馬麗莎，謝文平，尹 怡，單 奇，劉書貴，李麗春，趙 成，鄭光明

（中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術重點實驗室，廣東 廣州 510380）

近年來，稻漁共作的新型生產(chǎn)方式不僅體現(xiàn)綠色、自然、共生的農(nóng)業(yè)生態(tài)理念，同時是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重點打造的民族品牌，但農(nóng)業(yè)耕作過程中農(nóng)藥的不合理施用可能影響其產(chǎn)品質(zhì)量安全。氟蟲腈是苯基吡唑類新型高活性殺蟲劑，其可阻礙昆蟲氯化物代謝解毒進程[1]，曾廣泛用于水稻等多種經(jīng)濟作物的蟲害防治中[2]。但研究表明，氟蟲腈對生物神經(jīng)、消化及循環(huán)等系統(tǒng)有毒副作用[3-5]，嚴重時可引發(fā)致畸效應，甚至引發(fā)致癌效應[6]，其在環(huán)境中可分解成比自身毒性更強的氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈共3 種代謝物[7-8]，其結構式如圖1所示。因此歐盟EU 1127/2014[9]及我國GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[10]規(guī)定食品中氟蟲腈的殘留量以氟蟲腈及其3 種代謝物換算分子質(zhì)量后的總含量計算，即氟蟲腈及氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜共4 種毒性物質(zhì)。目前氟蟲腈已被歐盟禁止用于人類食品產(chǎn)業(yè)鏈的畜禽養(yǎng)殖過程，我國也限制了氟蟲腈的銷售和使用[11]，但仍存在氟蟲腈超范圍使用的問題，歐盟食品和飼料快速報警系統(tǒng)顯示我國出口的茶葉近年來曾多次因氟蟲腈農(nóng)殘超標而被通報[12]。目前，備受推崇的稻漁共作模式增加了稻田水產(chǎn)品受到農(nóng)田中氟蟲腈污染的風險，因此氟蟲腈及其代謝物殘留的檢測方法值得深入探究。

圖1 氟蟲腈及其代謝物化學結構式Fig.1 Chemical structures of fipronil and its metabolites

由于2017年歐盟爆發(fā)的“氟蟲腈毒雞蛋”事件，氟蟲腈已成為食品中農(nóng)藥殘留檢測的熱點，為了更好地保障我國稻田水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，維護品牌形象，規(guī)避貿(mào)易壁壘的風險，建立檢測稻田水產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物快速篩查方法尤為必要。但目前氟蟲腈及其代謝物的檢測主要針對植物源性食品、雞蛋及豬肉等樣品[13-15]，檢測方法有氣相色譜（gas chromatography，GC）[16-18]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography- mass spectrometry，GC-MS）[19-20]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[14-15,21]等，鮮見水產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物殘留檢測方法的報道。呂磊等[18]僅報道了水產(chǎn)品中氟蟲腈原藥的分散固相萃取-氣相色譜（solid phase extraction-gas chromatography，SPE-GC）法，Zhang Yun等[21]雖報道PriME（process, robustness, improvements,matrix effects, ease of use）-超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）聯(lián)用法測定海產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物殘留的方法，但海產(chǎn)品與稻田水產(chǎn)品的基質(zhì)成分存在較大差異。由于稻田水產(chǎn)品主打綠色品牌，其品質(zhì)受到廣大消費者的高度關注，但目前檢測稻田水產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物殘留的方法鮮見報道，因此，為了保障我國稻田水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，本實驗建立檢測稻田水產(chǎn)品（主要成分為稻花鯉和克氏原螯蝦（Procambarus clarkii））中氟蟲腈及其代謝物殘留的QuEChERS-HPLC-MS/MS法，其具有操作簡便、快速、靈敏、高效、價格低廉等優(yōu)點，適用于檢測大批量稻田水產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物殘留（簡稱為目標物）。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

