趙 雪，靳欣迪，劉 斌，趙旭博

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（楊凌），陜西 楊凌 712100）

辣椒粉是一種常見(jiàn)的香辛料，富含辣椒素、VC和胡蘿卜素等物質(zhì)，其獨(dú)特的風(fēng)味及香氣特性深受廣大消費(fèi)者青睞，在世界各地廣泛種植。我國(guó)是辣椒種植、消費(fèi)及外貿(mào)大國(guó)，所創(chuàng)造的經(jīng)濟(jì)價(jià)值位居蔬菜類商品第一。傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)操作習(xí)慣使得辣椒在收獲、加工及運(yùn)輸過(guò)程中極易受到霉菌污染[1]。霉菌污染不僅會(huì)降低辣椒品質(zhì)，且在一定條件下，某些霉菌會(huì)產(chǎn)生高穩(wěn)定性的真菌毒素，一般的烹飪方法難以消除[2]，這對(duì)喜好攝入辣椒產(chǎn)品人群的食品安全問(wèn)題構(gòu)成了巨大威脅。

真菌毒素目前已成為世界上最重要和最熱點(diǎn)的食品安全問(wèn)題之一，黃曲霉為好氧型腐生真菌，其產(chǎn)生的黃曲霉毒素為1類致癌物[3]。常見(jiàn)的有黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）和黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）4 種結(jié)構(gòu)，其中AFB1毒性最強(qiáng)，其具有肝毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性和致畸性[4]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織資料顯示，全球每年約有25%的農(nóng)作物因真菌毒素污染而被銷毀，其中香辛料也為真菌毒素易污染的食品，一些組織和國(guó)家相應(yīng)出臺(tái)了限量標(biāo)準(zhǔn)以降低由于香辛料攝入黃曲霉毒素對(duì)人類所構(gòu)成的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)。歐盟規(guī)定香辛料中AFB1和黃曲霉毒素總量最高限量值為5 μg/kg和10 μg/kg[5]。美國(guó)規(guī)定食品中黃曲霉毒素限量為20 μg/kg[6]。在中國(guó)，除胡椒外，綠色食品香料及其產(chǎn)品中AFB1和黃曲霉毒素總量的最高限量為5 μg/kg和10 μg/kg[7]。盡管這些監(jiān)管措施能有效阻止受真菌毒素污染的香辛料進(jìn)入消費(fèi)市場(chǎng)，但對(duì)進(jìn)入市場(chǎng)流通及消費(fèi)環(huán)節(jié)的香辛料，污染了霉菌后極可能在適宜的環(huán)境條件下繼續(xù)生長(zhǎng)并產(chǎn)生毒素，因此，采用環(huán)境因子控制黃曲霉的繼續(xù)繁殖生長(zhǎng)及毒素代謝累積，對(duì)保障辣椒粉的食品安全具有重要社會(huì)意義。

