與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 E.faecalis W24對烏鱧血清非特性免疫指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 E.faecalis W24對烏鱧生長和飼料利用的影響

E.faecalis在維持腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收等方面發(fā)揮重要作用[11]。在本研究中，在飼料中添加適量E.faecalisW24（1.0×107、1.0×108CFU/g）后顯著提高了烏鱧的FBW、WG、FER、PER及SGR，有效促進(jìn)烏鱧的生長并提高其對飼料的利用效率。飼料中添加1.5×107CFU/gE.faecalis可顯著提高吉富羅非魚SGR、WG及FER[15]。添加3.47×108CFU/gE.faecalis的飼料飼喂羅非魚8周后，顯著增加了其WG和SGR，顯著降低了其飼料系數(shù)（Feed coefficient ratio，F(xiàn)CR）[16]。林艾影等[23]將添加不同濃度E.faecalis的飼料飼喂給軍曹魚10周后，發(fā)現(xiàn)添加1.0×108CFU/g和3.0×108CFU/gE.faecalis顯著降低了FCR，添加1.0×108、3.0×108、5.0×108CFU/gE.faecalis顯著提高了其WG和SGR。Yang等[19]發(fā)現(xiàn)飼料中添加1.0×109CFU/gE.faecalisY17能夠提高鋸緣青蟹（Scylla paramamosain）的FBW、WG及SGR等生長指標(biāo)，但差異不顯著。Liu等[24]研究表明，飼料中添加1.0×109CFU/gE.faecalis能夠顯著提高仔豬的WG。朱孟玲等[25]在飼料中添加1.0×109CFU/gE.faecalis，發(fā)現(xiàn)乳豬的生長性能得到顯著提高。以上結(jié)果均表明，飼料中添加適量的E.faecalis能夠促進(jìn)動物的生長，與本研究結(jié)果相似，但最適添加量與動物的種類、規(guī)格、E.faecalis菌株以及飼喂周期相關(guān)。

3.2 E.faecalis W24對烏鱧抗氧化能力的影響

動物機(jī)體的抗氧化能力是保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷的防御系統(tǒng)，SOD、CAT、T-AOC及GSH-Px是反映機(jī)體抗氧化能力的四個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，反映機(jī)體氧化損傷程度的關(guān)鍵指標(biāo)[26]。在本試驗(yàn)條件下，添加1.0×107、1.0×108CFU/g和1.0×109CFU/gE.faecalisW24顯著提高了烏鱧肝臟和腸道中的SOD、CAT活性并顯著降低了MDA含量。用發(fā)酵乳桿菌飼喂的鯉血清中SOD、CAT和GSH-Px的含量均有所提升[27]。飼料中添加3.0×107CFU/g瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）CD6能 顯 著 提 高 金 魚（Carassius auratus）腸道中的抗氧化能力[28]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。經(jīng)以上結(jié)果對比，我們發(fā)現(xiàn)飼料中適量添加量LAB可有效清除機(jī)體內(nèi)過多的自由基，在一定程度上增強(qiáng)抗氧化能力，保護(hù)動物機(jī)體健康。

3.3 E.faecalis W24對烏鱧免疫功能的影響

糞腸球菌在提高機(jī)體免疫力抵抗病原侵襲等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[11，14]。ACP、AKP、LZM、lgM、C3及C4等指標(biāo)常用作檢測魚類的免疫功能[29-30]。在本試驗(yàn)條下，8周養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，飼喂1.0×107、1.0×108CFU/g組血清中IgM、C3、C4含量及ACP、AKP和LZM活性顯著提升，結(jié)果表明飼料中添加1.0×107、1.0×108CFU/gE.faecalisW24能夠增強(qiáng)烏鱧的免疫功能。Liu等[24]在飼料中添加1.0×109CFU/gE.faecalis，發(fā)現(xiàn)仔豬血漿中的IgA和IgG水平顯著提高，飼喂E.faecalis能夠增強(qiáng)免疫功能。朱孟玲等[25]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加1.0×109CFU/gE.faecalis可顯著提高乳豬血清中的IgA、IgG、IgM水平。此外，將添加1.0×109CFU/gE.faecalisY17的飼料飼喂鋸緣青蟹6周后，血清中LZM和SOD活性顯著升高[19]。以上研究結(jié)果均表明，雖然不同E.faecalis菌株在飼料中的適宜添加量不同，但均能增強(qiáng)免疫功能，促進(jìn)動物機(jī)體健康。

4 結(jié)論

綜上所述，飼料中添加適量E.faecalisW24在一定程度上可有效促進(jìn)烏鱧生長、飼料利用，增強(qiáng)抗氧化能力和免疫功能。在本試驗(yàn)條件下，烏鱧飼料中E.faecalisW24的最適添加量為1.0×107～1.0×108CFU/g。