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        四環(huán)素的毒性預(yù)測與驗證

        2021-08-09 06:18:44趙軍杰程林麗欒業(yè)輝韓鴻飛
        飼料工業(yè) 2021年14期
        關(guān)鍵詞:毒性肝臟劑量

        ■趙軍杰 程林麗,2,3* 欒業(yè)輝 韓鴻飛

        (1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 100193;2.國家獸藥殘留基準實驗室,北京 100193;3.動物源食品安全檢測技術(shù)北京市重點實驗室,北京 100193)

        抗生素因具有防治動物感染性疾病以及促進生長等作用得到廣泛應(yīng)用[1],但其產(chǎn)生的毒性作用風險往往被忽視。特別近年來抗生素濫用現(xiàn)象較普遍,未被代謝的抗生素殘留在動物機體,部分隨排泄等途徑進入水體和土壤,并通過食物鏈進行生物富集,對環(huán)境、食品安全以及人類健康產(chǎn)生了一定的威脅。因此,對畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)中的抗生素應(yīng)用進行全面的毒性風險評估是十分必要的。

        四環(huán)素類抗生素(tetracyclines,TCs)是一類廣譜抗生素,廣泛應(yīng)用于革蘭氏陽性菌及陰性菌引起的疾病感染治療,對立克次氏體、支原體、衣原體以及某些螺旋體和原蟲具有較強的抑制作用。TCs低劑量可以用來促進禽畜生長,高劑量可以用來防治感染性疾病,并且具有抗菌活性好及成本低廉等優(yōu)點,因此被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)。據(jù)報道,TCs是我國動物養(yǎng)殖業(yè)使用量最大的抗生素,其生產(chǎn)量和使用量在國內(nèi)均為第一。但由于其在動物體內(nèi)吸收較少,大部分以原形或代謝物的形式排出體外,隨排泄途徑進入環(huán)境,具有潛在環(huán)境風險,并可通過食物鏈富集從而對人體健康產(chǎn)生較大危害。因此在應(yīng)用四環(huán)素類抗生素的同時,不能忽視其產(chǎn)生的毒性作用風險。四環(huán)素作為四環(huán)素類抗生素的典型代表,目前毒性作用已有不少報道,包括遺傳毒性及肝臟毒性等,但對其毒性研究并不全面。

        長期以來,各國政府部門認可的藥物毒理學評價基本都通過傳統(tǒng)的毒理實驗進行。這些方法多為動物實驗或分子水平實驗,實驗耗費高、周期長且效率較低。因此迫切需要開發(fā)快速且低成本的替代方法來進行藥物的毒性評價。近10年來,通過以采集各種數(shù)據(jù)庫的實驗數(shù)據(jù)建立定量構(gòu)效關(guān)系(包括化合物結(jié)構(gòu)與毒性之間的關(guān)系)模型為基礎(chǔ)的計算機輔助藥物設(shè)計預(yù)測軟件不斷開發(fā)和完善,其中不少軟件預(yù)測模型形象直觀并且準確度較高,已成為最重要的藥物毒性預(yù)測方法之一,其中以QSAR為模型開發(fā)的毒性預(yù)測軟件已逐步應(yīng)用于新藥研發(fā)和藥理毒理研究過程中,大大縮短了藥物毒性作用評估時間以及試驗成本,能夠為藥物毒性評價提供有效參考。

        因此,本文采用應(yīng)用比較廣泛的軟件之一ADMET Predictor 6.5的毒性預(yù)測模塊對四環(huán)素進行毒理學評價,分析和討論各個毒性參數(shù)預(yù)測結(jié)果與文獻報道結(jié)果的契合度,以期能為四環(huán)素的毒性風險評估和毒理機制研究提供參考。

        1 材料與方法

        ADMET Predictor 6.5軟件(美國凡默谷公司開發(fā)的ADME/Tox性質(zhì)預(yù)測與化合物設(shè)計軟件)。

        在Drug Bank中下載四環(huán)素2D分子結(jié)構(gòu)文件,保存為MOL格式,將此格式文件導(dǎo)入ADMET Predictor 6.5軟件進行毒性作用預(yù)測。主要預(yù)測四環(huán)素的急性毒性、致突變性、致染色體變異性、致癌性、生殖毒性以及潛在肝臟毒性,包括堿性磷酸酯酶(AlkPhos)、谷酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、乳酸鹽脫氫酶(LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)指標的影響。各毒性模塊對應(yīng)的毒性參數(shù)及界限值見表1。