預(yù)測(cè)微生物學(xué)是20世紀(jì)80年代初起始的一門交叉性學(xué)科，它通過(guò)構(gòu)建數(shù)學(xué)模型模擬不同培養(yǎng)條件下微生物生長(zhǎng)[8]。21世紀(jì)以來(lái)，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅猛發(fā)展，針對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的研究漸多[9-10]。Marín等[11]設(shè)計(jì)了含水量（10%～30%）和溫度（10～42 ℃）實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)了黃曲霉菌株在開(kāi)心果中的生長(zhǎng)速率及毒素量，結(jié)果表明當(dāng)開(kāi)心果貯存溫度20 ℃、含水量高于10%時(shí)，30 d內(nèi)黃曲霉毒素含量超過(guò)歐盟最大限量值。Mousa等[12]模擬了黃曲霉在糙米和精米上的徑向生長(zhǎng)速率，評(píng)估了黃曲霉毒素與水分活度（aw，0.82～0.92）及溫度（12～42 ℃）的關(guān)系，結(jié)果表明線性Arrhenius-Davey模型擬合預(yù)測(cè)優(yōu)于Polynomial模型，且糙米較精米更利于菌株生長(zhǎng)及毒素產(chǎn)生。本研究以辣椒中分離的產(chǎn)毒黃曲霉菌為研究對(duì)象，對(duì)不同溫度、aw及pH值條件下辣椒粉中黃曲霉菌的徑向生長(zhǎng)變化及黃曲霉毒素累積量進(jìn)行分析，采用Baranyi and Roberts模型構(gòu)建生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)初級(jí)模型，對(duì)比二階多項(xiàng)式模型、Arrhenius模型和三階多項(xiàng)式的生長(zhǎng)擬合效果，構(gòu)建黃曲霉菌的二階多項(xiàng)式產(chǎn)毒動(dòng)力學(xué)模型。旨在為辣椒及辣椒粉生產(chǎn)、貯運(yùn)等環(huán)節(jié)中的環(huán)境因素控制及保障食品安全提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干辣椒購(gòu)于超市，粉碎后過(guò)40 目標(biāo)準(zhǔn)篩，4 ℃冷藏備用。

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純） 德國(guó)Merck公司；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀（均為分析純）中國(guó)上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；氯霉素 上?？ㄅ锟萍加邢薰?；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；真菌基因組DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-A070萬(wàn)能粉碎機(jī) 濟(jì)南九陽(yáng)有限公司；IS128 pH計(jì) 上海儀邁儀器科技有限公司；DYY-6C電子天平北京市六一儀器廠；SB-5200DT超凈工作臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)公司；86-1霉菌培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Aqualab Pawkit水分活度儀 美國(guó)Meter公司；LC-10AT高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；熒光檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司；Cloversi-C18色譜柱 瑞典Akzo Nobel公司；IAC-SEP?黃曲霉毒素總量免疫親和柱中檢維康生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃曲霉菌的分離與純化

取15.0 g辣椒樣品放入盛有135 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，封口后，將錐形瓶置于100 r/min的恒溫?fù)u床中，振蕩20 min。隨后，梯度稀釋，取各稀釋度的菌懸液100 μL均勻涂布到含1‰氯霉素的PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)4 d。挑取菌落形態(tài)不同的菌株反復(fù)純化，直到得到單一菌株。

1.3.2 黃曲霉菌分子生物學(xué)鑒定

基因組DNA提?。?jiǎn)我痪浣臃N于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)3 d，按照試劑盒說(shuō)明提取各菌株DNA。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增：采用通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增菌株ITS序列。引物序列為ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。反應(yīng)體系為ddH2O 6.0 μL、ITS1/ITS4引物各1.0 μL、PCR Supermix 10.0 μL、基因組DNA 2.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min；55 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min；擴(kuò)增循環(huán)36 次，72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：電泳時(shí)間20 min、電壓120 V、電流300 mA、功率250 W?；厥誔CR產(chǎn)物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，拼接結(jié)果經(jīng)Nucleotide BLAST核酸比對(duì)，選取序列相似度最高的菌株作為鑒定結(jié)果。

1.3.3 黃曲霉菌產(chǎn)毒力檢測(cè)

黃曲霉菌株以單點(diǎn)點(diǎn)植法接種于3 個(gè)PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d。用打孔器分別在每個(gè)板的菌落中心、中間及邊緣各取2 塊帶瓊脂塊的菌落，并轉(zhuǎn)移至裝有6 mL色譜純甲醇的離心管中。渦旋振蕩5 min后，3 500 r/min離心3 min，上清液即為待測(cè)液。

1.3.4 色譜條件

Cloversi-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-水（45∶55，V/V）；流速1.0 mL/min；熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm；進(jìn)樣體積20 μL。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶于色譜甲醇中，配制成含量分別為1.0、2.0、4.0、20.0、100.0 μg/kg和200.0 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃避光保存。

