薛 也，王 艷,，趙 寧，竇博鑫，辛嘉英,2，韓 燁

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學院蘭州化學物理研究所，羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

Cu2+在工業(yè)和農業(yè)上有廣泛應用[1]，常被用作保鮮劑、保色劑、殺菌劑，有防止果蔬變質、保持農作物顏色以及殺菌的作用，并且Cu2+也是人體內必不可缺少的微量元素，攝入過多或缺乏都會危害健康[2-3]。因此，Cu2+是食品分析及食品安全檢測中的重要指標[4-6]。

Cu2+常用檢測方法主要有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質譜法、熒光光譜法等，但這些方法都存在著耗時較長、需要專業(yè)操作人員、不利于實際應用等問題[7-12]。近幾年隨著電化學技術的不斷完善，其靈敏度高、制作簡易、檢測速度快等優(yōu)點備受國內外學者的關注[13]，常被用于重金屬檢測工作中。Peng Donglai等[14]研制了羅丹明B肼修飾納米金的電化學傳感器，并將其應用于檢測水中Cu2+，檢出限為12.5 μmol/L。Kaur等[15]合成了螯合型二硫醇并將其自組裝到金電極表面，形成能夠吸附金屬離子的大環(huán)，用于檢測Cu2+，線性范圍為1.0×10－12～1.0×10－5mol/L（r2=0.990），檢出限可達到9.7×10－13mol/L。朱浩嘉等[16]利用同位鍍汞陽極溶出伏安法對牛奶樣品中Cd2+、Pb2+和Cu2+元素含量進行同時測定，其中Cu2+的線性范圍為0.5～100 μg/L，檢出限為0.1 μg/L。

甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb），是一種由甲烷氧化菌（Methylosinus trichosporiumOB3b）產生的具有極高銅親和力的蛋白活性肽，在Mb結構中含有2 個4-亞硫酰-5-羥基咪唑基團，通過2 個咪唑N、2 個硫酰S與銅絡合，能特異性捕獲環(huán)境中的銅，對Cu2+具有較強的專一性[17-18]。納米金（gold nanoparticles，AuNPs）具有較大的表面積、好的生物相容性和表面等離子體增強效應等優(yōu)點，可以在局部形成增強的電磁場，吸附生物大分子，常用于電化學實驗[19-21]。由于AuNPs表面容易功能化，易與生物分子相互結合，通過在檸檬酸鈉還原法合成的AuNPs（粒徑16 nm）中引入Mb，可使Mb的生物活性被賦予在AuNPs上，有利于生物分子的穩(wěn)定結合，增強特異性結合，顆粒分散均勻，可以抑制納米顆粒的團聚[22-23]（圖1A）。因此本實驗借助AuNPs與裸金電子之間的強吸附特性、Mb中L-半胱氨酸巰基與AuNPs通過金硫鍵鍵合的特性，制備Mb-AuNPs修飾電極（圖1B），通過Mb對Cu2+特異性捕捉的作用（圖1C），利用溶出伏安法檢測Cu2+具有檢出限低、靈敏度高、簡便快速的優(yōu)勢。

圖1 Mb-AuNPs修飾電極檢測原理圖Fig.1 Schematic diagram of copper ion detection with Mb-AuNP-modified electrode

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲基彎菌IMV 3011 俄羅斯科學院催化研究所；無水乙醇 天津富宇精細化工有限公司；氯金酸、CuSO4、PbCl2、HgCl2、Ag(NO3)2、FeCl3、CrO3、CuCl國藥集團上海試劑有限公司；檸檬酸鈉、氫氧化鈉、濃硫酸 天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PB-10 pH計 賽多利斯(上海)貿易有限公司；生化發(fā)酵罐 上海保興生物設備工程公司；CHI630電化學工作站、金盤電極、鉑絲電極、Ag/AgCl電極（3 mol/L KCl溶液） 上海辰華儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 Mb-AuNPs修飾電極的制備

