趙 雪，靳欣迪，劉 斌，趙旭博

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（楊凌），陜西 楊凌 712100）

辣椒粉是一種常見的香辛料，富含辣椒素、VC和胡蘿卜素等物質(zhì)，其獨(dú)特的風(fēng)味及香氣特性深受廣大消費(fèi)者青睞，在世界各地廣泛種植。我國是辣椒種植、消費(fèi)及外貿(mào)大國，所創(chuàng)造的經(jīng)濟(jì)價(jià)值位居蔬菜類商品第一。傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)操作習(xí)慣使得辣椒在收獲、加工及運(yùn)輸過程中極易受到霉菌污染[1]。霉菌污染不僅會(huì)降低辣椒品質(zhì)，且在一定條件下，某些霉菌會(huì)產(chǎn)生高穩(wěn)定性的真菌毒素，一般的烹飪方法難以消除[2]，這對(duì)喜好攝入辣椒產(chǎn)品人群的食品安全問題構(gòu)成了巨大威脅。

真菌毒素目前已成為世界上最重要和最熱點(diǎn)的食品安全問題之一，黃曲霉為好氧型腐生真菌，其產(chǎn)生的黃曲霉毒素為1類致癌物[3]。常見的有黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）和黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）4 種結(jié)構(gòu)，其中AFB1毒性最強(qiáng)，其具有肝毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性和致畸性[4]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織資料顯示，全球每年約有25%的農(nóng)作物因真菌毒素污染而被銷毀，其中香辛料也為真菌毒素易污染的食品，一些組織和國家相應(yīng)出臺(tái)了限量標(biāo)準(zhǔn)以降低由于香辛料攝入黃曲霉毒素對(duì)人類所構(gòu)成的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)。歐盟規(guī)定香辛料中AFB1和黃曲霉毒素總量最高限量值為5 μg/kg和10 μg/kg[5]。美國規(guī)定食品中黃曲霉毒素限量為20 μg/kg[6]。在中國，除胡椒外，綠色食品香料及其產(chǎn)品中AFB1和黃曲霉毒素總量的最高限量為5 μg/kg和10 μg/kg[7]。盡管這些監(jiān)管措施能有效阻止受真菌毒素污染的香辛料進(jìn)入消費(fèi)市場，但對(duì)進(jìn)入市場流通及消費(fèi)環(huán)節(jié)的香辛料，污染了霉菌后極可能在適宜的環(huán)境條件下繼續(xù)生長并產(chǎn)生毒素，因此，采用環(huán)境因子控制黃曲霉的繼續(xù)繁殖生長及毒素代謝累積，對(duì)保障辣椒粉的食品安全具有重要社會(huì)意義。

預(yù)測微生物學(xué)是20世紀(jì)80年代初起始的一門交叉性學(xué)科，它通過構(gòu)建數(shù)學(xué)模型模擬不同培養(yǎng)條件下微生物生長[8]。21世紀(jì)以來，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅猛發(fā)展，針對(duì)黃曲霉生長動(dòng)力學(xué)模型的研究漸多[9-10]。Marín等[11]設(shè)計(jì)了含水量（10%～30%）和溫度（10～42 ℃）實(shí)驗(yàn)，預(yù)測了黃曲霉菌株在開心果中的生長速率及毒素量，結(jié)果表明當(dāng)開心果貯存溫度20 ℃、含水量高于10%時(shí)，30 d內(nèi)黃曲霉毒素含量超過歐盟最大限量值。Mousa等[12]模擬了黃曲霉在糙米和精米上的徑向生長速率，評(píng)估了黃曲霉毒素與水分活度（aw，0.82～0.92）及溫度（12～42 ℃）的關(guān)系，結(jié)果表明線性Arrhenius-Davey模型擬合預(yù)測優(yōu)于Polynomial模型，且糙米較精米更利于菌株生長及毒素產(chǎn)生。本研究以辣椒中分離的產(chǎn)毒黃曲霉菌為研究對(duì)象，對(duì)不同溫度、aw及pH值條件下辣椒粉中黃曲霉菌的徑向生長變化及黃曲霉毒素累積量進(jìn)行分析，采用Baranyi and Roberts模型構(gòu)建生長動(dòng)力學(xué)初級(jí)模型，對(duì)比二階多項(xiàng)式模型、Arrhenius模型和三階多項(xiàng)式的生長擬合效果，構(gòu)建黃曲霉菌的二階多項(xiàng)式產(chǎn)毒動(dòng)力學(xué)模型。旨在為辣椒及辣椒粉生產(chǎn)、貯運(yùn)等環(huán)節(jié)中的環(huán)境因素控制及保障食品安全提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干辣椒購于超市，粉碎后過40 目標(biāo)準(zhǔn)篩，4 ℃冷藏備用。

