郭志青，沈 浦，許曼琳，張 霞，于 靜，李 瑩，何 康，劉 峰，宋新穎，韓金濤，遲玉成*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，山東 泰安 271018； 3.山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東 濟南 250033)

黃曲霉毒素是由黃曲霉菌(Aspergillusflavus)、寄生曲霉菌(A.parasiticus)、集蜂曲霉菌(A.nomius)等曲霉菌產(chǎn)生的一類有毒次級代謝產(chǎn)物[1]，此類曲霉菌及其毒素能夠污染玉米[2]、花生[3]、油料[4]、香料[5]、堅果[6]等多種農(nóng)產(chǎn)品。在不同暴露時間和劑量情況下，黃曲霉毒素會對人和動物產(chǎn)生不同程度的影響如急性或慢性中毒、致癌、致畸形和致突變等[7]，且具有一定的免疫抑制性和基因毒性[8]。目前已知存在黃曲霉毒素有18種，包括四種最常見的自然發(fā)生的黃曲霉毒素：黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2以及主要代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素M2等[9]，它們是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，具有雙呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)慕Y(jié)構(gòu)[10-11]。

花生地上開花、地下結(jié)果的特性使其果實在整個生長周期都容易被土壤中的黃曲霉菌和寄生曲霉菌侵染，此兩種霉菌通常以分生孢子或菌核在土壤中越冬，其菌絲體附著在作物的殘骸上越冬。來年花生播種后，隨著環(huán)境溫濕度適宜于孢子萌發(fā)，霉菌開始生長、繁殖，并侵染花生的不同組織和器官。在黃曲霉菌豐度相同的花生種植地塊，收獲前的花生受污染程度主要取決于花生品種不同導(dǎo)致的遺傳抗性不同，從而影響花生黃曲霉菌及其毒素污染水平[12]。土壤中黃曲霉菌的含量對收獲前花生的污染程度也有非常重要的影響，發(fā)生侵染的黃曲霉菌主要來源于土壤，已有報道證明土壤中黃曲霉菌的含量與收獲前花生受污染程度成正相關(guān)[3]。除此之外氣候條件、病蟲害、花生收獲時間和收獲時的成熟度對花生受黃曲霉菌的污染也有很大的影響[13]。收獲后的污染主要是與花生收獲操作過程中造成的機械損傷、干燥不充分或不及時以及貯藏過程中環(huán)境溫度、濕度以及含氧量等有關(guān)。

根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是一類非常重要的植物病原線蟲，主要通過土壤進行傳播，有著很強的適應(yīng)和繁殖能力，寄主廣泛，其引起的危害在世界各地均有發(fā)生，造成作物的大規(guī)模減產(chǎn)和經(jīng)濟損失。其中南方根結(jié)線蟲(M.incognita)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)和北方根結(jié)線蟲(M.hapla)是四種危害花生最為重要的根結(jié)線蟲[14]，且在我國分布最為廣泛。北方根結(jié)線蟲是花生根結(jié)線蟲病的主要病原物，花生根部遭侵染后，根系吸收功能被破壞，造成花生嚴(yán)重減產(chǎn)[15]。

目前，北方根結(jié)線蟲對花生受黃曲霉菌及其毒素污染的影響鮮有報道。Minton等人研究過接種A.flavus、接種A.flavus+M.hapla兩種處理花生的黃曲霉菌侵染率，數(shù)據(jù)顯示后者處理樣品花生籽仁的黃曲霉菌侵染率明顯高于前者，研究的不足之處是他們沒有給出對照和只接種M.hapla的數(shù)據(jù)[16]。為更全面地統(tǒng)計不同處理條件下黃曲霉菌的侵染率，本試驗應(yīng)用對花生北方根結(jié)線蟲抗(感)性不同的花生品種分別設(shè)4個處理，旨在研究不同抗(感)性花生品種受北方根結(jié)線蟲侵染后，其果殼和籽仁的黃曲霉菌侵染率及籽仁中黃曲霉毒素的變化。明確北方根結(jié)線蟲對黃曲霉侵染花生的影響，可以更好地降低花生采收前黃曲霉毒素的污染，提出相應(yīng)的防控措施，對提高花生的品質(zhì)和產(chǎn)量有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所需花生品種D029、花育33(HY33)分別屬中抗(MR)、高感(HS)根結(jié)線蟲的品種[17]。