1.3.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用溫度為20、28、37、45 ℃，aw為0.85、0.90、0.93和0.97及pH值為4.5、5.0和5.5的環(huán)境因子設(shè)計(jì)，監(jiān)測(cè)黃曲霉在辣椒粉中的生長(zhǎng)及產(chǎn)毒量。

1.3.7 孢子懸液制備

將黃曲霉菌株接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌水沖洗菌落，4 層脫脂棉紗布過(guò)濾掉菌絲，使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用無(wú)菌水調(diào)整至105CFU/mL用于接種。配制的孢子懸液保存于4 ℃冰箱中。

1.3.8 生長(zhǎng)基質(zhì)

稱取5.0 g辣椒粉于9 個(gè)盛有45 mL蒸餾水的錐形瓶中（3 個(gè)平行），充分渦旋振蕩，用HCl/NaOH溶液將提取液pH值分別調(diào)整為4.5、5.0和5.5，并記錄使用量，根據(jù)各個(gè)pH值水平的平均使用量計(jì)算后續(xù)添加量。以初始含水量（5.48±0.31）%（干基）、aw0.645±0.027、pH 5.1±0.07的空白辣椒粉為生長(zhǎng)基質(zhì)。為確保無(wú)霉菌污染，于24 個(gè)1 L錐形瓶中分別裝入275 g辣椒粉，121 ℃高壓滅菌20 min。根據(jù)辣椒粉的吸附等溫線計(jì)算各aw應(yīng)加水量，水量減去各pH值水平下應(yīng)加HCl/NaOH溶液量作為實(shí)際加水量，最終得到3 個(gè)pH值和4 個(gè)aw組合的辣椒粉?；旌虾髽悠焚A存于4 ℃冰箱3 d，每間隔6 h混勻一次，以使辣椒粉充分達(dá)到平衡，最終的aw由水分活度儀測(cè)定。

1.3.9 接種及菌落生長(zhǎng)測(cè)定

將辣椒粉無(wú)菌移至培養(yǎng)皿（每瓶24 個(gè)皿），壓實(shí)形成單層。接種10 μL孢子懸液至每皿中心。在3 個(gè)pH值水平下隨機(jī)抽取12 個(gè)aw相同的平板放入無(wú)菌塑封帶，袋內(nèi)有裝有特定甘油水溶液燒杯，以保持容器中大氣的相對(duì)濕度與辣椒粉的aw相同。裝有培養(yǎng)皿的塑封袋放置在4 個(gè)不同溫度水平的培養(yǎng)箱中。連續(xù)25 d采用電子數(shù)字卡尺在正交方向上進(jìn)行直徑測(cè)量，各條件下6 個(gè)平板的均值即為該時(shí)刻菌落直徑。

1.3.10 黃曲霉毒素檢測(cè)

培養(yǎng)至第8、16天和25天時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)條件下隨機(jī)抽取3 個(gè)平板檢測(cè)辣椒粉中的黃曲霉毒素含量，以均值作為最終結(jié)果。

1.3.10.1 樣品檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取2.5 g粉碎樣品于50 mL離心管中，加入25 mL乙腈-水（80∶20，V/V），以70 r/min速率振蕩30 min后，3 500 r/min離心3 min。槽紋濾紙過(guò)濾上清液至10 mL離心管中后，取3 mL濾液加入27 mL 5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）混勻，調(diào)節(jié)pH值至7，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾。將IAC-SEP?黃曲霉毒素總量免疫親和柱連接于20 mL玻璃注射器下，準(zhǔn)確移取濾液20 mL注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以1～2 滴/s的速率通過(guò)親和柱，直至空氣吹出柱內(nèi)全部液體，再用10 mL超純水以1～2 滴/s淋洗親和柱直至空氣吹出柱內(nèi)全部液體。最后用1.0 mL色譜級(jí)甲醇以1～2 滴/s的流速淋洗親和柱，將全部淋洗液收集于玻璃試管中，渦旋混勻，待測(cè)。色譜條件與1.3.3節(jié)黃曲霉菌產(chǎn)毒力檢測(cè)部分所用條件相同。

