趙 雪,靳欣迪,劉 斌,趙旭博
(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(楊凌),陜西 楊凌 712100)
辣椒粉是一種常見(jiàn)的香辛料,富含辣椒素、VC和胡蘿卜素等物質(zhì),其獨(dú)特的風(fēng)味及香氣特性深受廣大消費(fèi)者青睞,在世界各地廣泛種植。我國(guó)是辣椒種植、消費(fèi)及外貿(mào)大國(guó),所創(chuàng)造的經(jīng)濟(jì)價(jià)值位居蔬菜類商品第一。傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)操作習(xí)慣使得辣椒在收獲、加工及運(yùn)輸過(guò)程中極易受到霉菌污染[1]。霉菌污染不僅會(huì)降低辣椒品質(zhì),且在一定條件下,某些霉菌會(huì)產(chǎn)生高穩(wěn)定性的真菌毒素,一般的烹飪方法難以消除[2],這對(duì)喜好攝入辣椒產(chǎn)品人群的食品安全問(wèn)題構(gòu)成了巨大威脅。
真菌毒素目前已成為世界上最重要和最熱點(diǎn)的食品安全問(wèn)題之一,黃曲霉為好氧型腐生真菌,其產(chǎn)生的黃曲霉毒素為1類致癌物[3]。常見(jiàn)的有黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)、黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2,AFB2)、黃曲霉毒素G1(aflatoxin G1,AFG1)和黃曲霉毒素G2(aflatoxin G2,AFG2)4 種結(jié)構(gòu),其中AFB1毒性最強(qiáng),其具有肝毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性和致畸性[4]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織資料顯示,全球每年約有25%的農(nóng)作物因真菌毒素污染而被銷毀,其中香辛料也為真菌毒素易污染的食品,一些組織和國(guó)家相應(yīng)出臺(tái)了限量標(biāo)準(zhǔn)以降低由于香辛料攝入黃曲霉毒素對(duì)人類所構(gòu)成的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)。歐盟規(guī)定香辛料中AFB1和黃曲霉毒素總量最高限量值為5 μg/kg和10 μg/kg[5]。美國(guó)規(guī)定食品中黃曲霉毒素限量為20 μg/kg[6]。在中國(guó),除胡椒外,綠色食品香料及其產(chǎn)品中AFB1和黃曲霉毒素總量的最高限量為5 μg/kg和10 μg/kg[7]。盡管這些監(jiān)管措施能有效阻止受真菌毒素污染的香辛料進(jìn)入消費(fèi)市場(chǎng),但對(duì)進(jìn)入市場(chǎng)流通及消費(fèi)環(huán)節(jié)的香辛料,污染了霉菌后極可能在適宜的環(huán)境條件下繼續(xù)生長(zhǎng)并產(chǎn)生毒素,因此,采用環(huán)境因子控制黃曲霉的繼續(xù)繁殖生長(zhǎng)及毒素代謝累積,對(duì)保障辣椒粉的食品安全具有重要社會(huì)意義。
預(yù)測(cè)微生物學(xué)是20世紀(jì)80年代初起始的一門交叉性學(xué)科,它通過(guò)構(gòu)建數(shù)學(xué)模型模擬不同培養(yǎng)條件下微生物生長(zhǎng)[8]。21世紀(jì)以來(lái),隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅猛發(fā)展,針對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的研究漸多[9-10]。Marín等[11]設(shè)計(jì)了含水量(10%~30%)和溫度(10~42 ℃)實(shí)驗(yàn),預(yù)測(cè)了黃曲霉菌株在開(kāi)心果中的生長(zhǎng)速率及毒素量,結(jié)果表明當(dāng)開(kāi)心果貯存溫度20 ℃、含水量高于10%時(shí),30 d內(nèi)黃曲霉毒素含量超過(guò)歐盟最大限量值。Mousa等[12]模擬了黃曲霉在糙米和精米上的徑向生長(zhǎng)速率,評(píng)估了黃曲霉毒素與水分活度(aw,0.82~0.92)及溫度(12~42 ℃)的關(guān)系,結(jié)果表明線性Arrhenius-Davey模型擬合預(yù)測(cè)優(yōu)于Polynomial模型,且糙米較精米更利于菌株生長(zhǎng)及毒素產(chǎn)生。