1.2 方 法

1.2.1 微區(qū)池栽試驗設(shè)計及收獲樣品的處理

微區(qū)池栽試驗于2019、2020年在山東省花生研究所萊西試驗站大棚內(nèi)進行。池栽試驗更接近田間的實際情況，又能保護其他試驗田不被線蟲和黃曲霉菌污染，便于土壤消毒。池栽試驗采用裂區(qū)設(shè)計，以品種為主區(qū)，以接種黃曲霉菌和北方根結(jié)線蟲處理為裂區(qū)，共8個處理，重復(fù)3次。收獲后的樣品初步分成飽果和秕果進行果殼、籽仁黃曲霉菌侵染率和籽仁黃曲霉毒素含量測定。

池栽試驗微區(qū)為磚水泥結(jié)構(gòu)，長寬高分別為1.0 m×1.0 m×0.8 m，填入沙土與少量有機質(zhì)的混合物。播種前兩個月，將所有試驗微區(qū)用氯化苦徹底熏蒸。微區(qū)種植方式：不起壟，不覆膜種植。田間管理：花生生長期間不使用殺蟲、殺菌劑及生長抑制劑，人工除草，一周澆一次水(滴灌)。

1.2.2 池栽試驗黃曲霉菌及根結(jié)線蟲的接種

花生播種后60 d接種黃曲霉菌：首先，產(chǎn)毒黃曲霉菌NRRL3357在燕麥粒上培養(yǎng)14 d，將10粒燕麥撒施于池栽花生的莖基部表土里，接種后滴管給花生連續(xù)澆水3 d，以保證濕潤的微環(huán)境利于黃曲霉菌的侵染。北方根結(jié)線蟲的接種：花生播種前，每棵花生接種8 000粒北方根結(jié)線蟲的卵[18]。莢果成熟后收獲時，計算不同處理花生果殼和籽仁黃曲霉菌的侵染率及籽仁中黃曲霉毒素的含量。

北方根結(jié)線蟲病微區(qū)抗性鑒定判別標(biāo)準(zhǔn)參照宋協(xié)松等[19]的方法，并根據(jù)試驗情況略做改進。主要以發(fā)病嚴(yán)重程度為依據(jù)，分5個類型。免疫：病情為0級；高抗：病情1級以下；中抗：病情1～2級；中感：病情2～3級；高感：病情3級以上。

1.2.3 花生果殼和籽仁中黃曲霉菌侵染率檢測

對不同處理的D029和HY33花生收獲曬干后，每個樣品取20個花生雙仁莢果，將莢果掰開，取一半果殼和一粒花生米，在生物安全柜中用1%次氯酸鈉表面消毒3 min，處理樣品晾干后，分別接種于WA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)6 d。果殼或籽仁上長有黃色孢子的菌落在PDA培養(yǎng)基平板上進行分離純化，直至得到單個菌落。對單菌落進行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。

花生果殼和籽仁中黃曲霉菌的侵染率是每個處理20個樣品中能夠分離出黃曲霉的樣品占總樣品的百分?jǐn)?shù)，統(tǒng)計數(shù)值后進行分析。

1.2.4 花生黃曲霉菌分離純化和鑒定

① 黃曲霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定：采用瓊脂平板表面單孢子挑取法，挑取單個菌落的菌株于PDA 培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)3 d后在顯微鏡(OLYMPUS，日本PD80)下進行形態(tài)學(xué)觀察分生孢子的形態(tài)。

② 黃曲霉菌DNA的提?。狐S曲霉基因組DNA用UNIQ-10柱式真菌基因組抽提試劑盒(生工生物，上海)提取。具體操作步驟參照郭志青等[2]，提取到的DNA置于4℃冷藏。

