■張 麗 蔣文杰 徐嘉茗 馬恒甲 王文基 王秀娟 吳玉波*

(1.臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江臺(tái)州 318000；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310024)

三角魴(Megalobrama terminalis，Richardson 1846)是一種較大型的淡水雜食性魚(yú)類(lèi)，由于其營(yíng)養(yǎng)較佳、肉質(zhì)鮮嫩，已成為我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要品種之一。目前，相關(guān)學(xué)者已在三角魴養(yǎng)殖技術(shù)[1]、苗種培育[2]、營(yíng)養(yǎng)飼料[3-4]等方面取得較大進(jìn)展，使我國(guó)三角魴產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷發(fā)展壯大，養(yǎng)殖潛力巨大。然而，人工集約化和規(guī)?；B(yǎng)殖導(dǎo)致三角魴生長(zhǎng)性能減緩、飼料利用效率不高、免疫力下降等現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致三角魴養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益降低。研究表明，采用適宜的營(yíng)養(yǎng)添加劑既能促進(jìn)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的健康生長(zhǎng)，又能提高魚(yú)產(chǎn)量。

絲蘭粉是以絲蘭為原料，經(jīng)干燥和研磨得到的固體粉末，主要成分含有絲蘭酚、皂苷、白藜蘆醇和多糖等[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中，添加絲蘭粉不僅能促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的健康生長(zhǎng)，也能吸附養(yǎng)殖環(huán)境中的氨、硫化氫等氣體，降低有毒有害氣體的排放，進(jìn)而促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色發(fā)展[6-7]。因此，絲蘭粉被廣泛用于雞、豬等畜禽養(yǎng)殖動(dòng)物的飼料中[8-9]。目前，有關(guān)絲蘭粉在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究報(bào)道相對(duì)較少，僅見(jiàn)于羅非魚(yú)[10-11]、對(duì)蝦[12]、大菱鲆[13]等少數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中。絲蘭粉作為一種新的環(huán)保型植物添加劑，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)和健康影響的報(bào)道尚不多見(jiàn)。為此，本研究分析了基礎(chǔ)飼料中添加不同含量的絲蘭粉對(duì)三角魴幼魚(yú)生長(zhǎng)、非特異性免疫以及抗氧化指標(biāo)的影響，全面評(píng)估絲蘭粉在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效能，旨在為三角魴的健康養(yǎng)殖篩選適宜的飼料添加劑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料、實(shí)驗(yàn)飼料與實(shí)驗(yàn)魚(yú)

飼料原料主要包括雞肉粉、魚(yú)粉、去皮豆粕、棉粕、菜粕、次粉、面粉和魚(yú)油等，均由浙江德清鴻利飼料有限公司提供。維生素和礦物質(zhì)預(yù)混物購(gòu)自帝斯曼公司。絲蘭粉由西安綠天生物科技有限公司提供。根據(jù)馬恒甲等[3]設(shè)計(jì)三角魴實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料（蛋白質(zhì)33.3%、脂肪7.9%、灰分7.4%和磷1.4%），在基礎(chǔ)飼料配方中添加0（S0）、0.05%（S1）、0.15%（S2）、0.25%（S3）、0.35%（S4）和0.45%（S5）的絲蘭粉，配制成6種等氮等能的三角魴實(shí)驗(yàn)飼料（見(jiàn)表1）。三角魴幼魚(yú)由杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在室外微流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行（共18個(gè)養(yǎng)殖桶，每個(gè)養(yǎng)殖桶直徑80 cm，高70 cm，容積350 L）。試驗(yàn)前，挑選360尾規(guī)格均勻的幼魚(yú)放于微流水養(yǎng)殖桶系統(tǒng)中，每個(gè)養(yǎng)殖桶放入三角魴幼魚(yú)各20尾，暫養(yǎng)7 d。幼魚(yú)暫養(yǎng)期間，每天8:00和16:00以對(duì)照組飼料S0飽食投喂實(shí)驗(yàn)魚(yú)。