本研究以辣椒中分離的產(chǎn)毒黃曲霉菌為研究對(duì)象,對(duì)不同溫度、aw及pH值條件下辣椒粉中黃曲霉菌的徑向生長(zhǎng)變化及黃曲霉毒素累積量進(jìn)行分析,采用Baranyi and Roberts模型構(gòu)建生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)初級(jí)模型,對(duì)比二階多項(xiàng)式模型、Arrhenius模型和三階多項(xiàng)式的生長(zhǎng)擬合效果,構(gòu)建黃曲霉菌的二階多項(xiàng)式產(chǎn)毒動(dòng)力學(xué)模型。旨在為辣椒及辣椒粉生產(chǎn)、貯運(yùn)等環(huán)節(jié)中的環(huán)境因素控制及保障食品安全提供參考依據(jù)。
干辣椒購(gòu)于超市,粉碎后過(guò)40 目標(biāo)準(zhǔn)篩,4 ℃冷藏備用。
AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司;乙腈(色譜純) 德國(guó)Merck公司;氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀(均為分析純)中國(guó)上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司;氯霉素 上??ㄅ锟萍加邢薰?;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth,PDB) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;真菌基因組DNA提取試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司。
JYL-A070萬(wàn)能粉碎機(jī) 濟(jì)南九陽(yáng)有限公司;IS128 pH計(jì) 上海儀邁儀器科技有限公司;DYY-6C電子天平北京市六一儀器廠;SB-5200DT超凈工作臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)公司;86-1霉菌培養(yǎng)箱 上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Aqualab Pawkit水分活度儀 美國(guó)Meter公司;LC-10AT高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司;熒光檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司;Cloversi-C18色譜柱 瑞典Akzo Nobel公司;IAC-SEP?黃曲霉毒素總量免疫親和柱中檢維康生物技術(shù)有限公司。
1.3.1 黃曲霉菌的分離與純化
取15.0 g辣椒樣品放入盛有135 mL無(wú)菌水的錐形瓶中,封口后,將錐形瓶置于100 r/min的恒溫?fù)u床中,振蕩20 min。隨后,梯度稀釋,取各稀釋度的菌懸液100 μL均勻涂布到含1‰氯霉素的PDA平板上,28 ℃培養(yǎng)4 d。挑取菌落形態(tài)不同的菌株反復(fù)純化,直到得到單一菌株。
1.3.2 黃曲霉菌分子生物學(xué)鑒定
基因組DNA提?。?jiǎn)我痪浣臃N于PDB培養(yǎng)基中,28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)3 d,按照試劑盒說(shuō)明提取各菌株DNA。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增:采用通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增菌株ITS序列。引物序列為ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’,ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。反應(yīng)體系為ddH2O 6.0 μL、ITS1/ITS4引物各1.0 μL、PCR Supermix 10.0 μL、基因組DNA 2.0 μL。擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min;55 ℃退火1 min;72 ℃延伸1 min;擴(kuò)增循環(huán)36 次,72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):電泳時(shí)間20 min、電壓120 V、電流300 mA、功率250 W?;厥誔CR產(chǎn)物,由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,拼接結(jié)果經(jīng)Nucleotide BLAST核酸比對(duì),選取序列相似度最高的菌株作為鑒定結(jié)果。