③ 黃曲霉菌的分子生物學(xué)鑒定：對形態(tài)學(xué)初步鑒定獲得的菌株，利用 ITS(Internal Transcribed Spacer)特異性引物ITS1(5’-3’)：TCCGTAGGTGAACCTGCGC，ITS4(5’-3’)：TCCTCCGCTTATTGATATGC序列分析[20]，通過凝膠電泳判斷PCR擴增片段的長度并對PCR產(chǎn)物進行測序，與已發(fā)表的黃曲霉菌片段長度和序列進行比對，進一步鑒定菌株。

1.2.5 黃曲霉毒素含量檢測

將20 g不同處理花生籽仁(飽果和秕果)粉碎，使其可以通過20目篩，采用間接酶聯(lián)免疫的方法，按照華安麥科黃曲霉總量試劑盒說明書檢測方法進行黃曲霉毒素含量檢測。具體操作步驟參照郭志青等[3]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS v26.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用LSD-t法分析D029、HY33飽果、秕果(對照組vs接種北方根結(jié)線蟲處理；只接種黃曲霉vs接種黃曲霉+北方根結(jié)線蟲處理)果殼黃曲霉菌侵染率、籽仁黃曲霉菌侵染率、籽仁中黃曲霉毒素的含量數(shù)據(jù)，分析北方根結(jié)線蟲對花生黃曲霉菌及其毒素污染的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生果殼及籽仁上黃曲霉菌的培養(yǎng)及分離純化

將不同處理花生果殼和籽仁進行培養(yǎng)(圖1)并對真菌進行分離純化，在PDA培養(yǎng)基平板上，肉眼觀察能產(chǎn)黃色孢子的菌落，進一步二次挑單孢培養(yǎng)得到單菌落。

2.2 黃曲霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將分離純化的菌株在顯微鏡下觀察其分生孢子、分生孢子梗的形狀(圖2)。分生孢子梗頂端膨大成圓形或橢圓形，上面著生1～2層放射狀分布的瓶狀小梗，內(nèi)壁芽生式分生孢子聚集在分生孢子梗頂端成頭狀，初步鑒定為黃曲霉菌。

2.3 黃曲霉菌的分子生物學(xué)鑒定

利用真菌 ITS 鑒定方法，用通用引物ITS1/ITS4擴增黃曲霉菌基因組DNA的ITS序列[19]，PCR 產(chǎn)物片段大小約600 bp，將PCR產(chǎn)物送生工生物測序，將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，其序列與黃曲霉菌NRRL3357菌株的相似度最高，為100%，確定分離到的真菌為黃曲霉菌。

2.4 不同處理花生結(jié)果及根結(jié)線蟲侵染情況

對照組花生植株(圖3A)莢果數(shù)量明顯多于處理組(圖3B，3C，3D)，且秕果較少；只接種黃曲霉菌的植株根部(圖3B)未發(fā)現(xiàn)明顯的北方根結(jié)線蟲的侵染(蟲癭)；只接種北方根結(jié)線蟲的花生植株根部(圖3C)有明顯的北方根結(jié)線蟲的蟲癭，花生莢果的數(shù)量較對照明顯減少，并且花生秕果的數(shù)量相對較多；接種黃曲霉菌+北方根結(jié)線蟲的植株根部(圖3D)有明顯的北方根結(jié)線蟲的蟲癭，花生莢果的數(shù)量是四組處理中最少的，并且花生秕果的數(shù)量相對較多。

2.5 不同處理花生果殼黃曲霉菌侵染率

分別對2019、2020年花生品種D029和HY33不同處理的96個樣品(包括飽果和秕果)的果殼進行黃曲霉菌侵染率統(tǒng)計。果殼黃曲霉菌侵染率結(jié)果如圖4所示，供試的2個品種處理中，接種黃曲霉菌處理和接種黃曲霉菌+北方根結(jié)線蟲處理的花生果殼黃曲霉菌的侵染率較高，可達到100%；在對照處理(CK)中，感線蟲品種HY33飽果果殼黃曲霉菌侵染率(65%±10%)高于D029飽果果殼黃曲霉菌侵染率(25%±5%)；同一品種果殼黃曲霉菌侵染率數(shù)據(jù)顯示，D029對照組秕果黃曲霉菌侵染率(55%±10%)高于對照組飽果黃曲霉菌侵染率(25%±5%)。通過花生果殼黃曲霉菌侵染率的數(shù)據(jù)可知：在同樣試驗處理條件下，根結(jié)線蟲高感品種(HY33)花生果殼黃曲霉菌侵染高于根結(jié)線蟲中抗品種(D029)；供試的兩個花生品種，對照組和接種根結(jié)線蟲處理秕果的黃曲霉菌侵染率高于飽果的黃曲霉菌侵染率。

