常宇陽，武小雯，郭海燕, 關(guān)桂君

(1.上海海洋大學 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室, 上海 201306;2.上海海洋大學 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室, 上海 201306;3.上海海洋大學 水產(chǎn)科學國家實驗教學示范中心, 上海 201306)

芳香化酶(Aromatase)是內(nèi)源性雌激素合成的關(guān)鍵酶[1]。哺乳類和鳥類中，芳香化酶由一個單拷貝的cyp19基因所編碼[2]，在魚類中則存在兩種不同的芳香化酶編碼基因cyp19a和cyp19b。青鳉(Japanese medaka HdrR，Oryziaslatipes)胚胎發(fā)育時期，雌雄魚腦部cyp19b的表達沒有明顯差別，隨著青春期性成熟過程開始，cyp19b表達開始出現(xiàn)雌雄性差，腦中cyp19b表達量雌性高于雄性，提示cyp19b可能參與腦-性腺軸的雌雄性分化調(diào)控[3]。除了在腦中表達，cyp19b在魚類的性腺、肝臟等器官中也有表達[4]。cyp19a主要在卵巢中表達，是雌激素合成關(guān)鍵酶，以維持卵巢和卵母細胞發(fā)育。化學誘導突變(ENU-based mutagenesis)青鳉cyp19a研究顯示，cyp19a缺失突變個體有早期卵巢發(fā)育，但在青春期之后因部分卵巢退化而出現(xiàn)卵巢向精巢轉(zhuǎn)化的XX雄性逆轉(zhuǎn)表型。并且cyp19a和cyp19b雙突變個體表型同cyp19a單獨敲除的表型基本一致，證明內(nèi)源性雌激素不是XX生殖細胞進入卵細胞早期發(fā)育的必需因子[5]。由于青鳉cyp19b的功能未知，我們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)設計了靶向敲除cyp19b，成功建立了可遺傳的cyp19b缺失品系。

青鳉與人類一樣擁有XY型性別決定系統(tǒng)[6]，這使得青鳉成為研究性別調(diào)控和性別分化的良好模式動物。其繁殖快，世代周期短，每天都能產(chǎn)卵，并且胚胎透明，能方便地進行顯微注射操作。近年來CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于操作簡便、效率高，在青鳉基因編輯中已經(jīng)有不少成功的應用[7-8]。研究使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過直接注射gRNA和Cas9蛋白進行基因編輯，免去了質(zhì)粒構(gòu)建等步驟，簡化了實驗流程[9-11]。青鳉cyp19b基因敲除品系的建立，將為研究芳香化酶在性腺性別分化中的作用提供了實驗素材。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及養(yǎng)殖條件

采用的青鳉為HdrR品系，飼養(yǎng)在26 ℃～28 ℃的循環(huán)水箱系統(tǒng)中，光暗循環(huán)時間為14/10 h。實驗涉及的所有動物實驗，都遵照上海海洋大學動物實驗委員會的規(guī)定嚴格執(zhí)行。

1.2 基因敲除靶位點設計

1.2.1 序列比對分析保守結(jié)構(gòu)域

設計靶點前，首先要對目的基因編碼的蛋白質(zhì)進行保守結(jié)構(gòu)域的分析。使用ensemble(http://www.ensembl.org)網(wǎng)站檢索和下載人(Homosapiens，Hum)、雞(Gallusgallus,Chk)、青鳉(Oryziaslatipes，Ola)、羅非魚(Oreochromisniloticus，Ore)的Cyp19b蛋白序列，采用 Vector NTI11.5進行氨基酸同源性序列比對分析，并根據(jù)Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org)，將蛋白質(zhì)氨基酸序列同源保守的結(jié)構(gòu)域進行標注。

