毛積鵬，杜澄舉，黃林旺，劉天頤，黃少偉

(1.華南農(nóng)業(yè)大學 林學與風景園林學院 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣州 510642；2.臺山市紅嶺種子園，臺山 529223)

火炬松(PinustaedaL.)原產(chǎn)于美國東南部，20世紀30年代開始引入我國，具有適應(yīng)能力強、產(chǎn)脂量高、木材和纖維產(chǎn)量高以及生長快等特點，是世界范圍內(nèi)重要的造林和工業(yè)用材樹種之一[1-2]。此外火炬松各組織部位均含有松脂，其主要成分萜類化合物在植物與植物、植物與環(huán)境、植物與病原體等其他生物體的相互作用過程中具有至關(guān)重要的作用[3-4]。除此之外，萜類化合物還被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、香料和工業(yè)化學品等行業(yè)[5-6]。萜類化合物在高等植物體中可以通過分別發(fā)生在細胞質(zhì)和質(zhì)體中的甲羥戊酸(MVA)和甲基赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)兩種途徑合成。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-Hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase, HMGR)是一種高度保守的酶，在植物組織中催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A形成甲羥戊酸，是MVA途徑的限速酶[8-10]。研究分別對HMGR基因在19種代表性植物中的系統(tǒng)發(fā)育、在火炬松進化枝中的分子進化特性及在火炬松不同組織部位的表達特征進行分析，旨在為以HMGR基因為靶點進行萜類化合物生物合成的分子調(diào)控研究及開展基于分子標記的高產(chǎn)脂火炬松優(yōu)良品系的改良工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 HMGR基因CDS序列獲取

火炬松HMGR基因的編碼序列(Coding sequence, CDS)來自火炬松基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=txid3352)。提交火炬松HMGR基因的CDS序列到NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，另選取18個具有代表性物種的HMGR基因CDS序列進行比對分析，同一物種有多條HMGR序列信息的選取和火炬松HMGR基因CDS同源性最高為代表。所選取的物種及其HMGR基因的CDS序列信息如表1所示。

表1 19個物種及其HMGR基因的CDS序列信息

1.2 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA7.0軟件[11]中的ClustalW程序?qū)?9個代表性物種HMGR基因的CDS序列進行Align Codons。比對后手動刪除終止密碼子且保證CDS序列的長度為3的倍數(shù)，序列的第一個堿基為密碼子的第一位。序列比對結(jié)果修飾利用GeneDoc序列比對顯示軟件。利用DnaSP v5軟件[12]進行序列間的平均遺傳距離估算與多態(tài)性位點分析。利用DAMBE軟件[13]對序列進行堿基替換飽和度檢測和作圖。利用MEGA7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.3 正向選擇作用檢測

利用PAML軟件[14]的Codeml程序依賴于似然率檢測(Likelihood ratio test, LRT)的單比率和二比率兩種分枝模型，M0、M1a、M2a、M3、M7和M8等6種位點模型以及ModelA和ModelB兩種分枝-位點模型來檢測HMGR基因在進化過程中是否受到正向選擇作用。利用非同義替換率(dN)和同義替換率(dS)的比值(ω=dN/dS)度量基因在進化過程中受到選擇壓的大小。ω值等于1表明受中性選擇，ω值小于1表明受純化選擇作用，ω值大于1表明受正向選擇作用[15-16]。

1.4 HMGR基因的表達分析

對火炬松的芽、嫩葉、成熟葉、樹皮和根等5個組織部位進行總RNA的提取。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent kit(No:RR047A, TaKaRa)進行反轉(zhuǎn)錄。選取PtActin(F:5′-GAGCAAAGAGATCACTGCACTTG-3′; R:5′-CTCATATTCGGTCTTGGCAATCC-3′)作為內(nèi)參基因，并利用Primer Premier 5.0軟件對HMGR基因進行引物序列設(shè)計(F:5′-GTGAGGAG GAGGTCCTGGAGATG-3′ R:5′-ACAGGCAGTTCACAAGCATTGGC-3′)。實時熒光定量PCR反應(yīng)根據(jù)試劑盒TB Green PremixExTaqII kit(Code No:RR820A, TaKaRa)的操作說明進行。實時熒光定量PCR按要求執(zhí)行3個生物學重復和3個技術(shù)重復，相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 HMGR基因CDS序列分析

19個代表性物種HMGR基因CDS序列的平均遺傳距離為0.323。多態(tài)性位點分析結(jié)果表明，在參與比對分析的891 bp長度的HMGR基因CDS序列中，保守位點276個，變異位點615個，其中單態(tài)變異位點110個，簡約信息位點505個。表明HMGR基因在進化過程中相對保守。

2.2 堿基替換飽和度檢驗

利用DAMBE軟件對19條HMGR基因的CDS序列進行堿基替換飽和度檢測及遺傳距離與轉(zhuǎn)換和顛換值的作圖分析。結(jié)果表明，19條CDS序列Iss值(0.409 5)極顯著(P<0.000 1)小于其Iss.C值(0.750 9)。由圖1可知，HMGR基因在F84替換模型下，絕大部分序列對之間的遺傳距離均介于0.25至0.55之間。且所有序列對之間的遺傳距離均大于其對應(yīng)的轉(zhuǎn)換和顛換值。綜合表明，HMGR基因序列間的堿基替換未達到飽和，適合用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

x軸：成對序列遺傳距離；y軸：轉(zhuǎn)換(S)和顛換(V)遺傳距離

2.3 系統(tǒng)發(fā)育與多序列比對分析

利用MEGA7.0軟件中的鄰近法及程序的默認參數(shù)對19條HMGR基因的CDS序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2)。結(jié)果表明，所有的裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物的HMGR基因被分別聚類在3個不同的單系進化枝中。其中，火炬松與北美云杉兩種松科植物及二穗短柄草、玉米、高粱和水稻等4種禾本科植物也分別被聚類在同一進化枝中。然而同為棕櫚科的海棗和油棕的HMGR基因則分別被聚類在不同進化枝中。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果選取進化距離較遠的5個物種的HMGR基因的蛋白序列進行多序列比對分析(圖3)，多序列比對分析的部分結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明HMGR基因在進化距離相對較遠的物種中同樣表現(xiàn)出較高的同源性，且C-末端序列的保守性高于N-末端。此外，N-端含有兩個高度保守基序，除火炬松外C-端也含有多個高度保守基序。