按GB/T 30891—2014《水產(chǎn)品抽樣規(guī)范》，于2018年5—9月按稻花鯉（每份不少于3 尾）、克氏原螯蝦（每份蝦不少于10 尾），每份樣品不少于200 g的方式共采集30 份稻花鯉、30 份克氏原螯蝦[22]。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈亞砜和氟蟲腈砜標準物質(zhì)（純度均大于99%） 德國Dr.Ehrenstorfor公司；乙腈、體積分數(shù)0.10%甲酸、體積分數(shù)0.30%的甲酸、丙酮、正己烷（均為色譜純） 美國Honeywell公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary-secondary amine，PSA，40～60 目）、C18粉、中性氧化鋁粉 美國Agela公司；去離子水Milli-Q去離子水發(fā)生器制得；質(zhì)量分數(shù)分別為0.02%、0.05%、0.10%的氨水 天津科密歐試劑廠。

1.2 儀器與設備

6470三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀、1290-6470液相色譜儀、ZORBAX Extend-C18色譜柱及陶瓷均質(zhì)子 美國Agilent科技公司；IKA MS3 basic旋渦振蕩儀 德國IKA公司；TDL-5-A飛鴿牌離心機 上海安亭公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器 美國Millipore公司；電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；FP3010料理機 德國博朗公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 標準儲備液的配制

準確稱取各標準品于棕色容量瓶中并用乙腈溶解，配制成1.0 mg/mL的標準儲備液，于－18 ℃避光保存。

1.3.1.2 混合標準溶液的配制

分別移取0.1 mL標準儲備液于10 mL棕色容量瓶中并用乙腈配制成10 μg/mL的混合標準溶液，于－18 ℃避光保存。

1.3.1.3 基質(zhì)標準工作溶液的配制

根據(jù)準確定量樣品的需求量取一定體積的混合標準溶液，再用空白基質(zhì)溶液將混合標準溶液稀釋成1 μg/mL質(zhì)量濃度的基質(zhì)標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 前處理方法

1.3.2.1 樣品制備

稻花鯉去鱗，帶皮沿背脊取肉部分。克氏原螯蝦去頭、殼、腸、腺，取肌肉部分。試樣切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊后均勻混合樣品，并用絞肉機將其制備成肉糜，密封后標記，于－20 ℃冷凍保存，備用。

1.3.2.2 提取

準確稱取（2±0.02）g肉糜樣品于15 mL具塞離心管中，加入陶瓷均質(zhì)子，加入4 mL體積分數(shù)0.10%甲酸-乙腈溶液，旋渦混合2 min，于－4 ℃、5 000 r/min離心5 min，取上清液于10 mL比色管中，重復加入4 mL 0.10%甲酸-乙腈溶液到取上清液之間的提取步驟1 次，合并上清液并定容至刻度線，混勻，備用。

1.3.2.3 凈化

取5 mL上清液于10 mL玻璃離心管中，35 ℃水浴氮吹至干，2 mL乙腈定容，取1 mL定容液于2 mL塑料離心管中，加入0.15 g PSA，旋渦振蕩1 min，于25 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm尼龍濾膜，供HPLC-MS/MS檢測。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 HPLC條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX Extend-C18柱（2.1 mm×100.0 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：A液為0.05%的氨水、B液為乙腈；勻速梯度洗脫條件：0～1 min，70% A、30% B；1～15 min，70%～40% A、30%～60% B；15～17 min，40%～70% A、60%～30% B。進樣量：5 μL；流速：0.4 mL/min。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧負離子源；毛細管電壓為3.5 kV；掃描模式為多反應監(jiān)測（multiple reation monitoring，MRM）模式；離子源溫度為325 ℃；干燥氣流量為10 L/min；霧化氣壓力為45 psi；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流量為12 L/min；毛細管電壓為3 500 V。氟蟲腈及其代謝物的詳細質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 檢測氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for the detection of fipronil and its metabolites

1.3.4 基質(zhì)效應的計算

運用HPLC-MS/MS進行檢測時，基質(zhì)效應（matrix effect，ME）的影響可導致目標物發(fā)生離子增強或抑制，從而影響定量分析的準確性和重復性。因此實驗采用提取凈化后添加標樣法建立的數(shù)學模型評定ME，按照下式計算ME：