        表1 毒性預(yù)測模塊對應(yīng)參數(shù)及界限值*

        2 結(jié)果與分析

        2.1 急性毒性預(yù)測結(jié)果和文獻數(shù)據(jù)比較

        以大鼠為動物模型進行急性毒性預(yù)測,毒性終點為半數(shù)致死濃度LC50,即表示引起50%受試對象死亡的藥劑濃度,單位為mg/L。對于大多數(shù)藥物,軟件設(shè)定急性毒性預(yù)測參數(shù)(TOX_Rat)LC50大于等于300時不具有急性毒性。而文獻大多以半數(shù)致死劑量LD50來評價四環(huán)素的急性毒性,即能夠引起試驗動物一半死亡的藥物劑量,單位為mg/kg。

        軟件預(yù)測獲得四環(huán)素的LC50值為1 092.84 mg/L,該值遠大于300 mg/L,即四環(huán)素對大鼠急性毒性很低。文獻檢索到大鼠半數(shù)致死劑量LD50為807 mg/kg,依據(jù)急性毒性分級標準(表2)判斷四環(huán)素屬于低毒性藥物。預(yù)測結(jié)果與文獻報道基本一致。

        表2 小鼠經(jīng)口急性毒性分級標準

        2.2 致突變性預(yù)測結(jié)果和文獻數(shù)據(jù)比較

        細菌回復(fù)突變試驗(Ames實驗)利用鼠傷寒沙門氏菌來檢測點突變,原理是通過觀察試驗菌株在缺乏所需要氨基酸的培養(yǎng)基上的生長情況,檢測試驗菌株是否恢復(fù)合成必需氨基酸的能力,評價受試物誘發(fā)突變的能力。

        ADMET Predictor提供了一套共10株的沙門氏菌(表3)建立致突變預(yù)測模型TOX_MUT_***,預(yù)測化合物在不同沙門菌屬Ames試驗中的致突變可能性,輸出結(jié)果為“陰(-)/陽(+)”。程序提供了致突變性打分規(guī)則進行綜合打分。預(yù)測結(jié)果TOX_MUT_Risk為2,即判定四環(huán)素無致突變性。

        表3 10株鼠傷寒沙門氏菌*

        Akiko等研究四環(huán)素和亞硝酸鹽的協(xié)同致突變性,結(jié)果顯示,加入S9-Mix的情況下,四環(huán)素和亞硝酸鹽共存時,觀察到沙門氏菌TA100標準株回復(fù)突變體顯著增加。但無論S9-Mix存在與否,四環(huán)素在0.2~1.0μg/板時對沙門氏菌TA98和TA100兩個標準株均無明顯致突變性。預(yù)測結(jié)果和實驗結(jié)果保持一致。

        2.3 致染色體變異性預(yù)測結(jié)果和文獻數(shù)據(jù)比較

        致染色體變異性參數(shù)為TOX_CABR,其預(yù)測結(jié)果為“是”和“否”兩種。軟件預(yù)測結(jié)果為Nontoxie(56%),即四環(huán)素具有致染色體變異性。

        微核試驗通過檢測受試物是否引起哺乳動物骨髓嗜多染紅細胞染色體或有絲分裂器損傷而誘導(dǎo)微核細胞發(fā)生率增高,以評價受試物致突變的可能性。吳亦帆等通過觀察鹽酸四環(huán)素各劑量組小鼠骨髓細胞染色體切片,發(fā)現(xiàn)環(huán)狀染色體出現(xiàn)的概率為23.5%,染色單體斷裂概率為23%;并進行了微核試驗,發(fā)現(xiàn)隨著鹽酸四環(huán)素給藥劑量的增加,嗜多染紅細胞微核率呈線性增加。以上實驗結(jié)果說明鹽酸四環(huán)素具有致染色體變異的可能性。預(yù)測結(jié)果和文獻報道結(jié)果基本一致。

        2.4 致癌性預(yù)測結(jié)果和文獻數(shù)據(jù)比較

        用半數(shù)致癌濃度TD50來評估大小鼠致癌性參數(shù)TOX_BRM_Rat和TOX_BRM_Mouse。TD50為使受試動物完整暴露期間,半數(shù)動物患腫瘤所需的藥物劑量。軟件預(yù)測結(jié)果為大鼠TD50為238.4 mg/(kg·d),小鼠TD50為1 721.9 mg/(kg·d),即四環(huán)素沒有致癌性。

