王虹玲，丁昊，安東平，汪琢，馬爽，王家慶

（沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧 撫順 113122）

軟棗獼猴桃是獼猴桃科、獼猴桃屬大型落葉藤本植物，分布廣泛，物種資源豐富，是一種珍貴的經(jīng)濟果樹，在食品和保健品領(lǐng)域具有良好的開發(fā)前景[1-2]。隨著近幾年關(guān)于軟棗獼猴桃的研究越來越多，其中的生物活性成分不斷被開發(fā)出來，主要有多酚類、蒽醌類和多糖類化合物。 軟棗獼猴桃中的多酚類物質(zhì)可以賦予人體較強的抗氧化能力，現(xiàn)有研究主要集中在軟棗獼猴桃功能活性物質(zhì)的提取和衍生食品的加工[3]，將軟棗獼猴桃加工成老少皆宜的復(fù)合酵素飲料是一種有效提升農(nóng)產(chǎn)品附加值的手段。

水果酵素飲料是指果蔬在多種有益菌的自然條件下發(fā)酵產(chǎn)出的富含酶、多種維生素、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等功能成分的發(fā)酵飲品。酵素飲料在海外已被大眾所認同，根據(jù)已有的學(xué)術(shù)報道，酵素飲料具有抑菌、抗氧化、改善腸道菌群等功效[4]，有利于人體健康。

目前，對于水果酵素飲料的研究較多，研究方向主要集中在生產(chǎn)工藝和功能作用領(lǐng)域。 如郭偉峰等[5]以超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力為指標(biāo)，優(yōu)化了利用乳酸桿菌發(fā)酵桑葚果汁制備桑葚酵素飲料的工藝； 寧楚潔等以總酸和DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，利用響應(yīng)面試驗方法優(yōu)化玉米須果蔬復(fù)合飲料制備工藝，且產(chǎn)品對DPPH 自由基具有較強的清除作用[6]。 本研究以軟棗獼猴桃、百香果和寒富蘋果為主要原料，借助響應(yīng)面試驗方法研究了復(fù)合酵素飲料的生產(chǎn)工藝，考察發(fā)酵前后DPPH 自由基、羥自由基、ABTS+自由基清除能力等指標(biāo)并與抗壞血酸進行對比評價其抗氧化活性[7-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃、寒富蘋果、百香果：市售；葡萄酒酵母：安琪酵母股份有限公司；復(fù)合乳酸菌（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌）：河北一然生物科技有限公司。

白砂糖：太古糖業(yè)有限公司；檸檬酸：河南萬邦實業(yè)有限公司；抗壞血酸（分析純）：卡而銘商貿(mào)有限公司；DPPH（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、鄰苯三酚、過氧化氫、硫酸亞鐵（分析純）：國藥化學(xué)試劑廠；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS 法）：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104 電子天平： 東陽市英衡智能設(shè)備有限公司；VD650 超凈工作臺：浙江蘇珀儀器設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS 立式高壓蒸汽滅菌鍋： 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TD-45/TD-92 手持糖度計：深圳市速維電子科技有限公司；ST2100/B pH 計：上海越平精密儀器設(shè)備有限公司。

1.3 軟棗獼猴桃復(fù)合果蔬飲料的工藝流程

水果原料→無菌條件下清洗、去皮、切塊（片）→平鋪于發(fā)酵罐→接種復(fù)合發(fā)酵劑→過濾除菌→低溫?zé)o菌灌裝→成品

1.3.1 原料預(yù)處理

選擇大小均一且無外部損傷的等質(zhì)量軟棗獼猴桃、寒富蘋果和百香果，在超凈工作臺上用無菌水清洗并切片（塊）。 發(fā)酵過程所使用的器皿和發(fā)酵罐均用高壓滅菌鍋充分滅菌。

1.3.2 酵素飲料的制備

將軟棗獼猴桃、寒富蘋果及百香果與白砂糖按照2∶1（質(zhì)量比）平鋪于已滅菌的發(fā)酵罐中，重復(fù)碼放至7分或8 分滿。

1.3.3 接種與發(fā)酵

取適量無菌水與乳酸菌-葡萄酒酵母復(fù)合發(fā)酵劑（1∶1）混合，再加入等質(zhì)量的葡萄糖，置于35 ℃條件下活化30 min。待活化完全后倒入發(fā)酵罐，置于適宜的溫度下發(fā)酵1～3 個月，直到無氣體產(chǎn)生，pH 值為2～4，即發(fā)酵中止。 即得天然發(fā)酵的水果酵素[9]。

