蘇德森，鄭云云，陳自強(qiáng)，吳建衍，黃崇耀

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003）

金柑，別名金橘，皮嫩脆，具有油脂清香刺激性特殊氣味，富含VC、胡蘿卜素，深受人們喜愛(ài)[1-3]。適當(dāng)攝取金柑，對(duì)防治咽喉腫痛、咳痰、胸悶腹脹等身體不適癥狀具有良好的效果[4-5]。然而，由于金柑皮薄、水分高，因此不易保存。最常用、最經(jīng)濟(jì)的保鮮方式需要使用化學(xué)試劑[6-8]。

咪鮮胺又稱撲霉靈、丙滅菌、施?？?，是咪唑類廣譜農(nóng)藥殺菌劑，其抑制麥角甾醇的生物合成，對(duì)多種作物子囊菌和半知菌病害的防效顯著，其可防治稻瘟病、葉斑病、赤霉病、炭疽病、褐斑病、蒂腐病、青綠霉病、黑腐病等病害[9-10]。同時(shí)，咪鮮胺是柑橘采后保鮮的浸果藥劑[11-12]。咪鮮胺在水果中緩慢降解，最終代謝產(chǎn)物為2,4,6-三氯苯酚[13-15]。2,4,6-三氯苯酚在脂質(zhì)組織中累積會(huì)影響人的神精系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)患白血病和淋巴瘤等疾病[16-17]。2,4,6-三氯苯酚易造成環(huán)境污染[18]，美國(guó)環(huán)保署已經(jīng)把三氯苯酚列入環(huán)境污染物清單中[19]。

蘋果[20]、香蕉[21]、溫州蜜柑果實(shí)[22]、柑橘果實(shí)[23]、楊梅和楊梅酒[24]等水果及其加工產(chǎn)品在貯藏過(guò)程中的咪鮮胺殘留降解已有報(bào)道。金柑為可食皮類水果，與只可吃果肉的水果相比，金柑對(duì)人體的暴露風(fēng)險(xiǎn)更高，更應(yīng)引起關(guān)注。然而，浸果保鮮處理后，咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚在金柑中的殘留隨貯藏時(shí)間消解變化及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)中的金柑經(jīng)3 種質(zhì)量濃度咪鮮胺溶液、2 種浸泡時(shí)間進(jìn)行保鮮處理。實(shí)驗(yàn)建立氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定金柑中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚含量的方法，并采用該方法分別測(cè)定室溫貯藏2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d金柑樣品中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的含量，分析不同浸泡質(zhì)量濃度和浸泡時(shí)間的處理對(duì)金柑中咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚殘留量的影響及其隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)特征，并評(píng)估浸果安全期后金柑中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的慢性和急性膳食風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金柑于2019年1月22—23日采摘自福建省尤溪縣管前鎮(zhèn)。

乙酸乙酯、丙酮、正己烷（均為色譜純），氯化鈉、硫酸鎂、PSA、碳黑（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑發(fā)展有限公司；咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均大于98%） 北京振翔有限公司；咪鮮胺水乳劑（質(zhì)量濃度為450 g/L） 江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-TQ8050氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀、Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 日本島津公司；MS3 basic高速渦旋振蕩儀 德國(guó)IKA公司；FW100粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；AL204天平瑞士梅特勒-托利多公司；Anke TDL-5A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；turboVap LV全自動(dòng)樣品濃縮儀 瑞典Biotage有限公司；PD500-TP均質(zhì)機(jī) 英國(guó)PRIMA公司。

1.3 方法

1.3.1 浸果保鮮處理

挑選完整無(wú)缺陷、無(wú)蟲咬、無(wú)破損的金柑42.0 kg（約1 680 枚）作為備用樣品，每次浸果用樣品3.5 kg（約140 枚）。咪鮮胺浸泡液配制方法：將質(zhì)量濃度450 g/L的咪鮮胺水乳劑用自來(lái)水分別稀釋至1 000、500、167 倍，其質(zhì)量濃度為450、900、2 700 mg/L。將金柑樣品完全浸入咪鮮胺浸泡液中，每個(gè)質(zhì)量濃度分別取浸泡2、5 min的樣品；對(duì)照樣品直接用自來(lái)水浸泡。每處理3 次重復(fù)（每種質(zhì)量濃度浸泡液平均分成3 份，每份浸泡液?jiǎn)为?dú)浸泡金柑，即獲得3 份重復(fù)實(shí)驗(yàn)樣品），樣品撈起自然晾干后，置于室內(nèi)20～25 ℃貯藏。