1.3.3 黃曲霉菌產(chǎn)毒力檢測(cè)
黃曲霉菌株以單點(diǎn)點(diǎn)植法接種于3 個(gè)PDA平板上,28 ℃培養(yǎng)7 d。用打孔器分別在每個(gè)板的菌落中心、中間及邊緣各取2 塊帶瓊脂塊的菌落,并轉(zhuǎn)移至裝有6 mL色譜純甲醇的離心管中。渦旋振蕩5 min后,3 500 r/min離心3 min,上清液即為待測(cè)液。
1.3.4 色譜條件
Cloversi-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相甲醇-水(45∶55,V/V);流速1.0 mL/min;熒光檢測(cè)器,激發(fā)波長(zhǎng)360 nm,發(fā)射波長(zhǎng)440 nm;進(jìn)樣體積20 μL。
1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1和AFG2)標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶于色譜甲醇中,配制成含量分別為1.0、2.0、4.0、20.0、100.0 μg/kg和200.0 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于4 ℃避光保存。
1.3.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
采用溫度為20、28、37、45 ℃,aw為0.85、0.90、0.93和0.97及pH值為4.5、5.0和5.5的環(huán)境因子設(shè)計(jì),監(jiān)測(cè)黃曲霉在辣椒粉中的生長(zhǎng)及產(chǎn)毒量。
1.3.7 孢子懸液制備
將黃曲霉菌株接種于PDA培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)5 d后,在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌水沖洗菌落,4 層脫脂棉紗布過(guò)濾掉菌絲,使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù),并用無(wú)菌水調(diào)整至105CFU/mL用于接種。配制的孢子懸液保存于4 ℃冰箱中。
1.3.8 生長(zhǎng)基質(zhì)
稱取5.0 g辣椒粉于9 個(gè)盛有45 mL蒸餾水的錐形瓶中(3 個(gè)平行),充分渦旋振蕩,用HCl/NaOH溶液將提取液pH值分別調(diào)整為4.5、5.0和5.5,并記錄使用量,根據(jù)各個(gè)pH值水平的平均使用量計(jì)算后續(xù)添加量。以初始含水量(5.48±0.31)%(干基)、aw0.645±0.027、pH 5.1±0.07的空白辣椒粉為生長(zhǎng)基質(zhì)。為確保無(wú)霉菌污染,于24 個(gè)1 L錐形瓶中分別裝入275 g辣椒粉,121 ℃高壓滅菌20 min。根據(jù)辣椒粉的吸附等溫線計(jì)算各aw應(yīng)加水量,水量減去各pH值水平下應(yīng)加HCl/NaOH溶液量作為實(shí)際加水量,最終得到3 個(gè)pH值和4 個(gè)aw組合的辣椒粉?;旌虾髽悠焚A存于4 ℃冰箱3 d,每間隔6 h混勻一次,以使辣椒粉充分達(dá)到平衡,最終的aw由水分活度儀測(cè)定。
1.3.9 接種及菌落生長(zhǎng)測(cè)定
將辣椒粉無(wú)菌移至培養(yǎng)皿(每瓶24 個(gè)皿),壓實(shí)形成單層。接種10 μL孢子懸液至每皿中心。在3 個(gè)pH值水平下隨機(jī)抽取12 個(gè)aw相同的平板放入無(wú)菌塑封帶,袋內(nèi)有裝有特定甘油水溶液燒杯,以保持容器中大氣的相對(duì)濕度與辣椒粉的aw相同。裝有培養(yǎng)皿的塑封袋放置在4 個(gè)不同溫度水平的培養(yǎng)箱中。連續(xù)25 d采用電子數(shù)字卡尺在正交方向上進(jìn)行直徑測(cè)量,各條件下6 個(gè)平板的均值即為該時(shí)刻菌落直徑。
1.3.10 黃曲霉毒素檢測(cè)
培養(yǎng)至第8、16天和25天時(shí),每個(gè)培養(yǎng)條件下隨機(jī)抽取3 個(gè)平板檢測(cè)辣椒粉中的黃曲霉毒素含量,以均值作為最終結(jié)果。
1.3.10.1 樣品檢測(cè)
