舒 曉，褚能明，張雪梅，孟 霞，李典晏，黃程蘭，向 嘉，楊俊英

（重慶市農業(yè)科學院，農業(yè)農村部農產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心（重慶），重慶 401329）

雞蛋含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素和人體所需的鈣、鐵、鉀等礦物質，所含的蛋白質對肝臟組織損傷有修復作用，富含的DHA和卵磷脂、卵黃素有利于神經(jīng)系統(tǒng)和身體的發(fā)育，能健腦益智，是中國家庭必備的食品之一，因此保障雞蛋的食用安全具有重要意義。目前對雞蛋中磺胺類[1-2]、喹諾酮類[3-4]、硝基呋喃等[5-6]等抗生素類藥物的殘留研究較多[7-9]，對農藥殘留檢測的研究相對較少。但根據(jù)實地調研情況，大部分養(yǎng)殖場都對養(yǎng)殖環(huán)境進行了消毒、殺蟲、防蠅。尤其是在天氣炎熱的夏季，如果畜禽動物通過食用直接或者間接受到農藥污染的養(yǎng)殖水、飼料等將殺蟲劑、殺菌劑引入體內富集，可能產(chǎn)出受到農藥污染的畜禽產(chǎn)品或直接造成畜禽產(chǎn)品的農藥污染[10-11]。長期食用農藥殘留超標的畜禽產(chǎn)品，可引起慢性中毒，甚至產(chǎn)生致畸、致癌和致突變作用[12-13]。由于2017年的“毒雞蛋”事件，目前對雞蛋中農藥殘留的檢測研究大多與氟蟲腈及其代謝物[14-16]有關或局限于部分有機氯農藥[17]，檢測的農藥種類和范圍較少。農藥殘留檢測的前處理方式主要有固相萃取[18-19]、QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe）等[20-21]，雞蛋樣品的農藥殘留檢測前處理通常采用QuEChERS方法[22-23]。相應的檢測方法主要有氣相色譜法[24-25]、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[26]、液相色譜-串聯(lián)質譜法等[22,27-29]。目前采用氣相色譜-串聯(lián)質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）對雞蛋中農藥的多殘留研究報道較少[23,30]。GC-MS/MS是由GC和兩個四極桿質量分析器串聯(lián)組成，通常第1個質量分析器將選定的母離子預分離，通過中間碰撞池碰撞產(chǎn)生子離子碎片，由第2級質量分析器篩選產(chǎn)生的特定子離子。因此具有靈敏度高、準確性強、有較強的抗干擾能力的優(yōu)點，是農藥殘留分析領域的主要技術之一[31]。雞蛋中脂肪質量分數(shù)約為10%～12%，在前處理方法中增加去除脂質的步驟對降低基質效應的影響同時減少對儀器的損耗可能有較好的作用，在部分水果和肉類樣品的農藥殘留和環(huán)境污染物的檢測研究中，增強型脂質去除（EMR-Lipid）已成功用于去除脂質[32]。本研究創(chuàng)造性的將EMR-Lipid用于雞蛋樣品前處理過程中去除脂質并結合GC-MS/MS進行檢測。根據(jù)對養(yǎng)殖場的殺蟲劑、殺菌劑使用情況調研，分析了雞蛋中62 種農藥殘留檢測情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

62 種農藥標準品（純度≥95%，質量濃度1 000 mg/L）德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司和美國Sigma-Aldrich公司；乙酸（優(yōu)級純） 成都市科龍化工試劑廠；乙腈（色譜純） 天津四友有限責任公司；正己烷（色譜純） 德國Meker公司；氯化鈉（優(yōu)級純） 上海國光試劑有限責任公司；除水鹽包（MgSO42.5 g、NaCl 0.5 g） 上海安譜試驗科技股份有限公司；實驗用水均為超純水（電阻率18.2 Ω·cm）。

增強型脂質去除分散固相萃?。‥MR-Lipid）凈化管美國安捷倫科技公司；QuEChERS凈化管（內填150 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18） 天津阿爾塔科技公司。

