劉 俊，張國朋，張智猛，馮東曉

(1.青島至成生物技術(shù)有限公司，山東 青島 266101；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100；3.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)主要是由黃曲霉 (Aspergillusflavus)和寄生曲霉 (A.parasiticus)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是一種劇毒物質(zhì)，黃曲霉毒素B1毒性最大，也是世界上最強(qiáng)致癌物之一。黃曲霉菌廣泛存在于土壤、植物及果實(shí)上，生命力頑強(qiáng)，花生是最容易感染黃曲霉菌的農(nóng)作物之一。黃曲霉菌污染會(huì)造成花生品質(zhì)下降、質(zhì)量安全受到極大影響。

花生黃曲霉菌污染的防治主要在花生生育后期和晾曬儲(chǔ)運(yùn)過程中，在花生莢果發(fā)育后期，首先保證土壤水分適宜，避免收獲前干旱造成種皮的破裂而增加黃曲霉菌感染機(jī)會(huì)；其次，在結(jié)莢期和莢果發(fā)育期避免耕作造成莢果損傷；第三，在收獲后及時(shí)曬干莢果，使含水量迅速低于10%以下；第四，選用具有抗性的花生新品種等。但是由于黃曲霉菌的生存力強(qiáng)，產(chǎn)生的孢子可以抵抗多種惡劣自然條件，難以徹底避免黃曲霉菌的感染[1]。

目前國內(nèi)外已有關(guān)于從土壤中分離不產(chǎn)毒黃曲霉菌的報(bào)道，美國已經(jīng)批準(zhǔn)將不產(chǎn)毒的黃曲霉菌用于黃曲霉毒素的生物防治。國內(nèi)研究僅限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)抑制產(chǎn)毒黃曲霉菌生長的報(bào)道[2-3]，并無對不產(chǎn)毒菌的分子機(jī)理進(jìn)行研究，也未開展相關(guān)田間試驗(yàn)研究和實(shí)際應(yīng)用效果報(bào)道。由于霉菌在自然環(huán)境中繁殖，發(fā)生突變的比例高。一些不產(chǎn)毒的黃曲霉菌可能發(fā)生回復(fù)突變，重新產(chǎn)毒[4]。因此，有必要選擇培養(yǎng)原生的不分泌黃曲霉毒素的黃曲霉菌，并研究其突變機(jī)理，選擇低回復(fù)突變的菌株用于黃曲霉毒素的生物防治[5-6]。

本研究在山東省萊西市孫受鎮(zhèn)沈莊村篩選對該地區(qū)土壤條件自然適應(yīng)的、可以用于黃曲霉毒素防治的不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌，并對其分子機(jī)理及田間實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行研究，旨在為花生黃曲霉生物防治提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

大米購自青島市普通超市，PDA固體培養(yǎng)基和LB瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋。黃曲霉毒素ELISA試劑盒購自南京森貝伽公司產(chǎn)品；引物序列合成及PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自上海生工；酶標(biāo)儀：帝肯Tecan50；高效液相色譜：安捷倫Agilent-1200；分孢機(jī)：南京千尚電子科技有限公司 BFQ-100。

1.1.2 菌株

菌株M1、M2、D1來源：自山東省青島市萊西市孫受鎮(zhèn)沈莊村土壤中分離獲得。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離篩選

花生收獲后取0.2 g土樣，加無菌水充分震蕩10 min，2000 r/min室溫離心，取上清20 μL涂布于PDA 培養(yǎng)基。 30 ℃恒溫培養(yǎng)，10～14 h后選取菌落直徑3～7 cm、最初帶黃色然后變?yōu)辄S綠色、老后顏色變暗、平坦或有放射狀溝紋、反面無色或帶褐色、分隔良好的黃曲霉菌落，置于1.5 mL離心管，標(biāo)記備用。

1.2.2 熒光復(fù)篩和鑒定

將初步選取的黃曲霉菌孢子在PDA培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)14 d后，于暗室中365 nm紫外燈下對菌落進(jìn)行觀察，因黃曲霉毒素在紫外燈下發(fā)熒光，可用于區(qū)分產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒的黃曲霉菌。

1.2.3 菌株培養(yǎng)及產(chǎn)毒鑒定[7]

取250 g大米置于不銹鋼盤中，加100 mL水，用鋁箔紙密封盤口，120 ℃濕熱滅菌15 min，冷卻至室溫。取黃曲霉菌株的孢子，用200 μL無菌水懸浮，取100 μL均勻涂布于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3～4 d待菌落變成深綠色，產(chǎn)生明顯的分生孢子后，用無菌細(xì)胞刮刀從培養(yǎng)基的表面刮取黃曲霉菌的分生孢子，重懸于5 mL無菌水中，充分震蕩混勻，在無菌條件下均勻添加到已消毒的大米固體培養(yǎng)基中，用4層消毒的無菌紗布覆蓋不銹鋼盤，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)13～14 d。