表1 三角魴實(shí)驗(yàn)飼料配方(%)

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，首先將暫養(yǎng)的三角魴幼魚(yú)停食24 h，每次隨機(jī)取15尾幼魚(yú)，群體稱(chēng)重后隨機(jī)放入一個(gè)養(yǎng)殖桶中。三角魴幼魚(yú)的初始體重為（16.0±0.8）g。每個(gè)實(shí)驗(yàn)飼料設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共用18個(gè)養(yǎng)殖桶。飼料投喂的實(shí)驗(yàn)周期為56 d，每天8:00和16:00分別以實(shí)驗(yàn)飼料（S0、S1、S2、S3、S4和S5）飽食投喂三角魴幼魚(yú)2次。在微流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中連續(xù)充氣（溶解氧＞5.0 mg/L），記錄水溫變化（27.8～33.0℃），光照周期為白天14 h光照和晚上10 h黑暗。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有實(shí)驗(yàn)魚(yú)饑餓24 h，然后將每個(gè)養(yǎng)殖桶中的魚(yú)依次捕出、計(jì)數(shù)并群體稱(chēng)重。從每個(gè)養(yǎng)殖桶中取3尾魚(yú)，靜脈取血，離心，取上清，然后解剖實(shí)驗(yàn)魚(yú)，取肝臟，保存于-20℃下作為分析樣品。

1.3 化學(xué)分析

肝臟樣品研磨后離心的上清液和尾靜脈取血離心后的上清液，采用分光光度計(jì)比濁法測(cè)定溶菌酶活性；堿性磷酸酶和酸性磷酸酶分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺測(cè)定其酶活力的高低，波長(zhǎng)為520 nm。采用賴(lài)氏法檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性；在酸性條件下抗氧化物質(zhì)可以還原Fe3+-TPTZ產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，在593 nm處讀取吸光度，測(cè)定總抗氧化能力(T-AOC)；采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用TBA法檢測(cè)丙二醛(MDA)含量。檢測(cè)用試劑盒均由南京建成生物科技有限公司提供，檢測(cè)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算

終末體重（g）=終末魚(yú)總重/終末魚(yú)尾數(shù)

體增重（g）=終末魚(yú)總重/終末魚(yú)尾數(shù)-初始魚(yú)總重/初始魚(yú)尾數(shù)

攝食率（%/d）=100×飼料總投喂量/[（初始魚(yú)總重+終末魚(yú)總重）/2×試驗(yàn)天數(shù)]

飼料系數(shù)=飼料總投喂量/（終末魚(yú)總重-初始魚(yú)總重）

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS軟件（版本21.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）方法檢驗(yàn)添加絲蘭粉對(duì)成活率、終末體重、體增重、攝食率、飼料系數(shù)、肝臟和血清生理生化指標(biāo)（溶菌酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、超氧化物歧化酶、總抗氧化能力、丙二醛）的影響，采用Duncan's多重比較方法檢驗(yàn)處理間差異，當(dāng)P＜0.05為差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲蘭粉對(duì)三角魴幼魚(yú)生長(zhǎng)和飼料系數(shù)的影響（見(jiàn)表2）

表2 絲蘭粉對(duì)三角魴幼魚(yú)生長(zhǎng)及飼料系數(shù)的影響

由表2可知，各實(shí)驗(yàn)組的成活率均大于96%。隨著絲蘭粉添加水平的增加，實(shí)驗(yàn)魚(yú)的終末體重和體增重呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組S3的終末體重和體增重最高，而對(duì)照組S0和實(shí)驗(yàn)組S5的終末體重和體增重最低。實(shí)驗(yàn)組S2的攝食率顯著高于對(duì)照組S0，而實(shí)驗(yàn)組S1、S3、S4和S5的攝食率與對(duì)照組S0之間均無(wú)顯著差異，但有增大趨勢(shì)。與對(duì)照組S0相比，實(shí)驗(yàn)組S2和S3的飼料系數(shù)顯著降低（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組S1、S4和S5的飼料系數(shù)與對(duì)照組S0之間均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2 絲蘭粉對(duì)三角魴肝臟和血清非特異性免疫的影響（見(jiàn)表3、表4）