1.2.2 在保守結(jié)構(gòu)域上設計靶位點

通過crisprscan(https://www.crisprscan.org/)網(wǎng)站[12]，分別在青鳉cyp19b基因的第2和第4外顯子上檢索預測CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)的靶向敲除位點，選擇評分高且不易產(chǎn)生脫靶效應的2個靶點進行引物設計。在選定的靶序列5′端加上T7啟動子序列，3′端加上能通過PCR與gRNA scaffold相連的序列(表1中下劃線顯示)，最終合成的序列為cyp19bgRNA1和cyp19bgRNA2(表1)。還要合成一段gRNA-scaffold序列,合成的序列如表1所示。上述寡聚核苷酸由上海生工生物工程有限公司合成并提供。

表1 用于gRNA合成的DNA片段

1.3 gRNA的制備

將cyp19bgRNA1和cyp19bgRNA2分別通過PCR與SgRNA-scaffold 相連。PCR反應程序為94 ℃ 預變性3 min；94 ℃ 變性 30 s，65 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃ 再延伸5 min。PCR的產(chǎn)物通過QIAquick PCR Purification Kit試劑盒(QIAGEN,28104)進行純化，之后通過MAXIscript T7 In Vitro Transcription Kit(Thermo Fisher，AM1312)試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄，得到gRNA1和gRNA2。通過氯化鋰(LiCl)沉淀法純化RNA(向體外轉(zhuǎn)錄得到的gRNA中加入1/10體積的4 mol/L LiCl和2.5倍體積的無水乙醇，放置在-80 ℃冰箱1 h，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸棄上清液，再用70%乙醇清洗沉淀。移除乙醇，等離心管內(nèi)殘留的乙醇揮發(fā)后，用20 μL無酶水溶解沉淀，即得到純化后的gRNA)。純化完成放入-80 ℃冰箱備用。

1.4 顯微注射

顯微注射液的組成：gRNA1和gRNA2濃度均為100 ng/mL，Cas9蛋白(金斯瑞GeneScript,Z03385-100)150 ng/mL。注射前一天，用隔離缸將青鳉的雄性與雌性隔離，注射當天解除隔離，使之交配并收取受精卵。青鳉自然交配受精后，卵細胞被激活進入減數(shù)分裂II期分裂相，并釋放極體。單倍體精子和卵子的細胞核融合最終形成合子，細胞質(zhì)由植物極向動物極進行遷移。大約在30 min后抵達動物極，顯微鏡下觀察到半透明凹陷狀單一細胞。用毛細管顯微注射針，將配制的gRNA和Cas9蛋白混合液，注入此單一細胞內(nèi)。

1.5 突變鑒定及純合子選育

將注射后的胚胎養(yǎng)至性成熟，剪尾鰭用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP324-03)提取基因組DNA，再用引物Fw9和Rv10(表1)進行基因組DNA的PCR擴增。PCR產(chǎn)物用T7E1(金斯瑞GeneScript, Z03396-250)酶切，能切開的即為突變體F0代。將F0代突變體，與相對應的雌或雄性野生型青鳉進行配對交配(外交)。將子代養(yǎng)至成魚，再提取DNA，用Fw5和Rv6引物PCR。PCR產(chǎn)物進行TA克隆并送測質(zhì)粒，得到F1代雜合子突變型。將確認的F1代具有相同突變型的雜合子雌雄個體進行配對雜交，最終得到F2代cyp19b基因敲除的純合子青鳉。

2 結(jié)果與分析

2.1 cyp19基因不同物種間的進化保守性

青鳉cyp19b基因編碼499個氨基酸，并且含有一個細胞色素P450同工酶特有同源結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列從魚類到人Cyp19蛋白中都保守存在，是蛋白酶催化活性必不可缺的(圖 1)。由于這一結(jié)構(gòu)域在Cyp19a和Cyp19b中都存在，在設計靶位點時，既要保證破壞Cyp19b中P450功能結(jié)構(gòu)域，又要避開因為P450結(jié)構(gòu)域相似度高而破壞Cyp19a功能的靶點。