1.3.10.2 精密度

采用10 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試儀器的精密度，每3 h進(jìn)樣一次進(jìn)行儀器的日內(nèi)精密度測(cè)量，同一時(shí)間點(diǎn)連續(xù)5 d進(jìn)樣測(cè)量?jī)x器日間精密度。

1.3.10.3 加標(biāo)回收

空白辣椒粉中加入2.0、4.0、20.0 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平平行測(cè)定6 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel 2010、Origin 9.1以及Design Expert 8.0軟件進(jìn)行相關(guān)計(jì)算與繪圖。

1.4.1 黃曲霉菌生長(zhǎng)模型擬合

1.4.1.1 初級(jí)模型擬合

采用Baranyi and Roberts彈性生長(zhǎng)函數(shù)進(jìn)行黃曲霉菌生長(zhǎng)的非線性回歸擬合，其模型如下[13]：

式中：y為菌落半徑/mm；y0為初始菌落半徑/mm；ymax為最大菌落半徑/mm；μmax為菌落最大徑向生長(zhǎng)率/（mm/d）；λ為滯后期/d；t為時(shí)間/d。

1.4.1.2 二級(jí)模型擬合

用修正的二階多項(xiàng)式模型、Arrhenius-Davey模型及三階多項(xiàng)式模型擬合溫度、aw及pH值對(duì)菌落生長(zhǎng)速率（μ）的影響[14-16]。

1）二階多項(xiàng)式模型

為獲得更優(yōu)擬合效果，對(duì)aw作如下變換[17]：

則二階多項(xiàng)式模型變?yōu)椋?/p>

式中：T為溫度/℃；aw為水分活度；pH為酸堿度；a0～a9為非線性回歸估計(jì)系數(shù)。

2）Arrhenius-Davey模型

將pH值引入Arrhenius-Davey方程后，表達(dá)式如下：

式中：T為溫度/℃；aw為水分活度；pH為酸堿度；a0～a6分別為非線性回歸估計(jì)系數(shù)。

3）三階多項(xiàng)式模型

式中：T為溫度/℃；aw為水分活度；pH為酸堿度；a0～a10為非線性回歸估計(jì)的系數(shù)。

1.4.2 黃曲霉毒素產(chǎn)生量模型擬合

采用二階多項(xiàng)式方程進(jìn)行溫度、aw及pH值對(duì)黃曲霉毒素產(chǎn)生量的影響描述。擬合模型具有如下形式[16]：

式中：Aflatoxins為黃曲霉毒素總量/（μg/kg）；T為溫度/℃；aw為水分活度；pH為酸堿度；t為培養(yǎng)時(shí)間/d；a0～a14為非線性回歸估計(jì)的系數(shù)。

1.4.3 模型驗(yàn)證與評(píng)價(jià)

設(shè)計(jì)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用同樣的方法，將28、37 ℃實(shí)驗(yàn)條件下辣椒粉中黃曲霉菌的實(shí)際生長(zhǎng)速率及產(chǎn)毒量與所建立動(dòng)力學(xué)模型的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較分析，進(jìn)行模型有效性和可靠性的驗(yàn)證。采用Ross[18]提出的偏差因子（Bf）、準(zhǔn)確度因子（Af）及均方根誤差（root mean square error，RMSE）評(píng)價(jià)構(gòu)建模型性能。

式中：n為觀察值數(shù)量；DF為自由度。

Bf、Af及RMSE是評(píng)估數(shù)學(xué)模型常用數(shù)學(xué)指標(biāo)[19]。Bf越接近1，表明模型預(yù)測(cè)值與觀察值越相符。Af表示預(yù)測(cè)值與觀察值間的平均偏差，Af=1，表明所有預(yù)測(cè)值和觀察值均相等；Af值越大，該模型預(yù)測(cè)的平均精確度越低。RMSE反映預(yù)測(cè)值與觀察值的離散程度，RMSE值越小，表示測(cè)量精度越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃曲霉菌株鑒定