1.3.2 樣品制備

保鮮取樣方法按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，分別取浸泡后室溫貯藏2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d的樣品。金柑樣品去除柄，取全果，用粉碎機(jī)磨碎，樣品－20 ℃冷凍貯存。

1.3.3 樣品提取與凈化

稱取樣品10 g，精確至0.01 g于50 mL離心管中。加入20 mL乙酸乙酯-正己烷（1∶1，V/V），加1 g NaCl均質(zhì)處理0.5 min，加4 g MgSO4，再均質(zhì)處理0.5 min，于室溫、4 000 r/min離心3 min。移取上清液8 mL于10 mL離心管，氮?dú)獯抵良s1 mL。加入150 mg PSA、100 mg碳黑，旋渦振蕩1 min至溶液無(wú)色，用乙酸乙酯正己烷溶液定容至2 mL。取上清液1.0 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)行GC-MS/MS上機(jī)測(cè)試。

1.3.4 儀器條件

氣相色譜條件：程序升溫，于50 ℃保持1 min，以40 ℃/min的速率升至200 ℃，再以15 ℃/min的速率升至250 ℃并保持3 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，恒壓流量控制120 kPa。

質(zhì)譜條件：電子電離源，電離能量：70 eV，離子源溫度：200 ℃，接口溫度：250 ℃。

表1 咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol

1.4 數(shù)據(jù)處理

GC-MS/MS測(cè)定數(shù)據(jù)由GCMSsolution 4.3軟件處理。農(nóng)藥慢性、急性膳食風(fēng)險(xiǎn)按式（1）、（2）計(jì)算。

式中：HQc為慢性攝入風(fēng)險(xiǎn)；STMR為農(nóng)藥殘留值；F為產(chǎn)品消費(fèi)量，柑橘類水果為0.025 8 kg/d[25]；m為人群平均體質(zhì)量，成年人為60 kg；ADI為每日允許攝入量，咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚總和，以咪鮮胺計(jì)為0.01 mg/kg[26]。HQa為急性攝入風(fēng)險(xiǎn)；LP為食品的最大消費(fèi)量，柑橘為1.8678 kg/d[25]；HR為最高殘留量；ARfD為急性參考劑量，0.1 mg/kg[27]。HQc小于等于100.0%或HQa小于等于100.0%表示可接受的風(fēng)險(xiǎn)，HQc大于100%或HQa大于100.0%表示風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的確認(rèn)

通過(guò)樣品加標(biāo)逐級(jí)稀釋的方法信噪比為3時(shí)，確定檢出限（limit of detection，LOD），信噪比為10時(shí)確定定量限（limit of quantitation，LOQ）。當(dāng)本實(shí)驗(yàn)中咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚的LOD分別為1.70、0.68 μg/kg，LOQ分別為5.0、2.0 μg/kg。水果蔬菜中咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚的測(cè)定方法已有報(bào)道，其中采用氣相色譜儀測(cè)定咪鮮胺衍生物的LOD為5 μg/kg[28]，GC-MS/MS法直接測(cè)定咪鮮胺的LOD為辣椒3.3 μg/kg、水果4 μg/kg，2,4,6-三氯苯酚的LOD為辣椒3.3 μg/kg、水果5 μg/kg[29-30]。本實(shí)驗(yàn)的LOD能滿足金柑中咪鮮胺及低含量2,4,6-三氯苯酚的測(cè)定。

以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。咪鮮胺Y=3 763.645X－69 594.76，R2=0.996 7；2,4,6-三氯苯酚Y=13 535.01X－12 515.16，R2=0.999 2。方法線性相關(guān)系數(shù)R2大于0.996 7。

準(zhǔn)確度和精密度通過(guò)向未檢出咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚的金柑樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液評(píng)估。咪鮮胺添加50、100、500 μg/kg共3 個(gè)水平，2,4,6-三氯苯酚添加20、50、150 μg/kg共3 個(gè)水平，每個(gè)濃度水平測(cè)定7 次，測(cè)定回收率。

咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚的平均加標(biāo)回收率分別為95.7%、98.1%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為5.14%、3.89%。加標(biāo)量的回收率和精密度能滿足本研究要求。

表2 金柑中咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚的加標(biāo)回收率及精密度Table 2 Recoveries and precision for prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol in spiked kumquats

2.2 金柑中咪鮮胺的殘留動(dòng)態(tài)