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀（均為分析純）中國上海國藥化學(xué)試劑有限公司；氯霉素 上?？ㄅ锟萍加邢薰荆获R鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；真菌基因組DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-A070萬能粉碎機(jī) 濟(jì)南九陽有限公司；IS128 pH計(jì) 上海儀邁儀器科技有限公司；DYY-6C電子天平北京市六一儀器廠；SB-5200DT超凈工作臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)公司；86-1霉菌培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Aqualab Pawkit水分活度儀 美國Meter公司；LC-10AT高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；熒光檢測器 美國Waters公司；Cloversi-C18色譜柱 瑞典Akzo Nobel公司；IAC-SEP?黃曲霉毒素總量免疫親和柱中檢維康生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃曲霉菌的分離與純化

取15.0 g辣椒樣品放入盛有135 mL無菌水的錐形瓶中，封口后，將錐形瓶置于100 r/min的恒溫?fù)u床中，振蕩20 min。隨后，梯度稀釋，取各稀釋度的菌懸液100 μL均勻涂布到含1‰氯霉素的PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)4 d。挑取菌落形態(tài)不同的菌株反復(fù)純化，直到得到單一菌株。

1.3.2 黃曲霉菌分子生物學(xué)鑒定

基因組DNA提?。簡我痪浣臃N于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)3 d，按照試劑盒說明提取各菌株DNA。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增：采用通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增菌株ITS序列。引物序列為ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。反應(yīng)體系為ddH2O 6.0 μL、ITS1/ITS4引物各1.0 μL、PCR Supermix 10.0 μL、基因組DNA 2.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min；55 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min；擴(kuò)增循環(huán)36 次，72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：電泳時(shí)間20 min、電壓120 V、電流300 mA、功率250 W。回收PCR產(chǎn)物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，拼接結(jié)果經(jīng)Nucleotide BLAST核酸比對(duì)，選取序列相似度最高的菌株作為鑒定結(jié)果。

1.3.3 黃曲霉菌產(chǎn)毒力檢測

黃曲霉菌株以單點(diǎn)點(diǎn)植法接種于3 個(gè)PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d。用打孔器分別在每個(gè)板的菌落中心、中間及邊緣各取2 塊帶瓊脂塊的菌落，并轉(zhuǎn)移至裝有6 mL色譜純甲醇的離心管中。渦旋振蕩5 min后，3 500 r/min離心3 min，上清液即為待測液。

1.3.4 色譜條件

Cloversi-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-水（45∶55，V/V）；流速1.0 mL/min；熒光檢測器，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm；進(jìn)樣體積20 μL。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶于色譜甲醇中，配制成含量分別為1.0、2.0、4.0、20.0、100.0 μg/kg和200.0 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃避光保存。

1.3.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用溫度為20、28、37、45 ℃，aw為0.85、0.90、0.93和0.97及pH值為4.5、5.0和5.5的環(huán)境因子設(shè)計(jì)，監(jiān)測黃曲霉在辣椒粉中的生長及產(chǎn)毒量。

1.3.7 孢子懸液制備

將黃曲霉菌株接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無菌水沖洗菌落，4 層脫脂棉紗布過濾掉菌絲，使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用無菌水調(diào)整至105CFU/mL用于接種。配制的孢子懸液保存于4 ℃冰箱中。

1.3.8 生長基質(zhì)

稱取5.0 g辣椒粉于9 個(gè)盛有45 mL蒸餾水的錐形瓶中（3 個(gè)平行），充分渦旋振蕩，用HCl/NaOH溶液將提取液pH值分別調(diào)整為4.5、5.0和5.5，并記錄使用量，根據(jù)各個(gè)pH值水平的平均使用量計(jì)算后續(xù)添加量。以初始含水量（5.48±0.31）%（干基）、aw0.645±0.027、pH 5.1±0.07的空白辣椒粉為生長基質(zhì)。為確保無霉菌污染，于24 個(gè)1 L錐形瓶中分別裝入275 g辣椒粉，121 ℃高壓滅菌20 min。根據(jù)辣椒粉的吸附等溫線計(jì)算各aw應(yīng)加水量，水量減去各pH值水平下應(yīng)加HCl/NaOH溶液量作為實(shí)際加水量，最終得到3 個(gè)pH值和4 個(gè)aw組合的辣椒粉?；旌虾髽悠焚A存于4 ℃冰箱3 d，每間隔6 h混勻一次，以使辣椒粉充分達(dá)到平衡，最終的aw由水分活度儀測定。