式中：ME為基質(zhì)效應/%；A為建立溶劑標準曲線后獲得的線性方程斜率；B為建立基質(zhì)標準曲線后獲得的線性方程斜率。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

以靈敏度和重復性為目標采用安捷倫ZORBAX Extend-C18（2.1 mm×100.0 mm，1.8 μm）色譜柱分離氟蟲腈及其代謝物，實驗考察了水-甲醇-乙腈體系對化合物峰形及質(zhì)譜強度的影響，發(fā)現(xiàn)水-甲醇體系反壓高，且色譜峰分離度及化合物響應重復性均差于水-乙腈體系，因此初步選擇水-乙腈體系為流動相。

質(zhì)譜檢測以電噴霧負離子電離源檢測作為酸性物質(zhì)的氟蟲腈及其代謝物，向流動相中加入氨水可促進化合物的電離，以增強質(zhì)譜響應從而提高儀器靈敏度，但賀敏等[23]在檢測韭菜與土壤中氟蟲腈及其代謝物殘留時，發(fā)現(xiàn)待測物用酸性流動相檢測出的色譜峰形及靈敏度均優(yōu)于堿性流動相，因此實驗分別采用水-乙腈溶液、0.10%甲酸-乙腈及0.10%、0.02%、0.05%的氨水-乙腈溶液作為流動相以考察pH值對樣品響應值的影響，所得結果與賀敏等[23]相反，實驗發(fā)現(xiàn)樣品在水-乙腈溶液的條件下響應最低，其次是0.10%甲酸-乙腈溶液，在氨水-乙腈溶液條件的響應最高、穩(wěn)定性最好，且其響應強度應隨氨水濃度的增加而升高，這可能與ME有關，實驗所用基質(zhì)為魚，而賀敏等[23]所用基質(zhì)為韭菜和土壤。由于0.10%氨水-乙腈溶液流動相的pH值高達10.8，而流動相中過高的氨水濃度會降低儀器轉子密封圈及色譜柱等儀器的使用壽命，因此，在滿足分析需求與保護實驗器材的前提下，實驗確定了檢測目標物的最佳條件為0.05%氨水-乙腈溶液為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實驗采用流動注射單次標準儲備液的方式將質(zhì)量濃度1 mg/L氟蟲腈及其代謝物混合標準溶液注入質(zhì)譜儀中，在負離子模式下對噴霧電壓源的碰撞誘導解離電壓、離子傳輸管溫度、鞘氣和輔助氣等離子源參數(shù)進行優(yōu)化，進而確定測定離子源的最佳條件。以化合物的離子峰為母離子，通過優(yōu)化質(zhì)譜的最佳碰撞能，進而確定化合物的定量離子和定性離子。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

乙腈、0.10%甲酸-乙腈、正己烷與丙酮溶液是檢測食品中氟蟲腈及其代謝物殘留常用的提取劑[17,24-25]，實驗比較了乙腈、0.10%甲酸-乙腈、0.30%甲酸-乙腈及正己烷-丙酮（1∶1，V/V）的提取效率。結果顯示酸化乙腈提取效率最高，其次是乙腈，正己烷-丙酮（1∶1）混合液的提取效率最低，酸化乙腈的提取效率隨甲酸濃度的增加而下降，結果如圖2所示，其原因可能與水產(chǎn)品中脂肪和蛋白含量較高有關，正己烷-丙酮（1∶1）提取液極性較低、脂溶性強，易將水產(chǎn)品的脂類等干擾物萃取出來，因此共萃干擾物多，提取液較渾濁，影響了目標物的離子化，因此回收率偏低且相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）大于50.0%。而乙腈具有較有較理想的徹底溶解目標提取物的能力、提取效率高，對水產(chǎn)品中脂肪等非極性成分的提取能力弱、可沉淀蛋白質(zhì)，其提取液清澈透明，其中引入的甲酸可抑制作為酸性化合物的氟蟲腈及其代謝物解離以提高溶解度，但實驗發(fā)現(xiàn)乙腈中甲酸體積分數(shù)過高會影響回收率，因此選擇0.10%甲酸-乙腈為提取溶劑。

圖2 不同提取劑對氟蟲腈及其代謝物回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of fipronil and its metabolites