        Dietz等在大鼠小鼠中進行了為期兩年的鹽酸四環(huán)素致癌性研究。通過飼料連續(xù)暴露于0、12 500 mg/kg或25 000 mg/kg的抗生素水平下。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)增生性變化(增生、腺瘤和腺癌)的總發(fā)生率不受抗生素暴露的影響,即鹽酸四環(huán)素對大鼠和小鼠均無致癌性,并且發(fā)現(xiàn)鹽酸四環(huán)素對某些自發(fā)性腫瘤可能具有保護作用。預(yù)測結(jié)果和文獻報道結(jié)果一致。

        2.5 生殖毒性預(yù)測結(jié)果和文獻數(shù)據(jù)比較

        生殖毒性參數(shù)TOX_REPR的預(yù)測結(jié)果為“是”和“否”兩種。軟件輸出四環(huán)素生殖毒性預(yù)測結(jié)果為“Nontoxic(80%)”,即四環(huán)素無生殖毒性。

        研究發(fā)現(xiàn),大鼠連續(xù)給高劑量四環(huán)素[28.6、30、10、40、200 mg/(kg·d)],會引起大鼠睪丸、附睪和精囊相對重量顯著降低,且附睪精子活力、活精子百分比、精子數(shù)降低以及異常精子形態(tài)增加。分子水平研究發(fā)現(xiàn),四環(huán)素可導(dǎo)致大鼠超氧化物歧化酶以及血清睪酮含量下降,丙二醛含量增加,表明四環(huán)素通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起雄性大鼠精子毒性和睪丸毒性。但長期攝入5 mg/kg劑量四環(huán)素對雄性Wistar大鼠生精功能無明顯影響,對于雌性大鼠,低劑量鹽酸四環(huán)素[1.2 mg/(kg·d)和4.8 mg/(kg·d)灌胃90 d]對大鼠子宮沒有明顯的副作用,Steiner等在雌鼠交配前染毒1 d,發(fā)現(xiàn)高劑量四環(huán)素(100 mg/kg)對雌鼠子宮和宮頸均有不良影響。

        以上分析表明,高劑量四環(huán)素對大鼠具有生殖毒性作用,低劑量對大鼠生殖功能無顯著影響,四環(huán)素的生殖毒性具有明顯的“劑量依賴關(guān)系”,與軟件預(yù)測結(jié)果契合度較低。

        2.6 肝臟毒性預(yù)測結(jié)果和文獻數(shù)據(jù)比較

        軟件判定滿足以下兩個條件之一,則預(yù)測可能引起肝毒性。條件一:ALT和AST同時升高。條件二:AST和ALT至少有一個升高且ALP、GGT、LDH至少有一個升高。

        軟件輸出四環(huán)素肝臟潛在毒性結(jié)果為“ALT、AST和GGT升高,AlkPhos和LDH保持不變”,預(yù)測結(jié)果顯示,四環(huán)素具有潛在的肝臟毒性。

        大量研究發(fā)現(xiàn),連續(xù)多天進行高劑量四環(huán)素[200 mg/(kg·d)]給藥,大鼠和小鼠AST、ALT顯著升高。對肝臟進行組織病變分析顯示,該劑量下的大鼠以及小鼠肝臟病變明顯,出現(xiàn)如廣泛空泡變性、肝細胞脂肪變性以及淋巴細胞和中性粒細胞浸潤等病理變化。提示該劑量的四環(huán)素具有肝臟毒性,可引起肝臟損傷。同時測定肝毒性標志物——氧化應(yīng)激蛋白的表達情況,進一步證實高劑量四環(huán)素對大鼠具有肝毒性。低劑量四環(huán)素[50 mg/(kg·d)]處理后的小鼠僅見ALT顯著升高,且肝臟無明顯病變。且高劑量的四環(huán)素[200 mg/(kg·d)]處理24 h即可引起大鼠肝臟的脂肪病變,并引起肝細胞的局部炎癥細胞浸潤,但ALT和AST并沒有顯著的變化。

