■張倩雲(yún) 王鵬飛 從光雷 施壽榮 譚本杰*
(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530004;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,江蘇揚(yáng)州 225125;3.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009)
凌云烏雞產(chǎn)于廣西凌云縣,因其肉質(zhì)細(xì)嫩甘甜、味鮮、氣味香濃,黑色素含量較高而著稱。然而廣西地處亞熱帶,夏、秋兩季養(yǎng)殖生產(chǎn)中雞處于熱應(yīng)激的情況較常見(jiàn),熱應(yīng)激會(huì)影響黑色素生成通路α-MSHMC1R-cAMP-TRP中相關(guān)基因的表達(dá),從而使生成的黑色素減少。硒是動(dòng)物生長(zhǎng)代謝與繁殖必需的微量元素,在體內(nèi)主要發(fā)揮抗氧化、緩解應(yīng)激、保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)的功能。黎觀紅等[1]在泰和烏骨雞的基礎(chǔ)日糧中分別添加0、0.10、0.30、0.50、0.70 mg/kg和0.90 mg/kg硒,試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加濃度不超過(guò)0.90 mg/kg時(shí),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性與硒添加水平呈正相關(guān);李衛(wèi)春[2]發(fā)現(xiàn)日糧添加硒能顯著提高肉雞血漿中GSH-Px、超氧化物歧化酶(SOD)活性及過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性。張華杰等[3]研究結(jié)果也表明酵母硒能顯著提高血清SOD、GSH-Px活性及總抗氧化能力(T-AOC)。此外,大量研究還發(fā)現(xiàn),硒可以影響動(dòng)物體液免疫與細(xì)胞免疫的功能[4]。硒缺乏會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體的免疫抑制,容易受外部環(huán)境影響,使機(jī)體抗感染能力減弱。李峰等[5]研究結(jié)果表明,在肉雞基礎(chǔ)日糧添加0.2 mg/kg或0.3 mg/kg酵母硒,其21日齡的胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)顯著高于基礎(chǔ)日糧組,即酵母硒可促進(jìn)肉雞免疫器官的早期發(fā)育,從而增強(qiáng)免疫能力。在我國(guó)的中醫(yī)藥和飲食文化中,有“逢黑必補(bǔ)”的說(shuō)法,烏骨雞主要的滋補(bǔ)藥用價(jià)值是其體內(nèi)的黑色素。酪氨酸是黑色素合成的前體物質(zhì),在動(dòng)物體內(nèi),酪氨酸在酪氨酸酶的催化下,經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生物過(guò)程合成黑色素。酪氨酸酶是黑色素合成過(guò)程中主要的限速酶,是一種銅結(jié)合金屬酶,在黑色素三個(gè)重要的合成步驟中發(fā)揮特征性催化作用[6]。硒可以緩解熱應(yīng)激,提高在熱應(yīng)激條件下黑色素的合成。然而關(guān)于日糧酪氨酸水平和硒水平對(duì)烏骨雞免疫性能、酶活性及組織黑色素合成影響的研究報(bào)道不多,因此研究日糧酪氨酸水平和硒水平以及它們的交互作用對(duì)烏雞免疫性能、酶活性及組織黑色素含量的影響,對(duì)烏雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本研究的目的是通過(guò)探究硒與酪氨酸的添加水平對(duì)13~20周齡凌云烏雞黑色素含量及其相關(guān)酶活性的影響,確定凌云烏雞日糧中酪氨酸與硒的最適添加量,為利用營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段提高凌云烏雞藥用價(jià)值提供參考依據(jù)。