1.3.9 接種及菌落生長測定

將辣椒粉無菌移至培養(yǎng)皿（每瓶24 個(gè)皿），壓實(shí)形成單層。接種10 μL孢子懸液至每皿中心。在3 個(gè)pH值水平下隨機(jī)抽取12 個(gè)aw相同的平板放入無菌塑封帶，袋內(nèi)有裝有特定甘油水溶液燒杯，以保持容器中大氣的相對(duì)濕度與辣椒粉的aw相同。裝有培養(yǎng)皿的塑封袋放置在4 個(gè)不同溫度水平的培養(yǎng)箱中。連續(xù)25 d采用電子數(shù)字卡尺在正交方向上進(jìn)行直徑測量，各條件下6 個(gè)平板的均值即為該時(shí)刻菌落直徑。

1.3.10 黃曲霉毒素檢測

培養(yǎng)至第8、16天和25天時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)條件下隨機(jī)抽取3 個(gè)平板檢測辣椒粉中的黃曲霉毒素含量，以均值作為最終結(jié)果。

1.3.10.1 樣品檢測

準(zhǔn)確稱取2.5 g粉碎樣品于50 mL離心管中，加入25 mL乙腈-水（80∶20，V/V），以70 r/min速率振蕩30 min后，3 500 r/min離心3 min。槽紋濾紙過濾上清液至10 mL離心管中后，取3 mL濾液加入27 mL 5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）混勻，調(diào)節(jié)pH值至7，用玻璃纖維濾紙過濾。將IAC-SEP?黃曲霉毒素總量免疫親和柱連接于20 mL玻璃注射器下，準(zhǔn)確移取濾液20 mL注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以1～2 滴/s的速率通過親和柱，直至空氣吹出柱內(nèi)全部液體，再用10 mL超純水以1～2 滴/s淋洗親和柱直至空氣吹出柱內(nèi)全部液體。最后用1.0 mL色譜級(jí)甲醇以1～2 滴/s的流速淋洗親和柱，將全部淋洗液收集于玻璃試管中，渦旋混勻，待測。色譜條件與1.3.3節(jié)黃曲霉菌產(chǎn)毒力檢測部分所用條件相同。

1.3.10.2 精密度

采用10 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試儀器的精密度，每3 h進(jìn)樣一次進(jìn)行儀器的日內(nèi)精密度測量，同一時(shí)間點(diǎn)連續(xù)5 d進(jìn)樣測量儀器日間精密度。

1.3.10.3 加標(biāo)回收

空白辣椒粉中加入2.0、4.0、20.0 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平平行測定6 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel 2010、Origin 9.1以及Design Expert 8.0軟件進(jìn)行相關(guān)計(jì)算與繪圖。

1.4.1 黃曲霉菌生長模型擬合

1.4.1.1 初級(jí)模型擬合

采用Baranyi and Roberts彈性生長函數(shù)進(jìn)行黃曲霉菌生長的非線性回歸擬合，其模型如下[13]：

式中：y為菌落半徑/mm；y0為初始菌落半徑/mm；ymax為最大菌落半徑/mm；μmax為菌落最大徑向生長率/（mm/d）；λ為滯后期/d；t為時(shí)間/d。

1.4.1.2 二級(jí)模型擬合

用修正的二階多項(xiàng)式模型、Arrhenius-Davey模型及三階多項(xiàng)式模型擬合溫度、aw及pH值對(duì)菌落生長速率（μ）的影響[14-16]。