2.6 不同處理花生籽仁黃曲霉菌侵染率

分別對2019、2020年花生品種D029和HY33不同處理樣品的籽仁(飽果內(nèi)籽仁和秕果內(nèi)籽仁)進行黃曲霉菌侵染率的統(tǒng)計，飽果籽仁黃曲霉菌侵染率數(shù)據(jù)如圖5所示，與果殼黃曲霉菌侵染率的趨勢相同，接種黃曲霉菌處理的花生籽仁的侵染率較高，可達到50%±5%，HY33品種籽仁黃曲霉菌侵染率顯著高于D029；秕果籽仁黃曲霉菌侵染率結(jié)果顯示，秕果籽仁的黃曲霉菌侵染率高于飽果籽仁的侵染率。同一品種和相同處理的花生果殼的黃曲霉菌侵染率高于籽仁黃曲霉菌侵染率。運用SPSS分析軟件通過LSD-t檢驗，發(fā)現(xiàn)D029籽仁飽果樣品中，接種線蟲的籽仁的侵染率顯著高于對照組(P=0.043)；同時接種北方根結(jié)線蟲+黃曲霉菌的籽仁黃曲霉菌侵染率顯著高于只接種黃曲霉菌的樣品(P=0.035)。同樣的規(guī)律存在于HY33籽仁飽果、D029籽仁秕果和HY33籽仁秕果樣品中。

2.7 花生籽仁中黃曲霉毒素的測定

分別對2019、2020年花生品種D029和HY33不同處理的樣品(飽果和秕果)進行籽仁黃曲霉毒素的測定，籽仁黃曲霉毒素數(shù)據(jù)如圖6所示，2個接種黃曲霉菌+北方根結(jié)線蟲處理的花生品種籽仁的黃曲霉毒素的含量均高于只接種黃曲霉菌的處理，可達到65.07±12.70 μg/kg，HY33籽仁黃曲霉毒素含量高于D029；數(shù)據(jù)顯示，秕果籽仁的黃曲霉毒素含量高于飽果籽仁的黃曲霉毒素含量。

3 討 論

本研究通過將飽果和秕果分開檢測，旨在減少實驗樣品選取時的誤差，同時檢測飽果和秕果的果殼、籽仁黃曲霉菌侵染率及黃曲霉毒素含量的差異，對農(nóng)食產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)提供理論參考。此外，我們分析了北方根結(jié)線蟲對抗(感)花生品種D029(中抗)、HY33(高感)黃曲霉菌侵染率及黃曲霉毒素積累的影響，試驗結(jié)果可知：HY33果殼和籽仁黃曲霉菌的侵染率及籽仁黃曲霉毒素含量均高于D029，推測抗線蟲花生品種是影響黃曲霉菌侵染率和黃曲霉毒素污染嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素之一。因此，建議種植戶在根結(jié)線蟲發(fā)生嚴(yán)重的地塊種植抗根結(jié)線蟲的花生品種，從而減少黃曲霉菌及黃曲霉毒素的污染，提高花生的產(chǎn)量和品質(zhì)。