2.3.2 提取方法的選擇

乙腈可使水產(chǎn)品的蛋白質(zhì)變性，酸化乙腈提取樣品時發(fā)現(xiàn)結團嚴重，樣品表面形成的包覆結構阻礙了酸化乙腈與樣品的接觸，因此回收率低于30.0%。為了解決樣品結團的問題，實驗比較了均質(zhì)分散溶劑法和陶瓷均質(zhì)子旋渦振蕩法的提取效率，發(fā)現(xiàn)兩者回收率均較好，均質(zhì)分散溶劑法所用的高速均質(zhì)器的強大剪切力可徹底粉碎提取劑中的結團樣品，但均質(zhì)分散溶劑法1 次只能處理1 個樣品，且均質(zhì)機刀頭清洗不當易造成樣品的交叉污染。陶瓷均質(zhì)子旋渦振蕩法是在振蕩樣品的過程中，加入陶瓷均質(zhì)子，并高速旋轉以充分攪拌，同時打碎結團樣品，其不僅增強了樣品的均勻性、分散性，還提高了目標物回收率、重復性分別至90.1%、8.4%，可見陶瓷均質(zhì)子旋渦振蕩法比法均質(zhì)分散溶劑法的實驗結果更理想。陶瓷均質(zhì)子旋渦振蕩法僅需1 min完成1 次萃取，可批量處理樣品，極大地提高了工作效率，因此選陶瓷均質(zhì)子旋渦振蕩法為本實驗的萃取方法。

2.3.3 QuEChERS凈化方法的優(yōu)化

QuEChERS凈化方法具有便捷、成本低、高效等優(yōu)點，被廣泛用于水產(chǎn)品中多種藥物殘留的測定[26-28]。鑒于水產(chǎn)品的脂肪、蛋白含量豐富，作為提取劑的酸化乙腈易將水產(chǎn)品中極性較大的雜質(zhì)提取出來，因此實驗比較了可吸附脂類等非極性干擾物的弗羅里硅土、中性氧化鋁、C18粉及可吸附有機酸、脂肪酸等極性雜質(zhì)的乙二胺?N?丙基硅烷共4 種吸附劑的凈化效果。結果顯示，弗羅里硅土對雜質(zhì)去除能力最差、背景干擾大，其次是中性氧化鋁粉、PSA與C18粉凈化效果最好，凈化液色澤澄清、基線平整、無明顯干擾峰，如圖3所示。在上述實驗基礎上，進一步考察了不同用量的C18粉、PSA對目標物的影響。如圖4所示，氟蟲腈及其代謝物回收率隨吸附劑用量的增加而降低，當吸附劑為150 mg PSA時，4 種目標物的回收率均達到了在100%左右的最佳水平，且RSD小于15.0%，因此選擇PSA作為凈化吸附劑，其最佳用量為150 mg。

圖3 不同凈化劑對提取液的凈化效果Fig.3 Effect of different purificants on purification efficiency

圖4 C18及PSA不同用量對實驗結果的影響Fig.4 Effects of different amounts of C18 and PSA on experimental results

2.4 ME結果

|ME|＜10%時，ME可忽略，用溶劑標準曲線定量即可；10%＜|ME|＜50%時，出現(xiàn)ME增強或減弱現(xiàn)象，用基質(zhì)標準曲線定量可適當消除ME對定量的影響；|ME|＞50%時，ME對定量的實驗結果干擾較大，應優(yōu)化樣品預處理方法使ME＜50%。實驗考察了4 種農(nóng)藥在稻花鯉、克氏原螯蝦中的ME，由表2可知，氟蟲腈及其代謝物的|ME|均＜50%，2 種水產(chǎn)品基質(zhì)對目標物信號影響除氟蟲腈砜呈增強作用外，其余均呈抑制作用，因此實驗采用基質(zhì)匹配標準曲線的方法進行定量計算以降低ME。

表2 基質(zhì)匹配標準曲線與溶劑標準曲線的比較Table 2Comparison of matrix-matched calibration with solvent calibration