收集長滿黃曲霉菌的大米，取少量生長有黃曲霉菌的大米，稱重后，加10倍體積的無菌水，在勻漿器中充分勻漿至無明顯顆粒狀物，對混懸液進(jìn)行梯度稀釋到1：105，取20 μL稀釋后的黃曲霉菌懸液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)7～10 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

取培養(yǎng)黃曲霉菌株的大米樣品，干燥后在研缽中充分研磨，加10 mL的甲醇：水(1：1)提取黃曲霉毒素，采用高效液相色譜法檢測大米樣品中的黃曲霉毒素含量[8]。

1.2.4 黃曲霉菌AflR基因的啟動(dòng)子DNA序列分析

取少量分離的黃曲霉菌孢子置于陶瓷研缽中，液氮研磨破壞孢子外壁，加入1mL TE-葡萄糖溶液，充分洗滌研缽，回收溶液置于離心管中，加入1mL NaOH/SDS溶液，混勻，冰浴10min，加1mL復(fù)性溶液，12000r/min 4 ℃離心10min，取500μL上清，加入等體積的酚/氯仿(24:1)，混勻，4 ℃ 12000r/min離心5 min，小心吸取上清，加2倍體積的無水乙醇，冰上沉淀10min，12000r/min室溫離心10 min，棄上清，沉淀用500μL 75%的乙醇洗滌，室溫干燥5min后，用100μL無菌水溶解黃曲霉菌基因組DNA[9]。

以黃曲霉菌DNA為模板采用PCR擴(kuò)增AflR基因的啟動(dòng)子DNA序列，所用引物序列為：F：5'-CTCATGCAGGTGCTAAAGA-3'，R：5'-GCACAACTCGTACAGCTAT-3' ，PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，然后94℃ 40 s，57℃ 40 s，72℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行測序及序列分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不產(chǎn)黃曲霉毒素菌株篩選

從花生田采集的土壤樣品經(jīng)過培養(yǎng)、初篩，根據(jù)菌落形態(tài)和顯微鏡菌絲顯微結(jié)構(gòu)觀察，共獲得黃曲霉菌株1200株。熒光篩選后得到2株不產(chǎn)毒的黃曲霉菌株(M1、M2)，其初篩菌落圖及熒光復(fù)篩菌落圖如下(圖1、圖2)。

2.2 菌株培養(yǎng)情況及產(chǎn)毒鑒定結(jié)果

取相同重量的不產(chǎn)毒黃曲霉菌株M1、M2和產(chǎn)毒菌株D1進(jìn)行菌落培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，將剩余的大米置于分孢機(jī)的進(jìn)樣口，收集黃曲霉菌孢子，獲得孢子總量，多次試驗(yàn)取平均值，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可見，經(jīng)培養(yǎng)后不產(chǎn)毒黃曲霉菌M1、M2與產(chǎn)毒菌株D1的菌株克隆數(shù)間無顯著差異，說明產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒黃曲霉菌株的生長速率和繁殖速率無顯著差異，其產(chǎn)孢量亦不存在顯著差異。

2.3 不產(chǎn)毒與產(chǎn)毒黃曲霉菌的AflR基因啟動(dòng)子DNA序列分析

對不產(chǎn)毒的黃曲霉菌株M1、M2及產(chǎn)毒菌株D1進(jìn)行PCR及序列分析[10]，結(jié)果如圖4、圖5和圖6所示。

圖1 土壤中分離培養(yǎng)的黃曲霉菌菌落觀測 Fig.1 Yellow Aspergillus colonies separated from the soil

圖2 黃曲霉菌落的熒光鑒定觀測圖 Fig.2 Fluorescence identification of Aspergillus flavus(a) 不產(chǎn)毒黃曲霉菌落熒光檢測; (b) 產(chǎn)毒黃曲霉菌落熒光檢測圖(a) Fluorescence identification of Aspergillus flavus which do not produce toxicant; (b) Fluorescence identification of Aspergillus flavus which produce toxicant

圖3 不產(chǎn)毒與產(chǎn)毒菌株培養(yǎng)菌株克隆數(shù)與產(chǎn)生孢子數(shù)量對比 Fig.3 The comparison between the number of clones and the number of spores produced by the production of sterile and toxigenic strains

圖4 黃曲霉菌AflR基因啟動(dòng)子DNA擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜 Fig.4 Electrophoresis of AflR gene promoter DNA