參照文獻[24-25]，對甲烷氧化菌進行培養(yǎng)并提取Mb（1×10－4mol/L），制備Mb-AuNPs；本實驗使用固體三電極體系（工作電極：金電極；參比電極：Ag/AgCl；對電極：Pt電極），參考文獻[26-27]的方式稍作調整對金電極進行預處理。配制食人魚溶液（濃硫酸-過氧化氫（7∶3，V/V）），將金電極泡制在其中8 min后，用去離子水洗凈；在0.3、0.1、0.05 μm氧化鋁粉末上拋光后，分別用無水乙醇和二次蒸餾水在超聲中清洗各3 min；吹干后，在0.5 mol/L H2SO4溶液中循環(huán)伏安法掃描15 圈進行活化。將電極浸泡在已配制好的pH 6.5的Mb-AuNPs中8 h，4 ℃避光保存，制得Mb-AuNPs修飾電極。

1.3.2 溶出伏安法檢測Cu2+

取出已經修飾好的金電極，去離子水沖洗20 s后吹干，吸附待測濃度的Cu2+溶液50 min，同1.3.1節(jié)沖洗吹干，隨后利用溶出伏安法在0.05 mol/L且pH 5.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中進行檢測，電沉積時間40 s，頻率10 Hz，振幅25 mV。

1.3.3 干擾程度計算

2 結果與分析

2.1 金電極活化

如圖2所示，經過硫酸活化后，其還原峰增加，且有多重氧化峰的出現(xiàn)，說明金電極的靈敏度增加，有助于Mb-AuNPs充分修飾電極。

圖2 金電極硫酸活化前后對比圖Fig.2 Effect of H2SO4 activation on electrode sensitivity

2.2 電極一致性的檢測

為保證實驗嚴謹且因實驗所使用的金電極數量多，對預處理后的電極進行一致性考察[24]。如圖3所示，6 根電極掃描出的曲線重合性較好，說明實驗時金電極基本一致。

圖3 金電極的一致性考察Fig.3 Consistency of electrodes

2.3 Mb-AuNPs修飾電極的表征

如圖4所示，Mb-AuNPs修飾電極較空白電極相比，多出2 個還原峰，－0.7 V處的峰所代表的是金硫鍵的特征峰，Mb與納米金完全結合可能是導致其峰形較小的原因。－1.1 V處峰代表的可能是Mb-AuNPs的擴散特性[21]，由此判斷，Mb-AuNPs已修飾在電極表面[26,28]。

圖4 Mb-AuNPs修飾電極表征圖Fig.4 Characterization of Mb-AuNP-modified electrode

2.4 溶出伏安法檢測Cu2+

2.4.1 Mb-AuNPs修飾電極時間的影響

已處理好且一致性良好的電極分別在Mb-AuNPs溶液中浸泡2、4、6、8、10、12 h后，對100 nmol/L的Cu2+待測液進行檢測。如圖5所示，檢測的Cu2+峰電流值與金電極在Mb-AuNPs溶液的浸泡時間呈一定相關性。金電極浸泡在功能化納米金復合物溶液中時長為8 h時，Cu2+檢測的電信號強度最大。當浸泡時間從2 h增加到8 h時，峰值電流不斷增大。8 h后再繼續(xù)增加浸泡時間，峰值電流減小。這說明當浸泡時間為8 h時，電極上的Mb-AuNPs已接近飽和狀態(tài)。

圖5 Mb-AuNPs修飾時間對檢測Cu2＋的影響Fig.5 Effect of Mb-AuNP modification time on the detection of copper ions

2.4.2 Cu2+吸附時間的影響

在檢測Cu2+前，需要將Cu2+吸附在已修飾好的電極上，即將已修飾好的Mb-AuNPs電極浸泡在Cu2+溶液中。如圖6所示，吸附時間在10～50 min時，峰電流值隨著吸附Cu2+溶液時間的延長而增加。這說明吸附時間越長，與Mb-AuNPs作用的Cu2+量就越多，即Cu2+在電極表面的吸附量就越大，檢測到的信號就越強，溶出峰電流值越高。吸附時間在50 min之后，隨著吸附時間的延長，Cu2+的峰電流值減小，這可能是由于Mb-AuNPs和Cu2+之間的鍵合作用雖然較強，但隨著吸附溶液時間延長，部分Cu2+脫落，斷開了與Mb-AuNPs的連接，最終檢測出的峰電流值減小。

圖6 Mb-AuNPs修飾電極吸附Cu2＋時間對檢測的影響Fig.6 Effect of adsorption time of Cu2+ onto Mb-AuNP-modified electrode on detection efficiency