實(shí)驗(yàn)分別比較450、900、2 700 mg/L共3 種浸泡質(zhì)量濃度，于2、5 min浸泡時(shí)間的金柑中測(cè)定咪鮮胺的殘留消解動(dòng)態(tài)，結(jié)果如圖1所示，3 種質(zhì)量濃度浸果處理金柑中咪鮮胺的殘留量較高。在貯藏21 d內(nèi)，咪鮮胺的殘留量均大于等于7.44 mg/kg，2 700 mg/L的高質(zhì)量濃度浸果處理的殘留量更高，均大于10 mg/kg，其超出GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)柑橘類水果的最大殘留限量值[26]。浸泡濃度越高、浸泡時(shí)間越長(zhǎng)，金柑中的咪鮮胺殘留量也越高。所以，在保證保鮮效果的前提下，應(yīng)降低浸泡濃度和減少浸泡時(shí)間。

圖1 咪鮮胺浸泡質(zhì)量濃度和時(shí)間對(duì)金柑中咪鮮胺殘留的動(dòng)態(tài)影響（n=3）Fig.1 Residual dynamics of prochloraz in kumquats dipped in prochloraz solutions of different concentrations for different periods of time (n = 3)

在20～25 ℃室溫貯藏，金柑中的咪鮮胺含量先升高后降低，第3天達(dá)到峰值，450、900、2 700 mg/L咪鮮胺浸泡2 min的金柑中咪鮮胺含量分別達(dá)到9.66、12.22、15.43 mg/kg。第3天后，咪鮮胺殘留量降低緩慢。按照農(nóng)藥登記推薦使用方法（450 mg/L浸果2 min）處理金柑，在農(nóng)藥登記第14天的安全間隔期時(shí)，金柑中咪鮮胺的殘留量為8.18 mg/kg，小于最大殘留限量值10 mg/kg。若高于推薦質(zhì)量濃度的900、2 700 mg/L分別浸果2 min處理，第14天金柑中咪鮮胺殘留量均高于最大殘留限量值。說(shuō)明金柑咪鮮胺浸果處理應(yīng)嚴(yán)格控制浸泡液濃度，按照推薦濃度或低于推薦濃度浸果處理，金柑的生產(chǎn)質(zhì)量安全才能符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 金柑中2,4,6-三氯苯酚含量的動(dòng)態(tài)變化

如圖2所示，咪鮮胺浸泡的質(zhì)量濃度和時(shí)間均是影響金柑中2,4,6-三氯苯酚殘留的因素。按照咪鮮胺農(nóng)藥登記使用說(shuō)明方法（450 mg/L浸泡2 min）處理，浸泡后2 h，金柑中2,4,6-三氯苯酚的殘留量為0.028 mg/kg，結(jié)果與Fang Qingkui等[20]以相同濃度處理的蘋果中2,4,6-三氯苯酚殘留水平相當(dāng)。浸泡質(zhì)量濃度越高、時(shí)間越長(zhǎng)，金柑中的2,4,6-三氯苯酚殘留量越大，當(dāng)用質(zhì)量濃度為2 700 mg/L的咪鮮胺浸泡5 min時(shí)，金柑中2,4,6-三氯苯酚殘留量達(dá)到0.093 mg/kg。此外，2,4,6-三氯苯酚含量與咪鮮胺含量呈正相關(guān)，金柑中咪鮮胺含量高，其2,4,6-三氯苯酚的含量也高，因此2,4,6-三氯苯酚是咪鮮胺的分解產(chǎn)物。

圖2 咪鮮胺浸泡質(zhì)量濃度和時(shí)間對(duì)金柑中2,4,6-三氯苯酚殘留的動(dòng)態(tài)影響（n=3）Fig.2 Residual dynamics of 2,4,6-trichlorophenol in kumquats dipped in prochloraz solutions of different concentrations for different periods of time (n = 3)