黃曲霉菌株培養(yǎng)5 d后呈現(xiàn)出黃綠色，并產(chǎn)生分生孢子（圖1）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明該菌株在600 bp左右出現(xiàn)特異性條帶。NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為MN511742.1的黃曲霉ITS區(qū)段DNA序列與未知菌株的同源性為99.83%（578/579），比較得分為1 064 bits，隨機(jī)搜索概率為0.0。因此，認(rèn)定該菌株為黃曲霉菌。高效液相色譜法測(cè)得該菌株此時(shí)的產(chǎn)毒量為51.4 μg/kg。

圖1 黃曲霉菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of Aspergillus flavus in PDA medium

2.2 吸附等溫線

由圖2可見(jiàn)，同一溫度下辣椒粉的平衡含水量隨aw的增加而上升，aw低于0.5時(shí)，吸附等溫線上升平緩，aw高于0.5時(shí)，隨aw增加平衡含水量增長(zhǎng)加快。根據(jù)曲線趨勢(shì)可判定辣椒粉吸附等溫線為第III型等溫線，與花生殼/仁吸附等溫線類型一致[20]。

圖2 辣椒粉不同溫度下的吸附等溫線Fig.2 Moisture sorption isotherms of chili powder at different temperatures

2.3 初級(jí)生長(zhǎng)模型構(gòu)建

不同溫度、aw及酸堿度組合下，黃曲霉菌的最大徑向生長(zhǎng)速率如表1所示。從培養(yǎng)條件觀察，本實(shí)驗(yàn)中最大徑向生長(zhǎng)速率隨溫度的升高先增大后減小，最適溫度為28～37 ℃；aw與菌株生長(zhǎng)率呈正相關(guān)，aw為0.97時(shí)達(dá)最大；pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)影響較小。在溫度28 ℃、aw0.97、pH 4.5時(shí)，最大徑向生長(zhǎng)速率最大（11.73 mm/d），大于黃曲霉在黑胡椒（7.25 mm/d）、水稻（6.51 mm/d）的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，這可能是由于培養(yǎng)基差異造成菌株碳氮利用率及糖代謝速度不同所致[21]。此外，溫度在20～37 ℃范圍之外，或溫度適宜但aw小于0.90時(shí)，黃曲霉菌株生長(zhǎng)較緩。溫度低于20 ℃、aw小于0.85或溫度高于45 ℃時(shí)，黃曲霉菌不生長(zhǎng)。

表1 不同溫度、aw和酸堿度下黃曲霉菌最大徑向生長(zhǎng)速率Table 1 Maximum radial growth rates of A.flavus under different temperature, water activity and pH conditions

2.4 二級(jí)生長(zhǎng)模型構(gòu)建

用3 種不同模型量化了黃曲霉生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境變量的響應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)誤差、測(cè)定系數(shù)（R2）及RMSE如表2所示?？梢?jiàn)二階多項(xiàng)式模型的R2值最高（0.991），RMSE值最?。?.069），其次為三階多項(xiàng)式模型和Arrhenius-Davey模型，表明修正的二階多項(xiàng)式模型能更好地描述溫度、aw及pH值對(duì)生長(zhǎng)速率的影響。圖3為二階多項(xiàng)式模型的預(yù)測(cè)結(jié)果響應(yīng)面圖，反映出pH值對(duì)最大徑向生長(zhǎng)速率的影響可忽略不計(jì)，這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)選取的酸堿度范圍較小所致；曲率出現(xiàn)在25～35 ℃范圍，表明辣椒粉中黃曲霉菌的最適生長(zhǎng)溫度為此溫度，與小麥粉中霉菌的研究結(jié)果類似[22]；由aw分析，菌株最大徑向生長(zhǎng)速率隨aw的增加而增大，谷物中也存在aw越高，真菌生長(zhǎng)越快的規(guī)律[23]，相關(guān)研究已證實(shí)真菌的最適aw為0.974～0.987[24]。此外，溫度和aw顯著影響辣椒粉中黃曲霉菌生長(zhǎng)，此協(xié)同作用在其他霉菌中同樣被觀察到[25-26]。