圖5 M1與野生型黃曲霉菌的AflR基因啟動(dòng)子區(qū)的序列比較 Fig.5 The sequence comparison of promoter region of AflR gene between M1 strain and wild type

圖6 M2黃曲霉菌AflR基因啟動(dòng)子區(qū)與野生型黃曲霉菌啟動(dòng)子區(qū)的序列對比示意圖 Fig.6 Sequence contrast between the promoter region of M2's AflR gene and the promoter region of wild-type yellow Aspergillus

由圖可見，與產(chǎn)毒黃曲霉菌D1的AflR基因啟動(dòng)子區(qū)序列對比，M2 有15個(gè)位點(diǎn)存在點(diǎn)突變，M1菌株除有27個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)外，還存在3個(gè)缺失突變，分別缺失46 bp、4 bp和3 bp。由于黃曲霉菌的突變率高，因此單獨(dú)的點(diǎn)突變存在再次突變的可能性，成為回復(fù)突變而恢復(fù)產(chǎn)毒，而缺失突變產(chǎn)生回復(fù)突變的可能性較低，因此選擇了具有27個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)和3個(gè)缺失突變的M1菌株作為黃曲霉毒素的生防菌株用于下一步試驗(yàn)。將該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 14122，保藏日期為20170510，保藏分類命名為黃曲霉(Aspergillusflavus)。

表1 不產(chǎn)毒黃曲霉菌M1的各黃曲霉毒素的檢測結(jié)果

表2 產(chǎn)毒黃曲霉菌D1的各黃曲霉毒素的檢測結(jié)果

2.4 黃曲霉毒素含量

取不產(chǎn)毒黃曲霉菌株M1和產(chǎn)毒黃曲霉菌株D1進(jìn)行黃曲霉毒素含量測定即產(chǎn)毒鑒定，表1、表2及圖7、圖8可見，M1樣品中的各種黃曲霉毒素含量檢測均為零，證明此株黃曲霉菌在生長過程中不產(chǎn)生黃曲霉毒素，而黃曲霉菌株D1在生長過程中可產(chǎn)生大量的AFB1和AFG1，其含量分別為13.8881 ng/μL和8.6018 ng/μL。

2.5 防治實(shí)施應(yīng)用

正常田間種植的花生，待花生開花后，果針入土前，在每株花生周圍施用分離獲得的M1黃曲霉菌孢子懸液5 mL，對照組只施用無菌水5 mL，正常施肥和澆水。收獲花生后，分別取施用和未施用M1黃曲霉菌孢子懸液的花生樣品，粉碎后用甲醇：水溶液(1：1)提取黃曲霉毒素，采用ELISA的方法測定花生中的黃曲霉毒素的含量。收獲的花生經(jīng)室溫保存半年后，提取黃曲霉毒素，ELISA方法測定黃曲霉毒素的含量[11-12]。圖9可見，使用M1孢子的花生收獲后黃曲霉毒素比未使用M1孢子的花生中黃曲霉毒素的含量低。儲(chǔ)存半年后，使用M1黃曲霉菌孢子的花生黃曲霉毒素的含量增加到9 ng/μL，含量較低；而未使用的花生儲(chǔ)存半年后黃曲霉毒素的含量達(dá)到了34 ng/μL，已經(jīng)超過了限量。證明M1黃曲霉菌可用于花生的黃曲霉毒素污染的生物防控。

圖7 不產(chǎn)毒黃曲霉菌M1的黃曲霉毒素含量HPLC檢測曲線圖

圖9 使用及未使用M1孢子花生黃曲霉毒素含量變化 Fig.9 Changes in aflatoxin content of peanuts used and not used in M1 spores

3 結(jié) 論

本研究篩選出一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌(該黃曲霉菌的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 14122，保藏日期為20170510)，該黃曲霉菌的AflR基因啟動(dòng)子序列發(fā)生了缺失突變，可能與其不能產(chǎn)生黃曲霉毒素相關(guān)。該黃曲霉菌能夠與產(chǎn)毒的黃曲霉菌在土壤中展開定植競爭，而且本研究提供的黃曲霉菌在土壤中適應(yīng)能力強(qiáng)，具有較好的生存和繁殖能力，可以減輕產(chǎn)毒的黃曲霉菌對農(nóng)作物和貯存農(nóng)作物的感染，顯著降低農(nóng)作物產(chǎn)物和貯存農(nóng)作物中黃曲霉毒素的含量，具有發(fā)展成為控制黃曲霉毒素污染的生物農(nóng)藥的巨大潛力，對于保證易感農(nóng)產(chǎn)品的安全，保障廣大消費(fèi)者的身體健康具有重要意義。