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，金柑中2,4,6-三氯苯酚殘留量逐漸增加，直至21 d，2,4,6-三氯苯酚殘留量仍在增加，2 700 mg/L咪鮮胺浸泡5 min的2,4,6-三氯苯酚殘留量達(dá)0.152 mg/kg，此結(jié)果與Fang Qingkui等[20]得出蘋果中2,4,6-三氯苯酚濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加的結(jié)果類似。因?yàn)?,4,6-三氯苯酚具有致癌性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在環(huán)境中不易降解，其被美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局（United States Environmental Protection Agency，USEPA）列入環(huán)境污染物清單中，USEPA在飲用水中標(biāo)識(shí)其風(fēng)險(xiǎn)質(zhì)量濃度為3.1×10－7μg/L[19]。然而，目前為止，我國(guó)尚未對(duì)食品中2,4,6-三氯苯酚的最大殘留量進(jìn)行限定。所以，從金柑以及其他水果中2,4,6-三氯苯酚的殘留累積效應(yīng)及其對(duì)人體造成的危害方面考慮，應(yīng)制定水果中2,4,6-三氯苯酚最高限量標(biāo)準(zhǔn)，并高度關(guān)注其攝入風(fēng)險(xiǎn)。

2.4 金柑咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

咪鮮胺作為采后防腐保鮮劑使用，其在柑橘中的農(nóng)藥登記使用安全間隔期為14 d。本實(shí)驗(yàn)對(duì)浸泡后貯藏14 d的金柑中咪鮮胺攝入風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果如表3所示，監(jiān)管殘留試驗(yàn)殘留中值（supervised trials median residues，STMR）和最大殘留量（highest residue，HR）為咪鮮胺殘留量與以咪鮮胺計(jì)的2,4,6-三氯苯酚殘留量之和，其中2,4,6-三氯苯酚殘留量按2,4,6-三氯苯酚與咪鮮胺的分子質(zhì)量比197.5∶376.8換算成咪鮮胺。表3中，HQc變化范圍為35.6%～70.3%，小于100 %；HQa變化范圍為296.4%～583.4%，均大于100%；風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果說(shuō)明用450、900、2 700 mg/L共3 種質(zhì)量濃度浸泡處理金柑，14 d后咪鮮胺的慢性攝入風(fēng)險(xiǎn)在可接受的范圍內(nèi)，但按每人每日最高攝入金柑1.867 8 kg計(jì)算咪鮮胺的急性攝入風(fēng)險(xiǎn)已超出了臨界值，風(fēng)險(xiǎn)不可接受。金柑是皮可生食的少數(shù)柑橘品種，相對(duì)而言，金柑比其他不可食皮的柑橘咪鮮胺急性攝入風(fēng)險(xiǎn)更高。所以，從風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果分析，450 mg/L的咪鮮胺浸果2 min的使用方法不適用于金柑，建議修改其浸果使用方法，如：1）降低浸果濃度；2）減少浸果時(shí)間；3）單獨(dú)針對(duì)金柑類柑橘水果，登記咪鮮胺浸果的使用方法。

表3 浸泡不同咪鮮胺質(zhì)量濃度和時(shí)間的金柑與其貯存過(guò)程中咪鮮胺的攝入風(fēng)險(xiǎn)Table 3 Risk of dietary exposure to prochloraz from kumquats dipped in prochloraz solutions of different concentrations for different periods of time and its’ storage

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立GC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定金柑中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的方法，該方法有較低的檢出限、較寬的線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度，能滿足金柑中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的準(zhǔn)確定性和定量分析。咪鮮胺浸果處理，金柑中咪鮮胺殘留量先升高后緩慢降低，浸泡質(zhì)量濃度越高、浸泡時(shí)間越長(zhǎng)，咪鮮胺殘留量越大；450 mg/L浸泡2 min，金柑中咪鮮胺殘留量在咪鮮胺安全間隔期14 d為8.18 mg/kg，小于柑橘最大殘留限量值；更高浸泡質(zhì)量濃度900、2 700 mg/L，貯藏14 d咪鮮胺殘留量均高于最大殘留限量值。直到21 d，2,4,6-三氯苯酚含量隨貯藏期的延長(zhǎng)而不斷升高，450 mg/L浸泡2 min貯藏至第21天時(shí)，金柑中檢出值為0.072 mg/kg。對(duì)浸泡后貯藏14 d的金柑中咪鮮胺攝入風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，450、900、2 700 mg/L共3 種質(zhì)量濃度浸泡處理金柑，14 d后咪鮮胺的慢性攝入風(fēng)險(xiǎn)在可接受范圍內(nèi)，其急性風(fēng)險(xiǎn)不可接受。為降低咪鮮胺的攝入風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)進(jìn)一步研究咪鮮胺保鮮金柑的浸果濃度或時(shí)間對(duì)急性、慢性攝入風(fēng)險(xiǎn)的影響及其規(guī)律，以期為保障咪鮮胺貯存、保鮮金柑的安全性研究提供參考。