表2 黃曲霉菌生長(zhǎng)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的估計(jì)參數(shù)Table 2 Estimated parameters of the secondary kinetic model for A.flavus growth

圖3 二階多項(xiàng)式模型預(yù)測(cè)對(duì)黃曲霉菌最大徑向生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plots for the second-order polynomial model predicting the effect of temperature, water activity and pH on the maximum radial growth rate of A.flavus

2.5 黃曲霉毒素產(chǎn)生量模型構(gòu)建

AFG2、AFG1、AFB2、AFB1平均保留時(shí)間分別為（10.165±0.1）、（11.598±0.1）、（12.865±0.1）min和（14.932±0.1）min（圖4）。表3為標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999 8，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。檢出限和定量限分別由3 倍信噪比和10 倍信噪比計(jì)算得到[27]。本研究黃曲霉毒素的檢出限在0.14～0.21 μg/kg之間，定量限在0.47～0.70 μg/kg之間。日內(nèi)精密度和日間精密度實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.3%～1.6%范圍之內(nèi)（表4），表明該儀器穩(wěn)定性良好、可靠性高。黃曲霉毒素在低、中、高3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率在82.6%～117.0%之間，RSD為2.8%～8.3%（表5），說(shuō)明該方法可靠。

圖4 AFG2、AFG1、AFB2、AFB1標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.4 Chromatograms of AFG2, AFG1, AFB2 and AFB1 standards

表3 黃曲霉毒素回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 3 regression equations, correlation coefficients and linear ranges for aflatoxin

表4 儀器日內(nèi)精密度和日間精密度（n=5）Table 4Intra-day precision and inter-day precision of the instrument (n= 5)

表5 辣椒粉中黃曲霉毒素加標(biāo)回收率Table 5 Spiked recoveries of four aflatoxins in chili powder

不同環(huán)境條件下培養(yǎng)8、16、25 d辣椒粉中黃曲霉毒素產(chǎn)生量見(jiàn)表6，共分析到AFB1、AFB2和AFG2三種真菌毒素。由表6可知，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，毒素累積量急劇增加。在溫度28 ℃、aw0.97、pH 4.5時(shí)黃曲霉毒素總量最高，達(dá)到143.65 μg/kg，遠(yuǎn)高于其在PDA培養(yǎng)基的產(chǎn)毒量[28]。由毒素種類看，AFB1的檢出量遠(yuǎn)高于AFB2和AFG2。應(yīng)用二階多項(xiàng)式方程描述辣椒粉中黃曲霉毒素總量黃曲霉毒素與培養(yǎng)條件的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表7，R2為0.976、RMSE為0.598，擬合效果良好。方差分析結(jié)果表明，pH值對(duì)黃曲霉毒素的影響不顯著，但溫度和aw對(duì)黃曲霉毒素影響極顯著，這一結(jié)論與黃曲霉菌株生長(zhǎng)規(guī)律一致。溫度一方面調(diào)控著黃曲霉菌三羧酸循環(huán)、脂肪酸生物合成、糖代謝、氨基酸代謝等初級(jí)代謝途徑，另一方面也影響著黃曲霉毒素生物合成路徑上相關(guān)酶的表達(dá)[29]。輕度脅迫能引發(fā)黃曲霉毒素的產(chǎn)生，但溫度過(guò)低（25 ℃）則阻抑毒素轉(zhuǎn)錄合成過(guò)程，溫度過(guò)高（37 ℃）則抑制部分結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[30-31]。水分含量也通過(guò)調(diào)控黃曲霉菌株的生長(zhǎng)發(fā)育及次級(jí)代謝影響著黃曲霉毒素的生物合成[32]。