1.4 單因素試驗

選取發(fā)酵時間30、40、50、60、70 d， 發(fā)酵溫度26、28、30、32、34 ℃以及乳酸菌-葡萄酒酵母復(fù)合發(fā)酵劑接種量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%為單因素， 以產(chǎn)品總酸含量為評價指標(biāo)進行單因素試驗。

1.5 Box-Behnken 試驗設(shè)計

依據(jù)單因素試驗的結(jié)果選取合適的水平，并且以產(chǎn)品總酸含量為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.6 軟件的Box-Benhnken 試驗設(shè)計原理進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗[10]，因素水平如表1 所示。

表1 Box-Benhnken 試驗因素水平Table 1 Factor levels in Box-Benhnken test

1.6 酵素飲料的調(diào)配

發(fā)酵后的軟棗獼猴桃復(fù)合飲料經(jīng)過濾、離心后加入一定量的檸檬酸和白砂糖以平衡糖酸比和口感，進行全因子試驗以達到最適的口感和風(fēng)味。 全因子試驗方案和感官評價標(biāo)準(zhǔn)如表2、表3 所示。

表2 全因子試驗水平Table 2 Full factor test level

表3 軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料感官評價指標(biāo)Table 3 Sensory evaluation index for Actinidia arguta complex ferment beverage

1.7 酵素飲料理化指標(biāo)的測定

軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料的總酸含量采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的滴定法測定；pH 值采用GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品pH 值的測定》中的pH 計法測定；可溶性固形物含量采用GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中的折光法測定。

1.8 酵素飲料微生物指標(biāo)的測定

微生物指標(biāo)主要有大腸菌群、霉菌、酵母菌和菌落總數(shù)。 大腸菌群采用GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》測定；霉菌和酵母菌計數(shù)采用GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母菌計數(shù)》測定；菌落總數(shù)采用GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》測定。

1.9 自由基清除率的測定

1.9.1 DPPH 自由基清除率的測定

取軟棗獼猴桃酵素復(fù)合飲料2 mL 轉(zhuǎn)移到10 mL的試管中， 再加入2 mL 濃度為2×10-4mol/L 的DPPH-80%乙醇水溶液，充分混勻后，靜置0.5 h，用80%乙醇溶液調(diào)零，在517 nm 處測其吸光度，記為A1；將DPPH溶液和80%乙醇溶液各2 mL 混勻后， 相同條件下測其吸光度為A0； 將樣品和80%乙醇溶液各2 mL 混勻后，相同條件下測其吸光度為A2，重復(fù)3 次試驗。 DPPH自由基清除率用以下公式計算[11-12]。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1－A2）/A0]×100

式中：A0為2 mL 的DPPH 溶液和2 mL 80%的乙醇混合液的吸光度；A1為2 mL DPPH-80%乙醇水溶液和2 mL 樣品液的吸光度；A2為2 mL 樣品液與2 mL的80%乙醇混合溶液的吸光度。

1.9.2 ABTS+自由基清除能力的測定

ABTS+自由基清除能力采用試劑盒中說明書標(biāo)注的方法進行測定，并根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算該指標(biāo)。

1.9.3 羥自由基清除率的測定

在0.45 mL 樣品中加水定容至2 mL， 然后添加6 mmol/L 的過氧化氫1.4 mL、20 mmol/L 的水楊酸鈉0.6 mL 和2 mL 濃度為1.5 mmol/L 的FeSO4·7H2O，最后置于37 ℃環(huán)境中水浴60 min。 蒸餾水進行調(diào)零，在760 nm 處對樣品的吸光度A 進行測量， 重復(fù)次數(shù)為3次[13-14]。 羥自由基清除率用下列公式進行計算。