試驗(yàn)在廣西凌云縣瑞東農(nóng)牧有限公司開(kāi)展,試驗(yàn)周期為13周齡至20周齡。試驗(yàn)采用雙因素交叉設(shè)計(jì)分組,日糧硒(購(gòu)買(mǎi)于安琪酵母股份有限公司,硒濃度為2 000 mg/kg)添加水平為0、0.2、0.3、0.4 mg/kg,酪氨酸(購(gòu)買(mǎi)于江西百盈生物技術(shù)有限公司,純度為99%)添加水平為0、0.2%、0.4%、0.6%,選取13周齡體重差異不顯著、體況良好的凌云烏雞576只,隨機(jī)分為16組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)12只雞,試驗(yàn)1組為對(duì)照組,試驗(yàn)分組見(jiàn)表1。
表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組
采用玉米-豆粕-魚(yú)粉型日糧,基礎(chǔ)日糧為粉料,基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。試驗(yàn)烏雞均在同一雞舍,試驗(yàn)之前對(duì)籠舍進(jìn)行全面消毒,采用3層階梯式雞籠,獨(dú)立乳頭式飲水器,自由飲水,每天8:00和15:00進(jìn)行飼喂,定期對(duì)雞舍打掃、消毒,保持雞舍環(huán)境干凈衛(wèi)生,其他飼養(yǎng)管理辦法按該公司日常飼養(yǎng)管理章程進(jìn)行。
表2 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
1.3.1 血液樣品采集與制備
在20周齡末,每個(gè)重復(fù)選取1只體況相近的凌云烏雞,禁食12 h,翅靜脈采血5 mL,3 500 r/min離心10 min,將血清分離,做好標(biāo)簽后放入-20℃冰箱備用保存。
1.3.2 組織樣品采集與制備
在20周齡末,血液采集完成后,在屠宰試驗(yàn)的過(guò)程中,取肝臟、肌肉、皮膚樣品,剝離上面附著的結(jié)締組織,每個(gè)組織樣品采集5 g左右,放入提前做好標(biāo)簽的離心管中,放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定時(shí),剪取組織樣品1 g左右,于冰冷生理鹽水中漂洗清除血液,用濾紙吸干水分后精確稱重,用移液槍在燒杯中加入9倍重量的預(yù)冷生理鹽水,將精確稱重后的組織塊轉(zhuǎn)移至燒杯中快速剪碎,再用組織勻漿機(jī)研磨為10%的組織勻漿,將組織勻漿用低溫離心機(jī)(2 000 r/min)離心10 min,取上清棄沉淀,轉(zhuǎn)移到提前做好標(biāo)簽的預(yù)冷離心管中,放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3 血清與組織酪氨酸酶活性測(cè)定
采用多巴色素法測(cè)定血清與組織中酪氨酸酶活性,將0.5 mL的L-多巴(5 mmol/L)溶液加入5 mL的離心管中,然后加入2.4 mL磷酸緩沖液,濃度為0.1 mol/L,在37℃恒溫箱中孵育10 min后,用移液槍移取0.1 mL血清或組織勻漿液至離心管中振蕩混勻,立刻用分光光度計(jì)測(cè)定475 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(A475),連續(xù)讀數(shù)5 min并記錄。以A475每分鐘增加或減少0.001為一個(gè)酶活力單位。
1.3.4 血液與組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性測(cè)定
采用5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)法測(cè)定,試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1.3.5 組織黑色素含量測(cè)定
采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合、底物顯色,用酶標(biāo)儀測(cè)得450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品濃度。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,試劑盒購(gòu)于赫澎(上海)生物科技有限公司。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel進(jìn)行初步處理,之后采用SPSS 23.0對(duì)處理過(guò)的數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析,互作效應(yīng)顯著時(shí)再采用單因素方差分析以判斷雙因素之間具體的互作表現(xiàn)。用Duncan's法做平均數(shù)的顯著性差異分析,以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示處理結(jié)果,P<0.05為差異顯著。