1.2 儀器與設備

GCMS-TQ8050三重四極桿質譜儀 日本島津公司；SH-Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；H1850R離心機 長沙湘儀離心機有限公司；WH-600超聲波清洗機 濟寧萬和超聲電子設備有限公司；Elix5超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；SK-1快速混勻器 浙江省金壇市科析儀器有限公司；移液槍德國Eppendorf公司；T18-B-S25勻漿儀 德國IKA公司；TP-402天平 美國Denver公司；TTL-DCII型多功能氮吹儀 北京恒天科力科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

1.3.1.1 溶劑標準溶液的配制

用1 mL吸量管分別吸取質量濃度為1 000 mg/L標準品1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度線，配制成100 mg/L的標準儲備液，于4 ℃冰箱避光保存，有效期6 個月；用1 mL吸量管分別移取1 mL標準儲備液于50 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度線，配制成2 mg/L混合標準溶液，于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆?，有效? 個月。后續(xù)所需不同質量濃度溶劑標準溶液用2 mg/L混合標準溶液進行逐級稀釋。

1.3.1.2 基質標準溶液的配制

用10 mL吸量管取1.3.1.1節(jié)所配混合溶劑標準溶液于10 mL容量瓶中，將溶劑氮吹近干后，用樣品空白基質定容至刻度線。后續(xù)根據(jù)需要用樣品空白基質進行逐級稀釋。

1.3.1.3 基質效應計算公式

通過配制不同質量濃度梯度的溶劑標準溶液和基質標準溶液，分別繪制溶劑標準曲線和基質標準曲線溶劑，根據(jù)標準曲線斜率計算基質效應。計算公式如下：

1.3.2 樣品前處理

首先將雞蛋去殼并用勻漿儀充分均質后，準確稱取5 g（精確至0.01 g）均質樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水，10 mL 1%乙酸-乙腈，渦旋混勻1 min，超聲提取10 min。加3 g氯化鈉后渦旋混合1 min，4 500 r/min離心10 min。吸取5 mL乙腈層加入到經(jīng)過3 mL水活化的EMR-Lipid凈化管中，渦旋1 min。在15 mL離心管中加入陶瓷均質子，將上述上清液倒入離心管中，加入除水鹽包，渦旋振蕩1 min，以9 000 r/min低溫高速離心 5 min。取1 mL上清液待測。

1.3.3 色譜條件

毛細管色譜柱：SH-Rxi-5Sil MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；恒流模式，流速1.2 mL/min；進樣口溫度250 ℃；不分流進樣；柱壓73 kPa。柱程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1.00 min，以30 ℃/min的速率上升到150 ℃，然后以10 ℃/min的速率上升到300 ℃，保持5.00 min；進樣體積1.0 μL。

1.3.4 質譜條件

電子電離源；離子化電壓：70 V；碰撞氣：氬氣（純度≥99.999%）；碰撞誘導解離氣壓：200 kPa；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：200 ℃；發(fā)射電流：150 μA；循環(huán)時間：0.3 s；分析模式為多反應監(jiān)測掃描（multi reaction monitoring，MRM）模式。Q3SCAN全掃描模式下色譜條件與MRM掃描模式下的色譜條件一致，掃描范圍：m/z80～500。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

采用島津GC-MS Postrun Analysis和LabSolutions Insight GCMS對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用GC-MS Postrun Analysis進行全掃描數(shù)據(jù)的導出，導出后的數(shù)據(jù)用Office Excel 2007作圖。采用Office Excel 2007進行表格繪制、基質效應的數(shù)據(jù)分析和圖片繪制。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

GC條件選擇高純度載氣避免影響儀器正常工作以保證結果準確性。在進行微量組分分析時需選擇不分流進樣方式，在不分流進樣方式下必須使用程序升溫模式，且初溫低于溶劑沸點10～20 ℃。每種農藥在不同基質中定性定量離子對的響應可能有所不同，因此質譜條件的優(yōu)化需通過對雞蛋的基質標準溶液進行子離子全掃，比較在不同碰撞電壓下離子響應豐度，選擇信號強度好、響應穩(wěn)定的定性定量離子對。本研究中的甲拌磷砜和毒死蜱保留時間為11.834 min和11.830 min，在GC圖上難以區(qū)分，但它們的定性定量離子對不同，通過串聯(lián)質譜即可將兩種物質區(qū)別。為同時滿足定性和定量的要求，在MRM模式下根據(jù)掃描的離子對數(shù)量設定掃描循環(huán)時間為0.3 s，使每個色譜峰的采集點在15 個左右。在以上色譜和質譜條件下62 種農藥質量濃度為100 μg/L的離子對、碰撞能量等優(yōu)化后的參數(shù)見表1。