1）二階多項(xiàng)式模型

為獲得更優(yōu)擬合效果，對(duì)aw作如下變換[17]：

則二階多項(xiàng)式模型變?yōu)椋?/p>

式中：T為溫度/℃；aw為水分活度；pH為酸堿度；a0～a9為非線性回歸估計(jì)系數(shù)。

2）Arrhenius-Davey模型

將pH值引入Arrhenius-Davey方程后，表達(dá)式如下：

式中：T為溫度/℃；aw為水分活度；pH為酸堿度；a0～a6分別為非線性回歸估計(jì)系數(shù)。

3）三階多項(xiàng)式模型

式中：T為溫度/℃；aw為水分活度；pH為酸堿度；a0～a10為非線性回歸估計(jì)的系數(shù)。

1.4.2 黃曲霉毒素產(chǎn)生量模型擬合

采用二階多項(xiàng)式方程進(jìn)行溫度、aw及pH值對(duì)黃曲霉毒素產(chǎn)生量的影響描述。擬合模型具有如下形式[16]：

式中：Aflatoxins為黃曲霉毒素總量/（μg/kg）；T為溫度/℃；aw為水分活度；pH為酸堿度；t為培養(yǎng)時(shí)間/d；a0～a14為非線性回歸估計(jì)的系數(shù)。

1.4.3 模型驗(yàn)證與評(píng)價(jià)

設(shè)計(jì)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用同樣的方法，將28、37 ℃實(shí)驗(yàn)條件下辣椒粉中黃曲霉菌的實(shí)際生長速率及產(chǎn)毒量與所建立動(dòng)力學(xué)模型的預(yù)測值進(jìn)行比較分析，進(jìn)行模型有效性和可靠性的驗(yàn)證。采用Ross[18]提出的偏差因子（Bf）、準(zhǔn)確度因子（Af）及均方根誤差（root mean square error，RMSE）評(píng)價(jià)構(gòu)建模型性能。

式中：n為觀察值數(shù)量；DF為自由度。

Bf、Af及RMSE是評(píng)估數(shù)學(xué)模型常用數(shù)學(xué)指標(biāo)[19]。Bf越接近1，表明模型預(yù)測值與觀察值越相符。Af表示預(yù)測值與觀察值間的平均偏差，Af=1，表明所有預(yù)測值和觀察值均相等；Af值越大，該模型預(yù)測的平均精確度越低。RMSE反映預(yù)測值與觀察值的離散程度，RMSE值越小，表示測量精度越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃曲霉菌株鑒定

黃曲霉菌株培養(yǎng)5 d后呈現(xiàn)出黃綠色，并產(chǎn)生分生孢子（圖1）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明該菌株在600 bp左右出現(xiàn)特異性條帶。NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中編號(hào)為MN511742.1的黃曲霉ITS區(qū)段DNA序列與未知菌株的同源性為99.83%（578/579），比較得分為1 064 bits，隨機(jī)搜索概率為0.0。因此，認(rèn)定該菌株為黃曲霉菌。高效液相色譜法測得該菌株此時(shí)的產(chǎn)毒量為51.4 μg/kg。

圖1 黃曲霉菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of Aspergillus flavus in PDA medium

2.2 吸附等溫線

由圖2可見，同一溫度下辣椒粉的平衡含水量隨aw的增加而上升，aw低于0.5時(shí)，吸附等溫線上升平緩，aw高于0.5時(shí)，隨aw增加平衡含水量增長加快。根據(jù)曲線趨勢可判定辣椒粉吸附等溫線為第III型等溫線，與花生殼/仁吸附等溫線類型一致[20]。

圖2 辣椒粉不同溫度下的吸附等溫線Fig.2 Moisture sorption isotherms of chili powder at different temperatures

2.3 初級(jí)生長模型構(gòu)建

不同溫度、aw及酸堿度組合下，黃曲霉菌的最大徑向生長速率如表1所示。從培養(yǎng)條件觀察，本實(shí)驗(yàn)中最大徑向生長速率隨溫度的升高先增大后減小，最適溫度為28～37 ℃；aw與菌株生長率呈正相關(guān)，aw為0.97時(shí)達(dá)最大；pH值對(duì)菌株生長影響較小。在溫度28 ℃、aw0.97、pH 4.5時(shí)，最大徑向生長速率最大（11.73 mm/d），大于黃曲霉在黑胡椒（7.25 mm/d）、水稻（6.51 mm/d）的生長數(shù)據(jù)，這可能是由于培養(yǎng)基差異造成菌株碳氮利用率及糖代謝速度不同所致[21]。此外，溫度在20～37 ℃范圍之外，或溫度適宜但aw小于0.90時(shí)，黃曲霉菌株生長較緩。溫度低于20 ℃、aw小于0.85或溫度高于45 ℃時(shí)，黃曲霉菌不生長。