羥自由基清除率/%=[（A1－A2）/A1]×100式中：A1為空白的平均吸光度；A2為樣品液的平均吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間對產(chǎn)品總酸含量的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對產(chǎn)品總酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on total acid content of products

由圖1 可知， 軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料發(fā)酵時間在60 d 時總酸含量最高（4.08 g/L），總酸含量可以反映酵素飲料發(fā)酵體系進行的程度，0～60 d 內(nèi)體系發(fā)酵程度逐漸增加，積累初級代謝產(chǎn)物。 而在60 d 后反應(yīng)體系中的各種有機酸被轉(zhuǎn)化成次級代謝產(chǎn)物，這是由于在發(fā)酵初期菌種大量繁殖，而在發(fā)酵一段時間后菌種逐漸沉淀，因此發(fā)酵時間為60 d 時的酵素飲料發(fā)酵最完全。

2.1.2 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對產(chǎn)品總酸含量的影響見圖2。

由圖2 可知，當(dāng)發(fā)酵溫度低于28 ℃時發(fā)酵體系中代謝產(chǎn)物積累緩慢，當(dāng)發(fā)酵溫度高于28 ℃后反應(yīng)速度加快，產(chǎn)物合成增多。 當(dāng)發(fā)酵溫度大于30 ℃后體系溫度不利于微生物代謝，酵母菌與乳酸菌生長受到抑制導(dǎo)致體系總酸含量降低。 因此軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料最適的發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對產(chǎn)品總酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on total acid content of products

2.1.3 復(fù)合發(fā)酵劑接種量的確定

復(fù)合發(fā)酵劑接種量對產(chǎn)品總酸含量的影響見圖3。

圖3 復(fù)合發(fā)酵劑接種量對產(chǎn)品總酸含量的影響Fig.3 Effect of compound starters inoculum amount on total acid content of products

由圖3 可知，當(dāng)復(fù)合發(fā)酵劑接種量小于1.5%時總酸積累速率較慢，而當(dāng)復(fù)合發(fā)酵劑接種量大于1.5%時體系總酸含量趨于穩(wěn)定且增速放緩。 考慮到實際發(fā)酵控制和生產(chǎn)成本兩個因素，選擇1.5%為最適的復(fù)合發(fā)酵劑接種量，此時總酸含量為3.31 g/L。

2.2 Box-Behnken 試驗設(shè)計結(jié)果

響應(yīng)面法優(yōu)化軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料的發(fā)酵工藝結(jié)果如表4 所示。

2.3 二次回歸方程的擬合及響應(yīng)面分析與方差分析

對表4 中的響應(yīng)值進行多元回歸擬合分析，確立如下回歸方程：Y=3.71+0.08A+0.08B+0.065C+0.075AB+0.03AC+0.04BC-0.16A2-0.17B2-0.14C2。 方差分析結(jié)果見表5。

表4 軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料Box-Behnken 試驗設(shè)計結(jié)果Table 4 Results of Box-Behnken design of Actinidia arguta complex ferment beverage

由表5 結(jié)果可知，模型極顯著，失擬項不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 6， 調(diào)整系數(shù)R2adj=0.978 5， 變異系數(shù)（CV）=0.75%。 以上數(shù)據(jù)表明了該模型擬合性較好，重現(xiàn)性穩(wěn)定。 顯著性檢驗表明，在所取的各因素范圍內(nèi)，影響軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料發(fā)酵工藝條件的主次順序為A（發(fā)酵時間）=B（發(fā)酵溫度）＞C（復(fù)合發(fā)酵劑接種量）。 其中一次項A、B 和C， 交互項AB 和二次項A2、B2和C2對軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料發(fā)酵工藝的影響均為極顯著（P＜0.01）， 交互項BC 影響顯著（P<0.05）。

表5 響應(yīng)面試驗方差分析Table 5 Response surface test analysis of variance

響應(yīng)面分析結(jié)果見圖4。

響應(yīng)面分析圖可直觀地看出各因素的交互作用對產(chǎn)品感官評分的影響，曲面越陡峭則說明該因素對響應(yīng)值的結(jié)果影響越大。 由圖4 可知，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和復(fù)合發(fā)酵劑接種量兩兩相互作用對產(chǎn)品總酸含量的影響較為顯著。