表162 種農藥GC-MS/MS分析的MRM參數(shù)Table 1GC-MS/MS parameters for analysis of 60 pesticides in selected reaction monitoring mode

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 提取劑的選擇

乙腈作為提取溶劑適合提取的目標物極性范圍最廣，共提物少，并且農藥在乙腈介質中較穩(wěn)定，不經(jīng)溶劑置換即可用于GC-MS分析，廣泛應用于農藥多殘留分析。固相分散萃取前處理方法中也多以乙腈作為提取劑[33-34]。但在乙腈旳作用下，某些農藥如三氯殺螨醇等易發(fā)生降解，在乙腈中添加1%的乙酸可作為分析物保護劑[35-36]。水的加入可增加極性農藥的溶解度。因此本研究考察3 種提取劑組合對提取效果的影響，分別為10 mL乙腈+5 mL水、10 mL 1%乙酸-乙腈、10 mL 1%乙酸-乙腈+5 mL水。取3 種不同提取劑的空白樣品上清液不經(jīng)凈化步驟，直接上機，在SCAN模式下對3 種提取液進行全掃描。如圖1所示，使用10 mL乙腈+5 mL水作為提取劑，基質效應最弱，背景干擾最小。采用含有10 mL 1%乙酸-乙腈作為提取劑時背景干擾較大。為驗證3 種提取劑組合的提取效果，以加標回收實驗結果為判定依據(jù)，結果如表2所示。62 種農藥在用10 mL乙腈+5 mL水提取時，有64.5%的農藥回收率在70%～120%之間。10 mL 1%乙酸-乙腈+5 mL水作為提取劑時，98.4%的農藥平均加標回收率為70.7%～117.2%。使用10 mL 1%乙酸-乙腈作為提取劑時，有46.8%的農藥回收率在70%～120%之間，因此加入水可以更好的使農藥集中到有機相中。結果表明10 mL 1%乙酸-乙腈+5 mL水作為提取劑的效果最好。

圖1 Q3SCAN模式下3 種提取液空白基質全掃描圖Fig.1 Chromatogram of blank samples with three different extraction solvent combinations in Q3SCAN mode

表2 不同溶劑組合的62 種農藥添加回收率的影響Table 2 Statistical results of spiked recovery rates of 62 pesticides with different extraction solvent combinations

2.3 鹽的選擇

對比只加入3 g NaCl和加入4 g MgSO4+1 g NaCl兩種鹽組合的不同萃取效果。加標回收實驗結果如表3所示?？梢钥吹郊尤? g NaCl的萃取效果優(yōu)于加入4 g MgSO4+1 g NaCl的效果。4 g MgSO4的加入雖然使水相和有機相更容易分離，但與水產(chǎn)生了劇烈的放熱效果，使一部分的農藥受到損失。

表3 2 種鹽組合對62 種農藥添加回收率的影響Table 3 Statistical results of spiked recoveries of 62 pesticides with extraction solvents added with two different salt combinations