表3 日糧硒與酪氨酸添加水平對(duì)凌云烏雞血清免疫活性指標(biāo)的影響
由表3分析可知,與對(duì)照組相比,處理組對(duì)凌云烏雞血清中IgM濃度無(wú)顯著影響(P>0.05),試驗(yàn)10組使凌云烏雞血清中IgG濃度顯著提高(P<0.05),試驗(yàn)8組顯著提高了血清中IgA的濃度(P<0.05)。硒添加組、酪氨酸添加組,對(duì)凌云烏雞血清中免疫活性指標(biāo)均無(wú)顯著影響(P>0.05),且硒與酪氨酸也不存在互作效應(yīng)(P>0.05)。但是從整體看,日糧添加硒與酪氨酸對(duì)凌云烏雞血清中IgG、IgA的濃度有所提高。
由表4可知,添加不同水平的硒與酪氨酸對(duì)凌云烏雞血清與組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性有不同程度的影響。血清中第11組效果最顯著(P<0.05),肌肉中以第8組效果最顯著(P<0.05),皮膚中以第9組效果最顯著(P<0.05),肝臟中第10組效果最顯著(P<0.05)。硒添加組能使血清與組織中GSH-Px的活性顯著升高(P<0.05),但是與添加水平相關(guān),高水平硒組,其酶活性低于低水平組;酪氨酸添加組對(duì)血清中GSH-Px的活性有顯著升高的作用(P<0.05),對(duì)組織中GSH-Px的活性無(wú)顯著影響(P>0.05);硒與酪氨酸對(duì)血清與組織中GSH-Px的活性無(wú)互作效應(yīng)(P>0.05)。
表4 日糧硒與酪氨酸添加水平對(duì)凌云烏雞血清與組織中GSH-Px活性的影響
由表5分析可知,日糧添加不同水平硒與酪氨酸對(duì)凌云烏雞血清、肝臟、皮膚中酪氨酸酶(TYR)的活性有不同程度的影響。血清中以第15組效果最顯著(P<0.05);肝臟中第9組效果最顯著(P<0.05),但是第16組顯著低于對(duì)照組(P<0.05);皮膚中第12組效果最顯著(P<0.05)。硒添加組對(duì)凌云烏雞血清和組織中TYR活性無(wú)顯著影響(P>0.05);酪氨酸添加組能顯著提高血清與皮膚中TYR活性(P<0.05);硒與酪氨酸對(duì)血清、肝臟和皮膚中TYR活性存在互作效應(yīng),并顯著提高血清和肝臟、皮膚TYR活性(P<0.05),隨著添加水平增高,其活性會(huì)有所下降。
表5 日糧硒與酪氨酸添加水平對(duì)凌云烏雞血清與組織中TYR活性的影響
由表6分析可知,日糧添加不同水平硒與酪氨酸對(duì)凌云烏雞肌肉、肝臟、皮膚中黑色素含量有不同程度影響。與對(duì)照組相比,肌肉中第5組黑色素含量最高(P<0.05),肝臟中黑色素含量最高的組為第2組(P<0.05),皮膚中第9組黑色素含量最高(P<0.05)。硒添加組顯著提高了凌云烏雞皮膚中黑色素含量(P<0.05);酪氨酸添加組顯著提高了肌肉中黑色素含量(P<0.05);硒與酪氨酸對(duì)肌肉、肝臟和皮膚中黑色素的含量的影響存在互作效應(yīng)(P<0.05),能夠顯著提高凌云烏雞肌肉、肝臟和皮膚中黑色素含量。
表6 日糧硒與酪氨酸添加水平對(duì)凌云烏雞組織中黑色素含量的影響
IgA、IgM和IgG是血清免疫球蛋白中最重要的3類,IgA主要參與機(jī)體黏膜表面的體液免疫應(yīng)答,IgM是初次免疫應(yīng)答中最早產(chǎn)生的免疫球蛋白,IgG是自然感染和人工主動(dòng)免疫后機(jī)體產(chǎn)生的主要抗體[7]。張立恒[8]發(fā)現(xiàn)日糧酪氨酸與苯丙氨酸的水平對(duì)絲毛烏骨雞的機(jī)體蛋白代謝與免疫功能無(wú)顯著影響。楊清麗等[9]發(fā)現(xiàn),日糧添加硒可以顯著提高產(chǎn)蛋雞血清中總蛋白、白蛋白和IgA、IgM的含量。Cai等[10]對(duì)1日齡的肉雞研究時(shí)發(fā)現(xiàn),飼糧中添加0.3 mg/kg納米硒,飼喂21 d時(shí)各試驗(yàn)組血清IgG、IgM、IgA含量均無(wú)顯著提高,然而飼喂42 d后能顯著提高血清IgG、IgM的含量,并且0.5 mg/kg納米硒組血清IgG、IgM的含量顯著低0.3 mg/kg納米硒組。本試驗(yàn)結(jié)果表明,日糧中單獨(dú)添加硒或單獨(dú)添加酪氨酸都不會(huì)對(duì)血清免疫球蛋白產(chǎn)生影響。與對(duì)照組相比,10組對(duì)血清中IgG的含量有顯著提高作用,10組日糧硒與酪氨酸添加水平為0.2 mg/kg、0.6%,8組對(duì)血清中IgA的含量有顯著提高作用,8組日糧硒與酪氨酸添加水平為0.2 mg/kg和0.2%。由此可知,硒和酪氨酸存在互作效應(yīng),說(shuō)明硒提高家禽的免疫功能還跟酪氨酸的含量有關(guān),本研究結(jié)果表明,單獨(dú)添加硒或酪氨酸都不能提高雞的免疫功能。
谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性中心是硒半胱氨酸,硒是GSH-Px的必需成分,GSH-Px活力也可以作為衡量機(jī)體硒水平的一項(xiàng)指標(biāo)。硒可以通過(guò)作用于GSH-Px來(lái)發(fā)揮抗氧化作用,保護(hù)動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞的完整并維持功能正常[11]。張?jiān)鲈碵12]的研究結(jié)果表明,基礎(chǔ)日糧中添加0.2 mg/kg和0.3 mg/kg的酵母硒對(duì)血清中GSH-Px的活性有顯著提高作用,且酵母硒使用效果比亞硒酸鈉更顯著。Surai[13]發(fā)現(xiàn)富含硒蛋孵化雛雞時(shí),肝臟GSH-Px的活性不僅在孵化時(shí)較高,而且在孵化后5 d也比普通蛋所孵化的雛雞高。陳國(guó)順等[14]在不同硒源對(duì)肉雞抗氧化能力的研究中發(fā)現(xiàn),酵母硒能顯著提高肉雞肝臟和血清中GSH-Px的活性。硒與日糧中的營(yíng)養(yǎng)元素可能會(huì)發(fā)生互作效應(yīng),鄭嫩珠等[15]對(duì)半番鴨的研究發(fā)現(xiàn),酵母硒與黃芪多糖組合能顯著提高半番鴨肌肉中GSH-Px的活性。孫春陽(yáng)等[16]研究發(fā)現(xiàn),以葡萄糖氧化酶和酵母硒為主要成分的復(fù)合添加劑,使21日齡和42日齡肉雞血清GSH-Px的活性分別顯著提高了8.9%、12.3%。據(jù)王興華等[17]報(bào)道,在日糧中添加0.8 mg/kg的硒能顯著提高白羽肉雞血清和肝臟中GSH-Px的活性。硒的抗氧化作用非常大,因此硒的添加量要適量適度,動(dòng)物攝入過(guò)量硒會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用,抑制其抗氧化功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明,日糧中添加硒能顯著提高凌云烏雞血清、肝臟、肌肉和皮膚中GSH-Px的活性;添加酪氨酸顯著提高了血清中GSH-Px的活性,硒與酪氨酸對(duì)凌云烏雞血清和組織中GSH-Px的活性無(wú)互作效應(yīng)。
酪氨酸是黑色素合成的前體物質(zhì),在動(dòng)物體內(nèi)酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下,經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生物過(guò)程合成。酪氨酸酶是黑色素合成過(guò)程中主要的限速酶,是一種銅結(jié)合金屬酶,在黑色素三個(gè)重要的合成步驟中發(fā)揮特征性催化作用[6]。趙艷平等[18]在對(duì)1~12周齡的泰和烏骨雞研究中發(fā)現(xiàn),在三個(gè)生長(zhǎng)階段分別提供1.18%、0.88%和1.25%水平的酪氨酸,能顯著提高烏骨雞血清酪氨酸酶的活性。王蘭梅等[19]發(fā)現(xiàn),飼喂馬來(lái)西亞紅羅非魚(yú)0.5%、1%、2%三個(gè)酪氨酸水平的餌料,酪氨酸水平為2%組皮膚與血清中酪氨酸酶的活性顯著高于0.5%組。黃燕等[20]研究結(jié)果表明,日糧添加硒能顯著提高烏蒙烏雞皮膚、肌肉、肝和腎中酪氨酸酶的活性。據(jù)黎觀紅等[1]報(bào)道,日糧適量添加硒,能夠提高泰和烏骨雞血清及組織酪氨酸酶的活性。許蘭嬌[21]發(fā)現(xiàn)日糧添加硒能夠在一定程度上提高熱應(yīng)激狀態(tài)下泰和烏骨雞組織酪氨酸酶的活性。也有報(bào)道稱日糧的銅添加水平對(duì)酪氨酸酶的活性產(chǎn)生影響[22-23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,日糧添加硒對(duì)凌云烏雞血清中酪氨酸酶的活性有提高趨勢(shì),添加酪氨酸能顯著提高血清與皮膚中的酪氨酸酶的活性,硒與酪氨酸對(duì)凌云烏雞血清、肝臟和皮膚存在互作效應(yīng)。