表3 絲蘭粉對(duì)三角魴肝臟非特異性免疫的影響

表4 絲蘭粉添加水平對(duì)三角魴血清非特異性免疫的影響

由表3可知，與對(duì)照組S0相比，實(shí)驗(yàn)組S1、S2、S3、S4、S5之間肝臟的溶菌酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組S2、S4和S5的酸性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照組S0（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組S1和S3的酸性磷酸酶活性與對(duì)照組S0之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組S2和S3的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。

由表4可知，與對(duì)照組S0相比，實(shí)驗(yàn)組S2和S3血清的溶菌酶活性顯著升高（P＜0.05）；隨著絲蘭粉添加水平的增加，實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清的堿性磷酸酶活力顯著升高（S1組除外）（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組S1的酸性磷酸酶顯著升高（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組S2和S3的酸性磷酸酶活性顯著降低（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組S2、S3和S4血清的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于對(duì)照組S0和實(shí)驗(yàn)組S1和S5（P＜0.05）；隨著絲蘭粉添加水平的增加，實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清的谷草轉(zhuǎn)氨酶活力呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)（P＜0.05）。

2.3 絲蘭粉對(duì)三角魴幼魚(yú)血清抗氧化力的影響（見(jiàn)表5）

表5 絲蘭粉添加水平對(duì)三角魴血清抗氧化力的影響

由表5可知，實(shí)驗(yàn)組S1、S2、S3、S4、S5血清中的SOD活性和T-AOC活性顯著高于對(duì)照組S0（P＜0.05）。隨著絲蘭粉添加水平的增加，實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清的MDA含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)；對(duì)照組S0具有最高的MDA含量，而實(shí)驗(yàn)組S3血清的MDA含量則最低（P＜0.05）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加500～1 000 mg/kg絲蘭提取物可以顯著改善斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)的生長(zhǎng)表現(xiàn)[14]。在羅非魚(yú)集約化養(yǎng)殖條件下，750 mg/kg的絲蘭提取物對(duì)其生長(zhǎng)性能具有明顯的促進(jìn)作用[15]。本研究中，隨著絲蘭粉添加水平的增加，三角魴幼魚(yú)終末體重呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，表明在三角魴基礎(chǔ)飼料中添加0.05%～0.35%的絲蘭粉可顯著增強(qiáng)其生長(zhǎng)性能。實(shí)驗(yàn)組S3具有最高的終末體重和體增重，表明在三角魴基礎(chǔ)飼料中添加絲蘭粉的最適劑量為0.25%。絲蘭提取物具有誘食作用，可改善飼料的適口性，并提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的攝食率[16]。同時(shí)，絲蘭提取物也可顯著提高養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料的轉(zhuǎn)化效率[17]。這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組S0相比，實(shí)驗(yàn)組S1、S2、S3和S4的攝食率相對(duì)較高，而其飼料系數(shù)相對(duì)較低，表明攝食量的增加及飼料利用效率的提高是三角魴幼魚(yú)體終末體重增加的主要原因。