圖2 HMGR基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

不同背景顏色表示序列同源性大小：黑色100%，黃色80%，灰色60%；“-”表示氨基酸缺失

2.4 正向選擇作用檢測

研究分別利用2種分枝模型、6種位點模型和2種分枝-位點模型來檢測HMGR基因在進化過程中受到的選擇壓大小以及是否受到正向選擇作用。單比率分枝模型結(jié)果表明，HMGR基因在19個代表性物種的進化過程中受到的平均選擇壓大小為0.121 2。以火炬松進化枝為前景枝的二比率分枝模型結(jié)果表明，HMGR基因在火炬松的進化過程中受到選擇壓大小為0.429 3(表2)。此外，LRT結(jié)果表明以火炬松為前景枝的二比率模型極顯著優(yōu)于單比率模型(P<0.001)，即HMGR基因在火炬松進化枝中受到的選擇壓顯著高于背景枝。

位點模型分析結(jié)果表明，M0和M3模型對的LRT值小于0.001，即M3模型顯著優(yōu)于M0模型，HMGR基因在進化過程中各位點受到的選擇壓大小差異顯著。M2a和M1a模型對的比較分析結(jié)果表明，HMGR基因在進化過程中79.85%的位點受純化選擇作用，19.15%的位點受中性選擇作用，只有1%左右的位點在進化過程中受到正向選擇作用(ω2=12.446 7)。正向選擇作用位點貝葉斯與經(jīng)驗貝葉斯(Bayes and Empirical Bayes, BEB)的后驗概率值均小于0.95，此外，LRT結(jié)果表明M2a模型并不顯著優(yōu)于M1a模型。M8和M7模型對的比較分析結(jié)果表明，HMGR基因在進化過程中93.09%的位點受中性選擇或純化選擇作用，6.91%的位點受正向選擇作用。LRT結(jié)果表明M8模型顯著優(yōu)于M7模型，然而各受正向選擇作用位點的BEB后驗概率值均只介于0.511和0.923之間(表2)。

以火炬松進化枝為前景枝的分枝-位點模型分析結(jié)果如表2所示。Model A模型分析結(jié)果表明，HMGR基因在火炬松進化過程中有76.89%的位點受純化選擇作用，10.98%的位點受中性選擇作用，12.13%的位點被檢測到正向選擇作用，其中14個位點的BEB后驗概率P>0.95。Model B模型分析結(jié)果表明，分別有62.77%、23.99%和13.24%的位點受純化選擇、中性選擇和正向選擇作用。在Model A中檢測到的后驗概率大于0.95的14個位點同樣在Model B中被檢測到。

表2 HMGR基因在不同模型下的參數(shù)估計值、對數(shù)似然值及正向選擇位點統(tǒng)計

2.5 HMGR基因表達分析

為探索HMGR基因的表達特征從而進一步了解萜類化合物的生物合成機制，分別對HMGR基因在火炬松5個不同組織部位中的表達特性進行倍分析(圖4)。結(jié)果表明HMGR基因在嫩葉組織中具最高的表達量，分別是根和樹皮組織的9倍和10倍，是成熟葉子和芽組織中的4倍和3倍。其次是在芽和成熟葉組織中。在根和樹皮組織中HMGR基因的表達量則相對較低。

圖4 HMGR基因在火炬松各組織部位的表達分析

3 討論與結(jié)論

研究對HMGR編碼基因的系統(tǒng)發(fā)育在火炬松進化枝中的分子進化及其不同組織部位的表達特性進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物的HMGR基因分別被聚類在同一進化枝中。這表明HMGR基因在進化過程中相對保守。但同為棕櫚科的海棗和油棕的HMGR基因則被聚類在不同的進化枝中，可能是因為HMGR基因的進化速率與對應(yīng)物種的進化速率不一致導致的[17]。多序列比對分析發(fā)現(xiàn)火炬松HMGR基因CDS序列的C-端比其他物種的短500～800 bp，可能是火炬松在進化過程中由于核苷酸的突變作用提前形成了終止密碼子導致了C-端部分片段的丟失[18]。

分枝模型中火炬松進化枝并未檢測到正向選擇作用，位點模型中雖然有部分位點的ω值大于1，但其BEB后驗概率值均小于0.95。這很大程度上是受正向選擇頻率差異的影響，因為大部分有功能的基因都很少受到強烈的正向選擇作用，這種情況下部分受到正向選擇作用的位點很容易被中和掉[19-20]。隨后的分枝位點模型也證明了這一點，Model A和Model B兩種分枝-位點模型均檢測到14個BEB后驗概率值大于0.95的正向選擇位點[21]。

HMGR基因在火炬松針葉組織中的表達量相對較高，在樹皮組織中的表達量最低。據(jù)此推測，雖然人工割脂部位是在樹干處，但其主要作用是松脂儲存，松脂的主要合成部位則是在松針組織中。這意味著在高脂火炬松的定向培育工作中，活冠體積這一性狀也應(yīng)重視。