黑色素具有清除自由基抗氧化、防輻射防誘變、抗衰老、富集微量金屬元素等生物功能[24]。烏骨雞與普通肉雞的最大區(qū)別在于烏骨雞體內(nèi)含有大量的黑色素,烏骨雞在入藥或作為滋補(bǔ)品時(shí),黑色素含量是評(píng)價(jià)藥用或滋補(bǔ)功效的重要指標(biāo)。黑色素合成的底物是酪氨酸,因此當(dāng)烏骨雞合成大量的黑色素時(shí),日糧的酪氨酸供應(yīng)量需要滿足其需求。大量研究表明,動(dòng)物機(jī)體維持氧化/抗氧化平衡對(duì)黑色素合成具有重要意義,動(dòng)物熱應(yīng)激會(huì)使機(jī)體內(nèi)部氧化代謝增加,造成過(guò)氧化物增加,打破機(jī)體內(nèi)部氧化/抗氧化平衡,破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)[25]。同時(shí),熱應(yīng)激會(huì)影響黑色素生成通路α-MSH-MC1R-cAMP-TRP相關(guān)基因的表達(dá),從而影響黑色素的生成[21]。硒最重要的生物功能就是抗氧化功能,消除過(guò)多自由基,從而保護(hù)生物體的膜結(jié)構(gòu)與功能,可以緩解因熱應(yīng)激而造成的黑色素合成減少。黎觀紅等[26]發(fā)現(xiàn)日糧酪氨酸添加量在一定范圍內(nèi)可以提高泰和烏骨雞組織黑色素含量。Watson等[27]發(fā)現(xiàn)在犬類的日糧中提高酪氨酸+苯丙氨酸的比例,其毛色會(huì)因黑色素沉積而呈現(xiàn)黑色。據(jù)Wang等[28]報(bào)道,提高餌料中酪氨酸含量會(huì)導(dǎo)致羅非魚(yú)腹部與背部皮膚黑色素含量的提高。趙艷平等[29-30]對(duì)1~4、9~12周齡泰和烏骨雞研究發(fā)現(xiàn),日糧酪氨酸水平在0.98%~1.25%時(shí),可以顯著提高烏骨雞肌肉、肝臟、心臟、皮膚中黑色素含量。張竹英[31]對(duì)泰和烏骨雞進(jìn)行急性熱暴露研究黑色素含量變化,研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激條件下12 h和24 h,能降低組織抗氧化能力,并且組織黑色素含量有下降的趨勢(shì)。許蘭嬌[21]發(fā)現(xiàn),在日糧中添加0.3、0.5、0.7 mg/kg硒,可以提高熱應(yīng)激條件下泰和烏骨雞組織黑色素含量。熊小文等[32-33]對(duì)5~8、9~12周齡泰和烏骨雞研究發(fā)現(xiàn),在日糧中添加0.3~0.5 mg/kg的硒,可以提高烏骨雞組織黑色素含量。有學(xué)者報(bào)道,動(dòng)物組織中硒含量與黑色素含量有一定關(guān)系[34]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,日糧添加硒與酪氨酸能夠提高凌云烏雞組織黑色素含量,且硒與酪氨酸對(duì)組織黑色素含量存在互作效應(yīng)。綜合肌肉、肝臟、皮膚黑色素含量分析,試驗(yàn)9組即當(dāng)日糧硒與酪氨酸添加量為0.2 mg/kg和0.4%時(shí),凌云烏雞組織黑色素含量相對(duì)較高。硒與酪氨酸添加量過(guò)高時(shí),凌云烏雞組織黑色素含量減少,這在互作組表現(xiàn)尤為明顯,這可能是硒與酪氨酸添加過(guò)量抑制黑色素的生成,或是高水平的硒與酪氨酸互作效應(yīng)能抑制凌云烏雞黑色素生成。
日糧添加硒與酪氨酸在一定程度上可以增強(qiáng)凌云烏雞的免疫力,提高凌云烏雞血清與組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、酪氨酸酶的活性,并提高組織黑色素的含量。綜合谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、酪氨酸酶的活性及對(duì)黑色素的含量分析,基礎(chǔ)日糧中單獨(dú)添加0.2 mg/kg硒或者單獨(dú)添加0.6%的酪氨酸的效果最好。硒與酪氨酸交互作用得到基礎(chǔ)日糧中添加0.2 mg/kg和0.4%的硒與酪氨酸時(shí)效果最好。綜合上述指標(biāo)分析,當(dāng)日糧硒與酪氨酸的水平為0.4 mg/kg和0.98%時(shí),可以提高作為烏雞藥用價(jià)值重要指標(biāo)之一黑色素的含量。