        以上結(jié)果提示四環(huán)素具有肝臟毒性,且具有明顯“時間和劑量依賴性”,與軟件預(yù)測結(jié)果基本一致。

        3 討論

        傳統(tǒng)毒理學實驗時間長,耗資大,而且需要進行動物實驗,對動物傷害較大,因此急需建立快速和低成本的替代方法。隨著計算機輔助藥物設(shè)計技術(shù)的興起,一些直觀、形象并且準確度較高的商業(yè)軟件上市。史少澤等分別用ADMET Predictor與VirtualToxLab兩種軟件預(yù)測中藥成分的毒性。并對兩種軟件的準確度進行了比較,結(jié)果顯示,ADMET Predictor在急性毒性以及肝毒性預(yù)測方面表現(xiàn)較好。關(guān)于該模型用于藥物的毒性預(yù)測已有較多的報道,但尚未見其應(yīng)用于四環(huán)素的毒性評估研究。因此,本文選用基于QSAR模型的ADMET Predictor軟件進行四環(huán)素的毒性預(yù)測。

        采用QSAR模型預(yù)測化合物的毒性研究報道較多,但該模型用于抗生素的毒性作用預(yù)測研究較少。如Huang等建立了QSAR模型用于中藥活性成分肝毒性的篩選,得出該模型可用于中藥活性成分肝毒性評價的補充工具的結(jié)論。Pavel等以梨狀四膜蟲的生長抑制為毒性判定依據(jù),選擇毒性數(shù)據(jù)集,建立QSAR模型進行毒性預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該模型可用于梨狀四膜蟲的毒性篩選。Liu等建立四個QSAR模型,以斑馬魚為模型生物,預(yù)測有機污染物的毒性,該模型可有效地預(yù)測各種有機物對斑馬魚的胚胎毒性,有助于評估有機污染物對水生環(huán)境的潛在危害。

        武英豪和蔣慧等使用ADMET Predictor分別對培氟沙星以及喹烯酮的毒性進行了預(yù)測,并與文獻數(shù)據(jù)進行比較研究,但其中并未涉及對應(yīng)藥物肝臟毒性。由于抗生素引起的肝損傷在藥物性肝毒中占有一定比例,同時有大量的文獻對四環(huán)素的肝臟毒性進行了探究,因此本文在此基礎(chǔ)上對四環(huán)素肝臟潛在毒性進行了預(yù)測并進行比較分析。軟件預(yù)測四環(huán)素具有潛在肝臟毒性,文獻數(shù)據(jù)顯示,四環(huán)素具有肝臟毒性,且四環(huán)素引起肝臟毒性具有時間和劑量依賴性,預(yù)測結(jié)果和報道基本一致。

        四環(huán)素致突變性、致癌性和致染色體變異性的預(yù)測結(jié)果與文獻報道數(shù)據(jù)保持一致,其中急性毒性方面,軟件以LC50作為毒性終點,文獻報道多以LD50來判定急性毒性,兩者在四環(huán)素急性毒性定性判斷上相符,但無法進行定量比較。軟件預(yù)測四環(huán)素沒有生殖毒性,文獻結(jié)果顯示高劑量四環(huán)素具有生殖毒性,具有明顯的“劑量依賴性”,和軟件契合度較低。造成這種差異可能的原因是,QSAR模型依據(jù)藥物結(jié)構(gòu)特征來進行藥物毒性的預(yù)測,而除了結(jié)構(gòu)外其他影響藥物理化性質(zhì)的特征條件可能對藥物的生殖毒性有影響,且實驗條件以及精度也會對毒性研究結(jié)果產(chǎn)生影響。

        以上比較分析結(jié)果說明,采用數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)建立的結(jié)構(gòu)-毒效關(guān)系模型在藥物毒性預(yù)測中具有較高的準確度。由于藥物毒性數(shù)據(jù)庫處于不斷更新的狀態(tài),在實驗數(shù)據(jù)缺乏時,軟件預(yù)測可以為傳統(tǒng)毒理學試驗提供前期數(shù)據(jù)支持,但不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)毒理學試驗方法,這些預(yù)測軟件可以用于藥物的早期毒性效應(yīng)評價及新藥早期篩選。

        4 結(jié)論

        本文對四環(huán)素的急性毒性、致突變性、致染色體變異性、致癌性、生殖毒性及潛在肝臟毒性進行了預(yù)測,并與文獻數(shù)據(jù)進行比較綜合分析。結(jié)果顯示,四環(huán)素具有致染色體變異性以及潛在肝臟毒性,不具有致突變性和致癌性且急性毒性較低,以上預(yù)測結(jié)果與實驗數(shù)據(jù)基本保持一致。軟件預(yù)測四環(huán)素不具有生殖毒性,文獻數(shù)據(jù)顯示,四環(huán)素高劑量時具有生殖毒性,預(yù)測結(jié)果與報道結(jié)果契合度較低。

        (參考文獻33篇,掃碼關(guān)注獲?。?/p>

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