圖1 不同物種的Cyp19氨基酸序列同源比對

2.2 cyp19b基因敲除青鳉的篩選和鑒定

設計的基因敲除雙靶位點如圖2(a)所示。取5條顯微注射后的成魚尾鰭DNA，用Fw9和Rv10引物進行基因組PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行T7E1酶切消化，其結(jié)果顯示為野生型(WT)未能被T7E1酶切消化，因而呈一條帶，如圖2(b)WT所示。#1、#2、#3、#5同WT一樣，不能被T7E1酶切消化；而#4個體，因其DNA雙鏈錯配而被T7E1酶切消化，酶切反應呈陽性，出現(xiàn)WT以外的兩條帶。這條F0突變體是雄魚，我們將其與3條野生型的雌魚進行配對，并將其產(chǎn)生的子代養(yǎng)大。

(a)青鳉cyp19b基因敲除策略示意圖；(b)F0代青鳉突變體的篩選鑒定電泳圖(T7E1酶切)

2.3 cyp19b基因敲除F1代青鳉的鑒定

針對F0代突變型種魚與正常青鳉雜交得到的子代青鳉，取尾鰭DNA進行靶點區(qū)域的基因組鑒定，分離得到兩種可遺傳的突變類型[圖3(b)]。第1種是因雙靶點的有效切割，導致562 bp的缺失，并同時插入9 bp堿基的突變體，我們將其命名為Mut1。Mut1型突變的雜合子用引物Fw5和Rv6進行PCR能夠擴增得到兩條帶，沒有突變的條帶是920 bp，發(fā)生突變的條帶是367 bp[圖 3(b)]。第2種是在第1個靶位點缺失了5 bp，在第2個靶位點插入了10 bp，命名為Mut2。在Mut2的特異序列位點附近，設計了一對特異性引物Fw13和Rv14(表1)，這對引物能夠有效和特異性擴增Mut2突變類型的雜合子或者純合子，得到長度為579 bp的PCR產(chǎn)物，而野生型則無PCR擴增條帶[圖 3(a)]。雖然特異性引物Fw13和Rv14能鑒別野生型和Mut2突變型，但無法區(qū)分雜合子和純合子突變，還要利用Fw5和Rv6引物對其進行基因組PCR擴增和DNA測序來最終確認Mut2的雜合子或純合子。DNA測序的峰圖顯示，靶位點處有重疊峰的為雜合子，靶位點處呈現(xiàn)單峰，并且序列不同于野生型的為純合子[圖3(c)]。

突變體氨基酸序列顯示，Mut2因缺失5個堿基產(chǎn)生移碼突變和終止密碼子的提前出現(xiàn)，形成缺失P450功能結(jié)構(gòu)域的蛋白產(chǎn)物，導致Cyp19b功能喪失[圖 3(d)]。Mut1突變體雖發(fā)生大片段缺失，但沒有發(fā)生移碼突變，最終導致在保守的P450結(jié)構(gòu)域上丟失130個氨基酸，推測Mut1型突變體的蛋白酶活性功能也會部分或完全受損。

(a)野生型和兩種突變型的DNA序列；(b)兩種突變型的電泳鑒定；(c)兩種突變型的DNA測序峰圖；(d)野生型和兩種突變型(完全或部分缺失P450結(jié)構(gòu)域)對應的氨基酸序列

2.4 青鳉Cyp19b敲除型純合子的篩選及其表型觀察分析

將具有相同突變基因型的cyp19b+/-的性成熟青鳉雌雄配對，產(chǎn)生的子代3個月性成熟后剪取尾鰭，將抽提得到的基因組DNA為模板，用特異引物進行PCR及測序鑒定，篩選得到純合子。初步觀察顯示，cyp19b-/-純合子沒有發(fā)生明顯的胚胎期死亡，基本上都能夠正常發(fā)育至成魚。性成熟的cyp19b-/-純合子青鳉有雄性也有雌性，目前鑒定得到Mut1純合子7條雄魚和5條雌魚，Mut2純合子5條雄魚和4條雌魚。兩種突變類型的純合子均可正常交配繁殖子代，說明cyp19b基因不是胚胎發(fā)生發(fā)育必不可少的因子。