2.4 除脂的凈化效果

雞蛋中都含有一定量的脂肪，因此在凈化步驟中考察了除脂與不除脂的實驗效果。不除脂的方式為常用的QuEChERS方法，直接取1.3.2節(jié)所述前處理步驟中第1次離心后的上清液1 mL通過QuEChERS凈化管（MgSO4、PSA、C18）后上機檢測。選擇的除脂方式有兩種，一種為增強型脂質去除（EMR-Lipid），處理步驟同1.3.2節(jié)。另1 種采用正己烷溶劑除脂，正己烷也在許多研究工作種被用于出去脂肪[37]。具體方式為取1.3.2節(jié)所述步驟中第1次離心后的上清液5 mL于15 mL離心管中，加入5 mL正己烷，渦旋1 min后在4 500 r/min離心5 min，取下層有機溶劑1 mL上機檢測。首先對直接經(jīng)過QuEChERS凈化管和經(jīng)過兩種除酯方式凈化后的雞蛋樣品基質在SCAN模式下進行全掃，結果如圖2所示?？梢钥闯鲭u蛋樣品的空白基質經(jīng)過兩種去除脂質步驟的基線明顯低于未除酯的基線。其中經(jīng)過正己烷除脂后的背景干擾小于經(jīng)過EMR-Lipid凈化的背景干擾，在62 種農藥的主要出峰區(qū)域，即在保留時間為4～6 min以及9～20 min之間，EMR-Lipid凈化后的背景干擾也明顯小于經(jīng)過QuEChERS凈化管的背景干擾。在保留時間為6～9 min時，雖然直接經(jīng)過QuEChERS凈化管的背景干擾較小，但是待測的62 種農藥均不在在此區(qū)間出峰。為驗證正己烷去脂、增強型脂質去除與不除脂直接通過QuEChERS凈化管3 種凈化方式的效果。以空白加標樣品的回收率為判定依據(jù)，結果如表4所示?？梢钥吹浇?jīng)過EMR-Lipid除脂凈化后有98.4%的農藥加標回收率為70.7%～117.2%，相對標準偏差為0.3%～10.9%。經(jīng)過正己烷除脂后，由于六六六、滴滴涕等一部分農藥在正己烷中有一定的溶解性，進入到正己烷層中，導致部分農藥的回收率降低，僅61.3%的農藥回收率范圍在70%～120%之間。雖然正己烷除脂對降低背景干擾有優(yōu)異的效果，但對回收率有較大的影響。QuEChERS凈化的結果為90.3%的農藥回收率范圍在70%～120%之間，且部分農藥相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）較大，檢測精密度受到一定的背景干擾影響。所以增強型脂質去除為雞蛋樣品農藥殘留檢測前處理步驟中較優(yōu)的凈化方式。

圖2 Q3SCAN模式下除脂與不除脂的空白樣品基質Fig.2 Chromatogram of blank samples with and without defatting treatment in Q3SCAN mode

表4 除脂與不除脂對62 種農藥添加回收率的影響Table 4 Statistical results of spiked recoveries of 62 pesticides with and without defatting treatment

2.5 線性范圍、定量限、回收率和精密度結果

用空白雞蛋樣品，根據(jù)1.3.2節(jié)前處理方法得到雞蛋基質提取液，參考農藥在儀器上的響應情況，根據(jù)1.3.2.2節(jié)所述步驟，用雞蛋基質提取液準確配制5、10、20、50、100、200、300、400 μg/L 8 個不同梯度質量濃度的基質標準溶液。在1.3.3節(jié)儀器條件下，以農藥的峰面積與質量濃度作標準曲線。結果表明，除α-硫丹、β-硫丹和咪鮮胺3 種農藥外的59 種農藥在5～400 μg/L之間線性關系良好，α-硫丹、β-硫丹和咪鮮胺3 種農藥在50～400 μg/L之間線性關系良好。各農藥的線性相關性系數(shù)均大于0.95。配制0.1、0.5、1、2、3、4、5 μg/L 6 個低質量濃度的基質標準溶液和1、2、4、10、15 、20、50 μg/L 5 個較低質量濃度的基質標準溶液進樣，由化學工作站計算出每個農藥的信噪比，根據(jù)方法的檢出限為3 倍的信噪比，定量限為10 倍的信噪比得出對應每種農藥的檢出限和定量限。結果表明除α-硫丹、β-硫丹和咪鮮胺3 種農藥外，62 種農藥中有59 種農藥在信噪比為3左右時，對應的檢出限為0.5～5.0 μg/kg之間，在信噪比為10左右時，對應的定量限在1.0～20.0 μg/kg之間，α-硫丹、β-硫丹和咪鮮胺的定量限較高為50 μg/kg。本實驗采用雞蛋的基質匹配液-外標法定量，按低、中、高3 個水平確定加標回收實驗的添加量，在選擇最低水平的添加量時，考慮到大部分農藥的定量限為10 μg/kg和20 μg/kg，所以最低水平添加量為20 μg/kg。3 個不同水平的添加量分別為20、60 μg/kg和100 μg/kg，每個水平重復3 次，得到每種農藥的平均回收率和RSD，結果如表4所示。當添加量為20 μg/kg時，除三唑酮、溴氰菊酯、p,p’-DDT以外，其余農藥的回收率均在61.2%～115.0%之間，RSD為1.8%～18.4%，當添加量為60 μg/kg時，除p,p’-DDE和p,p’-DDT以外，其余農藥的回收率在60.6%～116.3%之間，RSD在1.2%～23.3%之間，當添加量為100 μg/kg時，檢測農藥的回收率均在70.7%～117.2%范圍內，相對標準偏差為0.3%～10.9%。通常GC法或GC-MS/MS法在檢測雞蛋中農藥殘留時，多采用固相萃取柱凈化等復雜前處理方法，多殘留檢測時不能確保每種農藥的檢出限、定量限、回收率和RSD都得到好的結果，單殘留檢測時的結果通常更好，但檢測效率較低。QuEChERS前處理方法比固相萃取柱凈化的方法更簡單快捷，得到的回收率和RSD等結果與GC以及GC-MS/MS法報道相比[23,28,30]，有檢測范圍廣同時保證靈敏度好、精密度高的優(yōu)點。與Zhang Xining等[22]一些液相色譜-串聯(lián)質譜法的相關報道相比[27]，在回收率和精密度上能保持相當?shù)慕Y果。液相色譜-串聯(lián)質譜檢測時前處理方法通常為QuEChERS法同時受基質效應的影響更小，檢出限和定量限通常更低。