表6 不同溫度、aw、酸堿度及培養(yǎng)時(shí)間下辣椒粉中黃曲霉毒素含量Table 6 Contents of aflatoxin in chili powder under different conditions of temperature, water activity, pH and culture time

表7 二階多項(xiàng)式模型擬合黃曲霉毒素動(dòng)力學(xué)的估計(jì)參數(shù)Table 7Estimated parameters of the second-order polynomial model for aflatoxin production

2.6 模型驗(yàn)證與評(píng)價(jià)

表8由Bf、Af及RMSE三個(gè)方面評(píng)價(jià)了辣椒粉中環(huán)境因子對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)及產(chǎn)毒量模型預(yù)測(cè)的能力，通常而言，Bf值在0.70～1.15，Af值在1.10～1.90時(shí)模型是可接受的[33]。修正的線性二階多項(xiàng)式模型的Bf為1.077 0，Af為1.131 9，RMSE為0.094 3。與Arrhenius-Davey模型和三階多項(xiàng)式模型相比，Bf和Af更接近于1，3 個(gè)模型的RMSE相差無(wú)幾，因此，本研究修正的線性二階多項(xiàng)式模型更優(yōu)地預(yù)測(cè)了環(huán)境因子對(duì)辣椒粉中黃曲霉比生長(zhǎng)速率的影響，這一研究結(jié)果在玉米基質(zhì)中也得到了證實(shí)[34]。此外，二階多項(xiàng)式模型能較好地描述辣椒粉中黃曲霉菌株產(chǎn)黃曲霉毒素的規(guī)律，數(shù)學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，Bf和Af分別為1.120 7和1.171 2，RMSE為0.128 7。圖5二階多項(xiàng)式模型的預(yù)測(cè)值與觀察值形成的數(shù)據(jù)點(diǎn)均勻分布在等價(jià)線兩側(cè)，顯示出較優(yōu)的相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)了上述模型預(yù)測(cè)結(jié)果。

表8 辣椒粉中黃曲霉生長(zhǎng)及黃曲霉毒素含量預(yù)測(cè)模型評(píng)價(jià)Table 8 Evaluation of the models for the growth of A.flavus and aflatoxin production in chili powder

圖5 黃曲霉最大徑向生長(zhǎng)速率（a）和黃曲霉毒素含量（b）觀察值與模型預(yù)測(cè)值驗(yàn)證Fig.5 Comparison of observed maximum radial growth rates of A.flavus (a) and aflatoxins (b) with model predicted values

3 結(jié) 論

本研究對(duì)環(huán)境條件溫度、aw及pH值對(duì)辣椒粉中黃曲霉菌生長(zhǎng)及黃曲霉毒素產(chǎn)生量的綜合影響構(gòu)建了預(yù)測(cè)模型，二階多項(xiàng)式模型表現(xiàn)出良好的整體性能，可作為可靠的預(yù)測(cè)模型。結(jié)果表明，溫度28 ℃、aw0.97、pH 4.5時(shí)，辣椒粉中黃曲霉菌的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)毒量均達(dá)到最大。溫度和aw顯著影響菌落的生長(zhǎng)和毒素產(chǎn)生，溫度28 ℃、aw＜0.85或溫度＞45 ℃的條件下菌株未能生長(zhǎng)，在此條件下貯藏辣椒粉可有效避免黃曲霉菌生長(zhǎng)及黃曲霉毒素產(chǎn)生，可為辣椒粉的安全儲(chǔ)藏及進(jìn)一步加工提供可供借鑒的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為延長(zhǎng)辣椒粉的貨架期提供理論依據(jù)。