試驗結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)接種線蟲處理的花生果殼、籽仁黃曲霉菌侵染率高于對照組，數(shù)據(jù)結(jié)果跟Minton等分析數(shù)據(jù)一致[16]。可能的原因有：① 北方根結(jié)線蟲在花生果殼上造成的傷口有利于黃曲霉菌的侵染；② 根結(jié)線蟲對根部組織造成傷害，影響根的正常機能，導(dǎo)致花生植株的生長勢削弱，容易受到黃曲霉菌的侵染；③ 根結(jié)線蟲對根的傷害影響了花生植株對營養(yǎng)的吸收，降低了花生植株的抵御能力，有助于黃曲霉菌等病原微生物的侵染。李紹偉等在分析開封地區(qū)花生根結(jié)線蟲的發(fā)生危害時，也指出線蟲侵入花生根部造成根液滲流，損耗細胞養(yǎng)分，容易引起次生病害[21]，這也解釋了本實驗結(jié)果中同時接種北方根結(jié)線蟲和黃曲霉菌會加重黃曲霉菌及其毒素的污染。

試驗數(shù)據(jù)中，同一花生品種、同一處理的樣品，花生籽仁黃曲霉菌的侵染率低于果殼，分析原因可能是花生果殼對籽仁有很好的保護作用，減少了黃曲霉菌侵染籽仁的機率，因此，建議在條件允許的情況下，花生盡量帶殼儲藏和長途運輸，避免此過程中因濕度和水活性增大引起孢子萌發(fā)，此措施可以有效降低黃曲霉菌侵染率，從而降低黃曲霉毒素污染，保證籽仁及其加工產(chǎn)品的品質(zhì)安全。此外，種植果殼強度適宜的花生品種會減輕黃曲霉菌在采前或采后對花生的侵染。

通過本研究提出如下防控花生黃曲霉菌及產(chǎn)生黃曲霉毒素污染的措施： ① 種植抗線蟲病品種是防治花生線蟲病最為經(jīng)濟有效的途徑，既可以降低農(nóng)業(yè)成本，增加作物產(chǎn)量，又可以避免大量使用化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境造成的污染。選用種植抗北方根結(jié)線蟲的花生品種，如D099，D015等[17]?？裹S曲霉毒素花生品種培育和篩選主要包括兩種形式：一種是抗黃曲霉菌侵染型，黃曲霉菌在此類花生品種中很難侵染和繁殖；另一種是抗黃曲霉菌產(chǎn)毒型，不抑制黃曲霉菌生長，但是抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生[22-23]。② 通過生物熏蒸和深耕防控線蟲。玉米等前茬作物收獲后立即種植高硫甙芥菜，并于11月下旬打碎深翻到土壤里[24]。芥菜能夠產(chǎn)生有機揮發(fā)物，可抑制線蟲的繁殖，是替代土壤化學(xué)熏蒸的一種生態(tài)防治技術(shù)，兼具土壤改良、綠肥、有機肥、克服連作障礙與線蟲病害防治等功效[25]。③ 有條件的地塊與非豆科作物輪作或套種，如與小麥、玉米、高粱、谷子等輪作或套種2年以上，輪作或套種時間愈長，防治花生線蟲病害的效果愈明顯。④ 播種期施用生物菌肥?；ㄉシN時，應(yīng)用淡紫擬青霉和厚垣孢子輪枝菌等生物制劑，能明顯起到降低線蟲群體和消解其卵的作用，對根結(jié)線蟲也有較好的控制效果[26]。

以上措施主要通過防控根結(jié)線蟲達到減少收獲前花生黃曲霉菌及其毒素污染的目的。此外，花生在生育期和收獲后還受環(huán)境條件影響，比如種植田塊產(chǎn)毒菌株群體的比例，若產(chǎn)毒群體比例高，則會加大花生黃曲霉毒素污染的機率，因此要在播種前熏蒸或殺菌；莢果充實期間應(yīng)避免中耕除草，防止人為損傷，以及避免在土溫較高時灌水，防止因土溫驟降而使莢果破裂，增加因傷口引起的黃曲霉菌侵染的機率；花生生育后期和莢果發(fā)育期(收獲前4～6周)遇旱要及時灌溉，避免干旱脅迫引起黃曲霉菌及其毒素污染；花生儲藏期要嚴(yán)格控制水分，降低原料入庫時的水分含量，盡量將水分控制到安全水平(籽仁8%～9%，莢果10%) 以內(nèi)。