表5 62 種農藥的回收率、RSD和方法定量限Table 5 Recoveries, relative standard deviations and limits of quantitation of 62 pesticides

續(xù)表5

2.6 基質效應

雞蛋中富含蛋白質、氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質，基質效應往往會對分析準確性產(chǎn)生重要影響，因此有必要對此研究過程中雞蛋樣品的基質效應進行分析。分別配制質量濃度為1、2、4、10、15、20、50、100、200、400 μg/L的溶劑標準溶液和空白基質標準溶液，繪制了溶劑標準曲線和基質標準曲線。

根據(jù)1.3.2.3節(jié)基質效應的計算公式，基質效應在－20%～20%之間為弱基質效應，在－50%～－20%和20%～50%為中等基質效應，低于－50%或超過50%為強基質效應[38]。各組分農藥的基質效應結果如圖3所示，可以直觀地看到采用GC-MS/MS法對雞蛋中62種農藥進行檢測時，大部分農藥都有不同程度的基質效應，并且多為基質抑制效應。僅有20 種農藥為弱基質效應。31 種農藥為中等基質效應。11 種農藥為強基質效應。因此在結果分析中有必要通過基質標準曲線進行校正。

圖3 62 種農藥的基質效應Fig.3 Matrix effects for 62 pesticides

2.7 實際樣品分析測定

從重慶市各區(qū)縣養(yǎng)殖場和農貿市場中隨機抽取了40 份雞蛋樣品，對方法進行驗證。其中有2 份樣品有檢出，檢出農藥分別為聯(lián)苯菊酯和氟蟲腈硫醚，檢出比例為5%。其中聯(lián)苯菊酯檢出量為6.9 μg/kg，氟蟲腈硫醚檢出量為17.0 μg/kg，氟蟲腈硫醚的檢出濃度超過了歐盟標準規(guī)定的蛋類食品最大殘留限量值5 μg/kg，未超過我國GB 2763—2019《食品中農藥最大殘留限量》以及國際食品法典委員會規(guī)定的20 μg/kg最大殘留限量值。在以往的一些研究中也有氟蟲腈及其代謝物的檢出[22,39]，表明殺蟲劑的非法使用在畜禽養(yǎng)殖過程中應引起重視。實際樣品的檢測結果也表明基質增強去除脂質結合GC-MS/MS在雞蛋中的農藥殘留檢測有較好的實際應用價值。

3 結 論

采用GC-MS/MS法對雞蛋中農藥多殘留進行了檢測分析。1%乙酸-乙腈作為溶劑，氯化鈉鹽析，采用基質增強去脂分散固相萃取對有機相進行凈化，有效去除了雞蛋中的脂肪成分，與常用的QuEChERS凈化法相比得到了更為優(yōu)異的回收率和重復性結果。該方法前處理步驟簡單快捷、靈敏度高、專屬性強及重復性好，并成功應用于雞蛋樣品的分析，為雞蛋中多種農藥殘留量的監(jiān)測提供了有力的技術手段，為限量值的制定提供了相應的數(shù)據(jù)基礎，保障了雞蛋的安全食用。