表1 不同溫度、aw和酸堿度下黃曲霉菌最大徑向生長速率Table 1 Maximum radial growth rates of A.flavus under different temperature, water activity and pH conditions

2.4 二級(jí)生長模型構(gòu)建

用3 種不同模型量化了黃曲霉生長對(duì)環(huán)境變量的響應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)誤差、測定系數(shù)（R2）及RMSE如表2所示?？梢姸A多項(xiàng)式模型的R2值最高（0.991），RMSE值最小（0.069），其次為三階多項(xiàng)式模型和Arrhenius-Davey模型，表明修正的二階多項(xiàng)式模型能更好地描述溫度、aw及pH值對(duì)生長速率的影響。圖3為二階多項(xiàng)式模型的預(yù)測結(jié)果響應(yīng)面圖，反映出pH值對(duì)最大徑向生長速率的影響可忽略不計(jì)，這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)選取的酸堿度范圍較小所致；曲率出現(xiàn)在25～35 ℃范圍，表明辣椒粉中黃曲霉菌的最適生長溫度為此溫度，與小麥粉中霉菌的研究結(jié)果類似[22]；由aw分析，菌株最大徑向生長速率隨aw的增加而增大，谷物中也存在aw越高，真菌生長越快的規(guī)律[23]，相關(guān)研究已證實(shí)真菌的最適aw為0.974～0.987[24]。此外，溫度和aw顯著影響辣椒粉中黃曲霉菌生長，此協(xié)同作用在其他霉菌中同樣被觀察到[25-26]。

表2 黃曲霉菌生長二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的估計(jì)參數(shù)Table 2 Estimated parameters of the secondary kinetic model for A.flavus growth

圖3 二階多項(xiàng)式模型預(yù)測對(duì)黃曲霉菌最大徑向生長速率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plots for the second-order polynomial model predicting the effect of temperature, water activity and pH on the maximum radial growth rate of A.flavus

2.5 黃曲霉毒素產(chǎn)生量模型構(gòu)建

AFG2、AFG1、AFB2、AFB1平均保留時(shí)間分別為（10.165±0.1）、（11.598±0.1）、（12.865±0.1）min和（14.932±0.1）min（圖4）。表3為標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999 8，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。檢出限和定量限分別由3 倍信噪比和10 倍信噪比計(jì)算得到[27]。本研究黃曲霉毒素的檢出限在0.14～0.21 μg/kg之間，定量限在0.47～0.70 μg/kg之間。日內(nèi)精密度和日間精密度實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.3%～1.6%范圍之內(nèi)（表4），表明該儀器穩(wěn)定性良好、可靠性高。黃曲霉毒素在低、中、高3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率在82.6%～117.0%之間，RSD為2.8%～8.3%（表5），說明該方法可靠。

圖4 AFG2、AFG1、AFB2、AFB1標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.4 Chromatograms of AFG2, AFG1, AFB2 and AFB1 standards

表3 黃曲霉毒素回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 3 regression equations, correlation coefficients and linear ranges for aflatoxin

表4 儀器日內(nèi)精密度和日間精密度（n=5）Table 4Intra-day precision and inter-day precision of the instrument (n= 5)

表5 辣椒粉中黃曲霉毒素加標(biāo)回收率Table 5 Spiked recoveries of four aflatoxins in chili powder