準(zhǔn)確稱取2.5 g粉碎樣品于50 mL離心管中,加入25 mL乙腈-水(80∶20,V/V),以70 r/min速率振蕩30 min后,3 500 r/min離心3 min。槽紋濾紙過(guò)濾上清液至10 mL離心管中后,取3 mL濾液加入27 mL 5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)混勻,調(diào)節(jié)pH值至7,用玻璃纖維濾紙過(guò)濾。將IAC-SEP?黃曲霉毒素總量免疫親和柱連接于20 mL玻璃注射器下,準(zhǔn)確移取濾液20 mL注入玻璃注射器中,將空氣壓力泵與玻璃注射器連接,調(diào)節(jié)壓力使溶液以1~2 滴/s的速率通過(guò)親和柱,直至空氣吹出柱內(nèi)全部液體,再用10 mL超純水以1~2 滴/s淋洗親和柱直至空氣吹出柱內(nèi)全部液體。最后用1.0 mL色譜級(jí)甲醇以1~2 滴/s的流速淋洗親和柱,將全部淋洗液收集于玻璃試管中,渦旋混勻,待測(cè)。色譜條件與1.3.3節(jié)黃曲霉菌產(chǎn)毒力檢測(cè)部分所用條件相同。
1.3.10.2 精密度
采用10 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試儀器的精密度,每3 h進(jìn)樣一次進(jìn)行儀器的日內(nèi)精密度測(cè)量,同一時(shí)間點(diǎn)連續(xù)5 d進(jìn)樣測(cè)量?jī)x器日間精密度。
1.3.10.3 加標(biāo)回收
空白辣椒粉中加入2.0、4.0、20.0 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)水平平行測(cè)定6 次。
數(shù)據(jù)用Excel 2010、Origin 9.1以及Design Expert 8.0軟件進(jìn)行相關(guān)計(jì)算與繪圖。
1.4.1 黃曲霉菌生長(zhǎng)模型擬合
1.4.1.1 初級(jí)模型擬合
采用Baranyi and Roberts彈性生長(zhǎng)函數(shù)進(jìn)行黃曲霉菌生長(zhǎng)的非線性回歸擬合,其模型如下[13]:
式中:y為菌落半徑/mm;y0為初始菌落半徑/mm;ymax為最大菌落半徑/mm;μmax為菌落最大徑向生長(zhǎng)率/(mm/d);λ為滯后期/d;t為時(shí)間/d。
1.4.1.2 二級(jí)模型擬合
用修正的二階多項(xiàng)式模型、Arrhenius-Davey模型及三階多項(xiàng)式模型擬合溫度、aw及pH值對(duì)菌落生長(zhǎng)速率(μ)的影響[14-16]。
1)二階多項(xiàng)式模型
為獲得更優(yōu)擬合效果,對(duì)aw作如下變換[17]:
則二階多項(xiàng)式模型變?yōu)椋?/p>
式中:T為溫度/℃;aw為水分活度;pH為酸堿度;a0~a9為非線性回歸估計(jì)系數(shù)。
2)Arrhenius-Davey模型
將pH值引入Arrhenius-Davey方程后,表達(dá)式如下:
式中:T為溫度/℃;aw為水分活度;pH為酸堿度;a0~a6分別為非線性回歸估計(jì)系數(shù)。
3)三階多項(xiàng)式模型
式中:T為溫度/℃;aw為水分活度;pH為酸堿度;a0~a10為非線性回歸估計(jì)的系數(shù)。
1.4.2 黃曲霉毒素產(chǎn)生量模型擬合
采用二階多項(xiàng)式方程進(jìn)行溫度、aw及pH值對(duì)黃曲霉毒素產(chǎn)生量的影響描述。擬合模型具有如下形式[16]:
式中:Aflatoxins為黃曲霉毒素總量/(μg/kg);T為溫度/℃;aw為水分活度;pH為酸堿度;t為培養(yǎng)時(shí)間/d;a0~a14為非線性回歸估計(jì)的系數(shù)。
1.4.3 模型驗(yàn)證與評(píng)價(jià)
設(shè)計(jì)重復(fù)實(shí)驗(yàn),用同樣的方法,將28、37 ℃實(shí)驗(yàn)條件下辣椒粉中黃曲霉菌的實(shí)際生長(zhǎng)速率及產(chǎn)毒量與所建立動(dòng)力學(xué)模型的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較分析,進(jìn)行模型有效性和可靠性的驗(yàn)證。采用Ross[18]提出的偏差因子(Bf)、準(zhǔn)確度因子(Af)及均方根誤差(root mean square error,RMSE)評(píng)價(jià)構(gòu)建模型性能。
式中:n為觀察值數(shù)量;DF為自由度。