2.5 方法學評價

2.5.1 線性范圍、檢出限和定量限

基于已優(yōu)化的分析條件，用空白稻花鯉及克氏原螯蝦的萃取基質(zhì)分別配制質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、20.0、100.0 μg/L的氟蟲腈及其代謝物混合標準溶液，經(jīng)HPLC-MS/MS測定后，以農(nóng)藥定量離子峰面積為縱坐標，農(nóng)藥基質(zhì)標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。以添加回收樣品信噪比為3得方法檢出限（limit of detection，LOD），以信噪比為10得方法定量限（limit of quantitation，LOQ）。4 種樣品基質(zhì)的檢測結果如表2所示，氟蟲腈及其代謝物在質(zhì)量濃度0.5～100.0 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，線性相關系數(shù)均大于0.999，檢出限為1.0～1.5 μg/kg，定量限為3.0～5.0 μg/kg，低于歐盟EU 1127/2014[9]對肉類中氟蟲腈最大殘留限量15 μg/kg及我國GB 2763—2019[10]對禽肉中氟蟲腈最大殘留限量10 μg/kg的規(guī)定。

2.5.2 回收率與精密度

彭婕等[29]研究顯示，稻花鯉、克氏原螯蝦是我國稻田養(yǎng)殖的主要品種，蝦肉中色素含量較高，稻花鯉中脂肪含量相對較高，因此其肌肉成分差異較大，具有較好代表性。實驗選擇稻花鯉、克氏原螯蝦進行加標回收實驗，添加C1～C4共4 組含量分別為5.0、15.0、25.0、50.0 μg/kg的標準液，每組含量設置6 個平行實驗的同時做空白實驗，用基質(zhì)匹配標準曲線后，運用外標法定量分析，結果見表3。4 種化合物的平均加標回收率在85.2%～112.6%之間，RSD在1.2%～12.4%之間，其均小于15.0%，因此實驗方法具有較好的回收率和重復性，符合藥物殘留檢測方法的要求，氟蟲腈及其代謝物加標回收色譜如圖5所示。

表3 稻花鯉和克氏原螯蝦肌肉中4 種農(nóng)藥的回收率和RSD（n=6)Table 3 Average recoveries and RSD for four pesticides in muscles of common carp and Procambarus clarkii cultured in paddy field (n= 6)

圖5 加標稻花鯉樣品的提取離子色譜圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of fipronil and its metabolites

2.6 實際樣品檢測結果

按實驗方法檢測60 份稻田養(yǎng)殖水產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物殘留，結果如圖6所示。2 份稻花鯉樣品中檢出氟蟲腈含量分別為16.9、14.3 μg/kg，克氏原螯蝦中無氟蟲腈檢出，4 份稻花鯉檢出含量在3.54～4.59 μg/kg范圍內(nèi)的氟蟲腈砜，1 份克氏原螯蝦檢出含量為10.2 μg/kg的氟蟲腈砜，氟甲腈、氟蟲腈亞砜在稻花鯉及克氏原螯蝦中均無檢出。而Zhang Yun等[21]也在浙江省280 份海產(chǎn)品中檢出了氟蟲腈及氟蟲腈砜殘留，可見我國水產(chǎn)品存在氟蟲腈污染的風險。

圖6 實測樣品的氟蟲氰提取離子色譜圖Fig.6 Extracted ion chromatogram of the measured sample of fipronil

3 結 論

本實驗建立了檢測稻田水產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物殘留的QuEChERS-HPLC-MS/MS法，其在樣品提取時引入陶瓷均質(zhì)子，有效解決了乙腈導致的樣品結塊及分散性差的問題，并采用分散劑PSA去除樣品雜質(zhì)，與PRiME-UHPLC-MSMS法及傳統(tǒng)前處理方法相比，具有快速、簡便、高效、經(jīng)濟、環(huán)保等優(yōu)點，其涵蓋了歐盟限量規(guī)定EU 1127/2014[9]及GB 2763—2019[10]中有關氟蟲腈的全部殘留物質(zhì)的檢測需求，可實現(xiàn)稻田水產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物殘留的快速分析，為檢測與監(jiān)管稻田水產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物殘留提供理論依據(jù)和技術支撐。