3 討論

研究在青鳉中首先實施了用PCR直接擴增gRNA模板的簡易CRISPR/Cas9方法敲除cyp19b基因，并成功篩選出兩種突變純合子(cyp19b-/-Mut1 & Mut2)。相比單靶點敲除，雙靶點可在不同位點同時進行敲除而產(chǎn)生靶基因的大片段缺失，既提升敲除概率，又能確保靶向基因功能區(qū)域的徹底敲除，還有利于突變型的PCR篩選。但是多靶點同時敲除，也意味著脫靶效應風險的增加[13]。為了避免基因編輯過程中產(chǎn)生脫靶，應該選擇潛在脫靶效應少的靶位點，用gRNA和Cas9蛋白質(zhì)的最佳匹配濃度實施顯微注射，最大限度地降低脫靶效應發(fā)生[14]。實驗得到的兩個不同類型的突變，全部或部分破壞了cyp19b基因的細胞色素氧化酶P450結(jié)構(gòu)域[15-16]，從而破壞了Cyp19b蛋白產(chǎn)物的生物學活性。初步觀察發(fā)現(xiàn)cyp19b突變型純合子雌雄個體均能夠正常生長繁殖。斑馬魚中敲除cyp19b基因顯示其精巢和卵巢發(fā)育正常，也能夠正常繁殖[17]。然而，有報道發(fā)現(xiàn)cyp19b基因敲除的羅非魚雄性精巢，其輸精管發(fā)育異常而形成輸精管阻塞纖維化，導致雄性不育[18]，提示羅非魚和小型魚類(青鳉和斑馬魚)的cyp19b基因在精巢發(fā)育中的功能多樣性。魚類的性別決定既有遺傳決定的XY型或ZW型，也有溫度、光照或pH等非遺傳決定因素。魚類和其他脊椎動物的性別決定因素雖呈多樣性，但調(diào)控生殖細胞進入雌雄分化的信號通路仍有高度的進化保守性。最新研究發(fā)現(xiàn)Elavl2和Ddx6是調(diào)控小鼠卵泡休眠期進入活躍期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子[19-20]，在gsdf缺失卵巢中也顯著升高，提示Elavl2和Ddx6可能受gsdf調(diào)控，參與調(diào)控卵泡休眠期進入活躍期的轉(zhuǎn)變過程。我們還發(fā)現(xiàn)gsdf和cyp19b雙敲的XY性腺中，卵母細胞數(shù)目顯著下降，提示cyp19b可能同Elavl2和Ddx6，或其他未知因子協(xié)同參與生殖干細胞微環(huán)境的調(diào)控。

青鳉cyp19a和cyp19b在性分化過程中的表達部位不同，在發(fā)育過程中的時空表達不重疊，推測兩者功能互補的可能性不高[21]。cyp19a和cyp19b雙敲結(jié)果[5]和本實驗cyp19b單獨敲除之后的結(jié)果，都說明青鳉cyp19b對性腺分化和發(fā)育的影響是有限的，其他因子可能替代cyp19b參與調(diào)控生殖細胞性分化的作用。Cyp19b敲除品系為進一步研究其功能以及其他因子的遺傳補償作用，提供了活體研究平臺。

實驗首次采用改良的簡易CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對青鳉cyp19b基因進行敲除，成功得到了兩個不同突變類型的cyp19b敲除青鳉。cyp19b敲除青鳉模型的成功構(gòu)建為研究腦型芳香化酶在青鳉腦和性腺性別分化中的作用打下了堅實的基礎。