Bf、Af及RMSE是評(píng)估數(shù)學(xué)模型常用數(shù)學(xué)指標(biāo)[19]。Bf越接近1,表明模型預(yù)測(cè)值與觀察值越相符。Af表示預(yù)測(cè)值與觀察值間的平均偏差,Af=1,表明所有預(yù)測(cè)值和觀察值均相等;Af值越大,該模型預(yù)測(cè)的平均精確度越低。RMSE反映預(yù)測(cè)值與觀察值的離散程度,RMSE值越小,表示測(cè)量精度越高。
黃曲霉菌株培養(yǎng)5 d后呈現(xiàn)出黃綠色,并產(chǎn)生分生孢子(圖1)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明該菌株在600 bp左右出現(xiàn)特異性條帶。NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為MN511742.1的黃曲霉ITS區(qū)段DNA序列與未知菌株的同源性為99.83%(578/579),比較得分為1 064 bits,隨機(jī)搜索概率為0.0。因此,認(rèn)定該菌株為黃曲霉菌。高效液相色譜法測(cè)得該菌株此時(shí)的產(chǎn)毒量為51.4 μg/kg。
圖1 黃曲霉菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of Aspergillus flavus in PDA medium
由圖2可見(jiàn),同一溫度下辣椒粉的平衡含水量隨aw的增加而上升,aw低于0.5時(shí),吸附等溫線上升平緩,aw高于0.5時(shí),隨aw增加平衡含水量增長(zhǎng)加快。根據(jù)曲線趨勢(shì)可判定辣椒粉吸附等溫線為第III型等溫線,與花生殼/仁吸附等溫線類型一致[20]。
圖2 辣椒粉不同溫度下的吸附等溫線Fig.2 Moisture sorption isotherms of chili powder at different temperatures
不同溫度、aw及酸堿度組合下,黃曲霉菌的最大徑向生長(zhǎng)速率如表1所示。從培養(yǎng)條件觀察,本實(shí)驗(yàn)中最大徑向生長(zhǎng)速率隨溫度的升高先增大后減小,最適溫度為28~37 ℃;aw與菌株生長(zhǎng)率呈正相關(guān),aw為0.97時(shí)達(dá)最大;pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)影響較小。在溫度28 ℃、aw0.97、pH 4.5時(shí),最大徑向生長(zhǎng)速率最大(11.73 mm/d),大于黃曲霉在黑胡椒(7.25 mm/d)、水稻(6.51 mm/d)的生長(zhǎng)數(shù)據(jù),這可能是由于培養(yǎng)基差異造成菌株碳氮利用率及糖代謝速度不同所致[21]。此外,溫度在20~37 ℃范圍之外,或溫度適宜但aw小于0.90時(shí),黃曲霉菌株生長(zhǎng)較緩。溫度低于20 ℃、aw小于0.85或溫度高于45 ℃時(shí),黃曲霉菌不生長(zhǎng)。
表1 不同溫度、aw和酸堿度下黃曲霉菌最大徑向生長(zhǎng)速率Table 1 Maximum radial growth rates of A.flavus under different temperature, water activity and pH conditions
用3 種不同模型量化了黃曲霉生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境變量的響應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)誤差、測(cè)定系數(shù)(R2)及RMSE如表2所示??梢?jiàn)二階多項(xiàng)式模型的R2值最高(0.991),RMSE值最?。?.069),其次為三階多項(xiàng)式模型和Arrhenius-Davey模型,表明修正的二階多項(xiàng)式模型能更好地描述溫度、aw及pH值對(duì)生長(zhǎng)速率的影響。圖3為二階多項(xiàng)式模型的預(yù)測(cè)結(jié)果響應(yīng)面圖,反映出pH值對(duì)最大徑向生長(zhǎng)速率的影響可忽略不計(jì),這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)選取的酸堿度范圍較小所致;曲率出現(xiàn)在25~35 ℃范圍,表明辣椒粉中黃曲霉菌的最適生長(zhǎng)溫度為此溫度,與小麥粉中霉菌的研究結(jié)果類似[22];由aw分析,菌株最大徑向生長(zhǎng)速率隨aw的增加而增大,谷物中也存在aw越高,真菌生長(zhǎng)越快的規(guī)律[23],相關(guān)研究已證實(shí)真菌的最適aw為0.974~0.987[24]。此外,溫度和aw顯著影響辣椒粉中黃曲霉菌生長(zhǎng),此協(xié)同作用在其他霉菌中同樣被觀察到[25-26]。