肝功能生理生化指標(biāo)的高低可反映肝臟的健康狀況。溶菌酶是一種抗菌酶，也是生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子之一[18]。溶菌酶活力越大，則機(jī)體的抗菌能力越強(qiáng)。堿性磷酸酶在解毒代謝方面起著非常重要作用，它廣泛存在于動(dòng)植物、微生物中[19]。酸性磷酸酶在生物體能量轉(zhuǎn)化、信號(hào)傳遞等過(guò)程起到重要作用，可以催化磷酸單酯水解和磷酸基因的轉(zhuǎn)移。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶主要分布于機(jī)體的肝細(xì)胞內(nèi)，但當(dāng)機(jī)體的肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶則會(huì)被釋放入血液循環(huán)中，故可認(rèn)為機(jī)體的轉(zhuǎn)氨酶活力與肝細(xì)胞受損程度呈現(xiàn)正相關(guān)性[20]。目前，有關(guān)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)生理生化指標(biāo)含量的適宜范圍尚無(wú)明確的標(biāo)準(zhǔn)，大多數(shù)研究結(jié)果均采用對(duì)照組的數(shù)據(jù)為參照[9]。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組S1、S2、S3、S4、S5肝臟的溶菌酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶與對(duì)照組無(wú)顯著差異，表明絲蘭粉不會(huì)對(duì)三角魴肝臟的免疫功能造成損傷。而實(shí)驗(yàn)組S2和S3肝臟的谷草轉(zhuǎn)氨酶顯著低于對(duì)照組S0和實(shí)驗(yàn)組S1、S4、S5，表明0.15%～0.25%的絲蘭粉有助于三角魴肝功能的保護(hù)。此外，實(shí)驗(yàn)組S2和S3血清的溶菌酶顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組，表明0.15%～0.25%的絲蘭粉能顯著提高機(jī)體血清的抗菌能力。隨著絲蘭粉添加水平的增加，三角魴血清的堿性磷酸酶活力顯著升高，表明絲蘭粉能顯著提高機(jī)體的解毒能力。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組S2、S3和S4血清中轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于對(duì)照組S0，表明基礎(chǔ)飼料中補(bǔ)充0.15%～0.35%的絲蘭粉可以使三角魴幼魚(yú)肝細(xì)胞受損后釋放到血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量變少，這有助于保護(hù)肝臟，使其免受損傷。絲蘭粉中富含甾類(lèi)皂苷、多酚和多糖等生理活性物質(zhì)，對(duì)機(jī)體有害菌具有強(qiáng)烈的抑制效果，同時(shí)具有免疫刺激活性，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)抗體的生成，刺激機(jī)體免疫細(xì)胞增殖等功能[21]。由此可見(jiàn)，攝食絲蘭粉可以增強(qiáng)三角魴幼魚(yú)的非特異性免疫反應(yīng)。

超氧化物歧化酶是機(jī)體重要的抗氧化酶之一，它能阻斷O2-·對(duì)正常細(xì)胞造成的損傷，還能及時(shí)修復(fù)自由基氧化后所產(chǎn)生的氧化損傷[22]。魚(yú)體生理的健康狀況可以用機(jī)體抗氧化功能來(lái)衡量，而抗氧化功能的綜合性指標(biāo)則可以采用總抗氧化能力來(lái)反映[23]。本研究中，添加絲蘭粉后三角魴血清中SOD和T-AOC顯著高于對(duì)照組S0，表明絲蘭粉能明顯提高三角魴幼魚(yú)清除機(jī)體自由基的能力，使機(jī)體免受氧化損傷，這與王際英等[13]報(bào)道的飼料中添加適當(dāng)?shù)慕z蘭提取物對(duì)大菱鲆幼魚(yú)抗氧化系統(tǒng)具有明顯增強(qiáng)效果的研究結(jié)果相一致。丙二醛具有很強(qiáng)的生物毒性，會(huì)破壞正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，它也是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化物主要成分[24]。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組S1、S2、S3、S4、S5血清中的丙二醛含量明顯低于對(duì)照組S0，表明絲蘭粉可以減少不飽和脂肪酸被自由基氧化所生成的脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物，具有保護(hù)機(jī)體免受細(xì)胞膜氧化損傷的作用。可見(jiàn)，絲蘭粉對(duì)三角魴幼魚(yú)的抗氧化系統(tǒng)具有明顯的增強(qiáng)效果。

綜上所述，在三角魴的飼料中添加絲蘭粉可以提高魚(yú)體的終末體重和體增重，并增強(qiáng)飼料的適口性和利用效率。當(dāng)飼料中添加0.15%～0.25%的絲蘭粉后，有利于三角魴幼魚(yú)的肝功能的保護(hù)，能夠提高血清溶菌酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶活力和總抗氧化能力，并降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性和丙二醛的含量。