2.4.3 電沉積時間的影響

如圖7所示，10～40 s的峰電流值逐漸增長，這可能是由于沉積時間比較短，Cu2+在電極表面沉積還原的量小于富集的量，因此電信號呈現(xiàn)出隨沉積時間延長而增大的趨勢。在40 s時，沉積時間使Mb-AuNPs配位的Cu2+全部還原。隨著時間的延長，可能是電極表面的Mb-AuNPs部分脫落，從而導致電信號降低。綜上，沉積時間選擇40 s。

圖7 沉積時間對Mb-AuNPs修飾電極檢測Cu2＋的影響Fig.7 Effect of deposition time on detection efficiencyof copper ions

2.4.4 PBS pH值的影響

如圖8所示，在pH 4.5～5.5時，隨著pH值的增加，峰電流增大。pH值大于5.5時，峰電流減小可能是由于隨著pH值升高，Mb-AuNPs與Cu2+的相互作用減弱，Cu2+脫落。故選擇pH值為5.5的PBS作為檢測條件。

圖8 pH值對Mb-AuNPs修飾電極檢測Cu2＋的影響Fig.8 Effect of pH on detection efficiency of copper ions

2.5 線性關系與檢出限

采用方波溶出伏安法，利用Mb-AuNPs修飾電極對不同濃度Cu2+進行檢測。由圖9可知，隨著Cu2+濃度的增加，其溶出峰也在升高。以lgc為橫坐標（c為Cu2+濃度），相應的峰電流（μA）為縱坐標，作標準曲線，峰電流值與Cu2+濃度的對數呈一定線性相關。通過線性擬合在10 nmol/L～100 μmol/L范圍內的9 種Cu2+濃度的對應峰電流值回歸方程為：I=0.385 44lgc+2.007 53（R2=0.960 09，n=6）說明線性關系良好。經計算，檢出限為1.15 nmol/L。

圖9 方波溶出伏安法檢測Cu2＋Fig.9 Detection of copper ions by square wave soluble voltammetry

2.6 干擾離子檢測

在100 nmol/L的待測溶液中加入10 倍其他離子，分別是Pb2+、Hg2+、Ag2+、Fe3+、Cr6+、Ni2+、Al3+、Zn2+、Cu+，對檢測體系的特異性進行測定，每組測定5 次，結果如表1所示，各離子對檢測Cu2+時的干擾程度均小于2%，可忽略不計。因此Cu2+的檢測濃度在10 nmol/L～100 μmol/L時，不受其他離子的干擾，由此可以證明Mb對捕捉Cu2+具有較強的專一性[17,22]。

表1 其他離子對檢測的影響Table 1 Interfering effects of coexisting ions on Cu2+ detection

2.7 重復性與穩(wěn)定性

為了檢驗實驗結果的一致性和電極的穩(wěn)定性，進行重復性實驗。在PBS里對檢測Cu2+的電極連續(xù)10 次掃描，平行測定5 次，相對標準偏差為8.9%。將制備好的修飾電極保存于4 ℃冰箱中，分別存放2、4、6、8、10、12、14 d后取出對Cu2+檢測，重復5 次實驗，結果如表2所示，在第14天對Cu2+的響應電流強度達到84.24%，表明該修飾電極穩(wěn)定性良好。

表2 Mb-AuNPs修飾電極Cu2＋檢測穩(wěn)定性Table 2Stability of Mb-AuNP-modified electrode for detection of copper ions

3 結 論

用Mb-AuNPs修飾金電極建立了檢測Cu2+的新方法，金電極修飾時間8 h、檢測時間50 min、電沉積40 s、PBS（pH 5.5）的溶出伏安法對Cu2+檢測呈現(xiàn)良好線性關系，檢出限可達到1.15 nmol/L，均低于文獻報道[17,23,29-30]，說明敏感性好。10 倍濃度的9 種其他金屬離子的干擾實驗均顯示對檢測結果無明顯影響，說明特異性好。通過重復性、穩(wěn)定性實驗，表明此Mb-AuNPs修飾電極檢測Cu2+準確性高且穩(wěn)定性良好。因此，本方法對運用在食品中進行痕量的Cu2+檢測具有參考應用價值。