表2 黃曲霉菌生長(zhǎng)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的估計(jì)參數(shù)Table 2 Estimated parameters of the secondary kinetic model for A.flavus growth
圖3 二階多項(xiàng)式模型預(yù)測(cè)對(duì)黃曲霉菌最大徑向生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plots for the second-order polynomial model predicting the effect of temperature, water activity and pH on the maximum radial growth rate of A.flavus
AFG2、AFG1、AFB2、AFB1平均保留時(shí)間分別為(10.165±0.1)、(11.598±0.1)、(12.865±0.1)min和(14.932±0.1)min(圖4)。表3為標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程,相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999 8,表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。檢出限和定量限分別由3 倍信噪比和10 倍信噪比計(jì)算得到[27]。本研究黃曲霉毒素的檢出限在0.14~0.21 μg/kg之間,定量限在0.47~0.70 μg/kg之間。日內(nèi)精密度和日間精密度實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)在0.3%~1.6%范圍之內(nèi)(表4),表明該儀器穩(wěn)定性良好、可靠性高。黃曲霉毒素在低、中、高3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率在82.6%~117.0%之間,RSD為2.8%~8.3%(表5),說(shuō)明該方法可靠。
圖4 AFG2、AFG1、AFB2、AFB1標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.4 Chromatograms of AFG2, AFG1, AFB2 and AFB1 standards
表3 黃曲霉毒素回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 3 regression equations, correlation coefficients and linear ranges for aflatoxin
表4 儀器日內(nèi)精密度和日間精密度(n=5)Table 4Intra-day precision and inter-day precision of the instrument (n= 5)
表5 辣椒粉中黃曲霉毒素加標(biāo)回收率Table 5 Spiked recoveries of four aflatoxins in chili powder
不同環(huán)境條件下培養(yǎng)8、16、25 d辣椒粉中黃曲霉毒素產(chǎn)生量見(jiàn)表6,共分析到AFB1、AFB2和AFG2三種真菌毒素。由表6可知,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),毒素累積量急劇增加。在溫度28 ℃、aw0.97、pH 4.5時(shí)黃曲霉毒素總量最高,達(dá)到143.65 μg/kg,遠(yuǎn)高于其在PDA培養(yǎng)基的產(chǎn)毒量[28]。由毒素種類看,AFB1的檢出量遠(yuǎn)高于AFB2和AFG2。應(yīng)用二階多項(xiàng)式方程描述辣椒粉中黃曲霉毒素總量黃曲霉毒素與培養(yǎng)條件的關(guān)系,結(jié)果見(jiàn)表7,R2為0.976、RMSE為0.598,擬合效果良好。方差分析結(jié)果表明,pH值對(duì)黃曲霉毒素的影響不顯著,但溫度和aw對(duì)黃曲霉毒素影響極顯著,這一結(jié)論與黃曲霉菌株生長(zhǎng)規(guī)律一致。溫度一方面調(diào)控著黃曲霉菌三羧酸循環(huán)、脂肪酸生物合成、糖代謝、氨基酸代謝等初級(jí)代謝途徑,另一方面也影響著黃曲霉毒素生物合成路徑上相關(guān)酶的表達(dá)[29]。輕度脅迫能引發(fā)黃曲霉毒素的產(chǎn)生,但溫度過(guò)低(25 ℃)則阻抑毒素轉(zhuǎn)錄合成過(guò)程,溫度過(guò)高(37 ℃)則抑制部分結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[30-31]。水分含量也通過(guò)調(diào)控黃曲霉菌株的生長(zhǎng)發(fā)育及次級(jí)代謝影響著黃曲霉毒素的生物合成[32]。