圖4 因素交互效應(yīng)對飲料總酸含量影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface of interaction effects of factors on total acid content of beverage

2.4 酵素飲料發(fā)酵條件的驗證試驗

根據(jù)Design-Expert8.0.6 數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化分析，得出軟棗獼猴桃復(fù)合飲料的最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間62 d、發(fā)酵溫度30.66 ℃、復(fù)合發(fā)酵劑接種量2.21%，預(yù)測總酸含量為3.747 9 g/L。為了方便實際生產(chǎn)，將工藝參數(shù)調(diào)整為：發(fā)酵時間62 d、發(fā)酵溫度30.6 ℃、復(fù)合發(fā)酵劑接種量2.2%，進行3 次重復(fù)試驗，測得平均總酸含量為3.78 g/L，與預(yù)測值接近，誤差值為0.86%，表明該模型在實踐中可行。

2.5 軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料的調(diào)配結(jié)果

軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料的調(diào)配試驗結(jié)果見表6。

表6 軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料的調(diào)配試驗結(jié)果Table 6 Experimental results of preparation of Actinidia arguta complex ferment beverage

根據(jù)全因子試驗結(jié)果， 得出當(dāng)白砂糖添加量為5%，檸檬酸添加量為0.04%時風(fēng)味最佳，此時的產(chǎn)品色澤均一穩(wěn)定、果香濃郁、糖酸比適中。

2.6 軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料的微生物指標(biāo)

對優(yōu)化方案加工的軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料進行微生物檢測顯示，微生物菌落總數(shù)5 CFU/mL；大腸桿菌及其它致病菌均未檢出，符合GB 7101—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲料》中關(guān)于微生物的限量要求。

2.7 軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料的理化指標(biāo)

對優(yōu)化方案制備的軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料進行理化檢驗，得到產(chǎn)品pH 值為2.86；產(chǎn)品總酸含量為3.78 g/L；產(chǎn)品可溶性固形物含量為11.23%。

2.8 發(fā)酵前后中酵素飲料體外抗氧化能力的變化

發(fā)酵前和按最優(yōu)發(fā)酵方式制備的軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料的DPPH 自由基清除率、 羥自由基清除率和ABTS+自由基清除能力如表7 所示。

表7 發(fā)酵前后軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料對產(chǎn)品不同自由基清除能力的變化Table 7 Changes of free radical scavenging ability of Actinidia arguta complex ferment beverage before and after fermentation

軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料在發(fā)酵前后DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除能力均稍有下降，但是羥自由基清除能力有較明顯的上升，由發(fā)酵前的64.69%上升至72.15%，增幅達11.53%，且高于4 mg/mL 抗壞血酸的羥自由基清除能力，上述數(shù)據(jù)說明該酵素飲料具有良好的抗氧化效果。

3 結(jié)論

本試驗以軟棗獼猴桃、寒富蘋果及百香果為原料研制軟棗獼猴桃復(fù)合酵素飲料，在單因素試驗基礎(chǔ)上以總酸含量為響應(yīng)值，以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和復(fù)合發(fā)酵劑接種量為考察因素，通過Box-Behnken 中心組合試驗原理進行響應(yīng)面分析。 結(jié)果表明軟棗獼猴桃復(fù)合發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時間62 d、發(fā)酵溫度30.6 ℃、 乳酸菌-葡萄酒酵母復(fù)合發(fā)酵劑接種量2.2%，測得產(chǎn)品平均總酸含量為3.78 g/L。 并以感官評分為評價標(biāo)準(zhǔn)進行全因子試驗得出產(chǎn)品最佳調(diào)配工藝為：白砂糖添加量5%，檸檬酸添加量0.04%，以上工藝條件制備的產(chǎn)品色澤均一穩(wěn)定，口感清爽，富含果香，平均感官評分為96.54 分，相關(guān)微生物指標(biāo)與理化指標(biāo)符合相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)。 同時該酵素飲料的DPPH 自由基清除率、 羥自由基清除率和ABTS+自由基清除能力較高。 該試驗為日后的酵素飲料研究和復(fù)合發(fā)酵劑研究提供了理論指導(dǎo)和實踐基礎(chǔ)。