不同環(huán)境條件下培養(yǎng)8、16、25 d辣椒粉中黃曲霉毒素產(chǎn)生量見表6，共分析到AFB1、AFB2和AFG2三種真菌毒素。由表6可知，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，毒素累積量急劇增加。在溫度28 ℃、aw0.97、pH 4.5時(shí)黃曲霉毒素總量最高，達(dá)到143.65 μg/kg，遠(yuǎn)高于其在PDA培養(yǎng)基的產(chǎn)毒量[28]。由毒素種類看，AFB1的檢出量遠(yuǎn)高于AFB2和AFG2。應(yīng)用二階多項(xiàng)式方程描述辣椒粉中黃曲霉毒素總量黃曲霉毒素與培養(yǎng)條件的關(guān)系，結(jié)果見表7，R2為0.976、RMSE為0.598，擬合效果良好。方差分析結(jié)果表明，pH值對(duì)黃曲霉毒素的影響不顯著，但溫度和aw對(duì)黃曲霉毒素影響極顯著，這一結(jié)論與黃曲霉菌株生長規(guī)律一致。溫度一方面調(diào)控著黃曲霉菌三羧酸循環(huán)、脂肪酸生物合成、糖代謝、氨基酸代謝等初級(jí)代謝途徑，另一方面也影響著黃曲霉毒素生物合成路徑上相關(guān)酶的表達(dá)[29]。輕度脅迫能引發(fā)黃曲霉毒素的產(chǎn)生，但溫度過低（25 ℃）則阻抑毒素轉(zhuǎn)錄合成過程，溫度過高（37 ℃）則抑制部分結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[30-31]。水分含量也通過調(diào)控黃曲霉菌株的生長發(fā)育及次級(jí)代謝影響著黃曲霉毒素的生物合成[32]。

表6 不同溫度、aw、酸堿度及培養(yǎng)時(shí)間下辣椒粉中黃曲霉毒素含量Table 6 Contents of aflatoxin in chili powder under different conditions of temperature, water activity, pH and culture time

表7 二階多項(xiàng)式模型擬合黃曲霉毒素動(dòng)力學(xué)的估計(jì)參數(shù)Table 7Estimated parameters of the second-order polynomial model for aflatoxin production

2.6 模型驗(yàn)證與評(píng)價(jià)

表8由Bf、Af及RMSE三個(gè)方面評(píng)價(jià)了辣椒粉中環(huán)境因子對(duì)黃曲霉菌生長及產(chǎn)毒量模型預(yù)測的能力，通常而言，Bf值在0.70～1.15，Af值在1.10～1.90時(shí)模型是可接受的[33]。修正的線性二階多項(xiàng)式模型的Bf為1.077 0，Af為1.131 9，RMSE為0.094 3。與Arrhenius-Davey模型和三階多項(xiàng)式模型相比，Bf和Af更接近于1，3 個(gè)模型的RMSE相差無幾，因此，本研究修正的線性二階多項(xiàng)式模型更優(yōu)地預(yù)測了環(huán)境因子對(duì)辣椒粉中黃曲霉比生長速率的影響，這一研究結(jié)果在玉米基質(zhì)中也得到了證實(shí)[34]。此外，二階多項(xiàng)式模型能較好地描述辣椒粉中黃曲霉菌株產(chǎn)黃曲霉毒素的規(guī)律，數(shù)學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，Bf和Af分別為1.120 7和1.171 2，RMSE為0.128 7。圖5二階多項(xiàng)式模型的預(yù)測值與觀察值形成的數(shù)據(jù)點(diǎn)均勻分布在等價(jià)線兩側(cè)，顯示出較優(yōu)的相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)了上述模型預(yù)測結(jié)果。

表8 辣椒粉中黃曲霉生長及黃曲霉毒素含量預(yù)測模型評(píng)價(jià)Table 8 Evaluation of the models for the growth of A.flavus and aflatoxin production in chili powder

圖5 黃曲霉最大徑向生長速率（a）和黃曲霉毒素含量（b）觀察值與模型預(yù)測值驗(yàn)證Fig.5 Comparison of observed maximum radial growth rates of A.flavus (a) and aflatoxins (b) with model predicted values

3 結(jié) 論

本研究對(duì)環(huán)境條件溫度、aw及pH值對(duì)辣椒粉中黃曲霉菌生長及黃曲霉毒素產(chǎn)生量的綜合影響構(gòu)建了預(yù)測模型，二階多項(xiàng)式模型表現(xiàn)出良好的整體性能，可作為可靠的預(yù)測模型。結(jié)果表明，溫度28 ℃、aw0.97、pH 4.5時(shí)，辣椒粉中黃曲霉菌的生長速率和產(chǎn)毒量均達(dá)到最大。溫度和aw顯著影響菌落的生長和毒素產(chǎn)生，溫度28 ℃、aw＜0.85或溫度＞45 ℃的條件下菌株未能生長，在此條件下貯藏辣椒粉可有效避免黃曲霉菌生長及黃曲霉毒素產(chǎn)生，可為辣椒粉的安全儲(chǔ)藏及進(jìn)一步加工提供可供借鑒的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為延長辣椒粉的貨架期提供理論依據(jù)。