表6 不同溫度、aw、酸堿度及培養(yǎng)時(shí)間下辣椒粉中黃曲霉毒素含量Table 6 Contents of aflatoxin in chili powder under different conditions of temperature, water activity, pH and culture time
表7 二階多項(xiàng)式模型擬合黃曲霉毒素動(dòng)力學(xué)的估計(jì)參數(shù)Table 7Estimated parameters of the second-order polynomial model for aflatoxin production
表8由Bf、Af及RMSE三個(gè)方面評(píng)價(jià)了辣椒粉中環(huán)境因子對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)及產(chǎn)毒量模型預(yù)測(cè)的能力,通常而言,Bf值在0.70~1.15,Af值在1.10~1.90時(shí)模型是可接受的[33]。修正的線性二階多項(xiàng)式模型的Bf為1.077 0,Af為1.131 9,RMSE為0.094 3。與Arrhenius-Davey模型和三階多項(xiàng)式模型相比,Bf和Af更接近于1,3 個(gè)模型的RMSE相差無(wú)幾,因此,本研究修正的線性二階多項(xiàng)式模型更優(yōu)地預(yù)測(cè)了環(huán)境因子對(duì)辣椒粉中黃曲霉比生長(zhǎng)速率的影響,這一研究結(jié)果在玉米基質(zhì)中也得到了證實(shí)[34]。此外,二階多項(xiàng)式模型能較好地描述辣椒粉中黃曲霉菌株產(chǎn)黃曲霉毒素的規(guī)律,數(shù)學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示,Bf和Af分別為1.120 7和1.171 2,RMSE為0.128 7。圖5二階多項(xiàng)式模型的預(yù)測(cè)值與觀察值形成的數(shù)據(jù)點(diǎn)均勻分布在等價(jià)線兩側(cè),顯示出較優(yōu)的相關(guān)性,進(jìn)一步證實(shí)了上述模型預(yù)測(cè)結(jié)果。
表8 辣椒粉中黃曲霉生長(zhǎng)及黃曲霉毒素含量預(yù)測(cè)模型評(píng)價(jià)Table 8 Evaluation of the models for the growth of A.flavus and aflatoxin production in chili powder
圖5 黃曲霉最大徑向生長(zhǎng)速率(a)和黃曲霉毒素含量(b)觀察值與模型預(yù)測(cè)值驗(yàn)證Fig.5 Comparison of observed maximum radial growth rates of A.flavus (a) and aflatoxins (b) with model predicted values
本研究對(duì)環(huán)境條件溫度、aw及pH值對(duì)辣椒粉中黃曲霉菌生長(zhǎng)及黃曲霉毒素產(chǎn)生量的綜合影響構(gòu)建了預(yù)測(cè)模型,二階多項(xiàng)式模型表現(xiàn)出良好的整體性能,可作為可靠的預(yù)測(cè)模型。結(jié)果表明,溫度28 ℃、aw0.97、pH 4.5時(shí),辣椒粉中黃曲霉菌的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)毒量均達(dá)到最大。溫度和aw顯著影響菌落的生長(zhǎng)和毒素產(chǎn)生,溫度28 ℃、aw<0.85或溫度>45 ℃的條件下菌株未能生長(zhǎng),在此條件下貯藏辣椒粉可有效避免黃曲霉菌生長(zhǎng)及黃曲霉毒素產(chǎn)生,可為辣椒粉的安全儲(chǔ)藏及進(jìn)一步加工提供可供借鑒的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),同時(shí)為延長(zhǎng)辣椒粉的貨架期提供理論依據(jù)。