毛積鵬，杜澄舉，黃林旺，劉天頤，黃少偉

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2.臺(tái)山市紅嶺種子園，臺(tái)山 529223)

火炬松(PinustaedaL.)原產(chǎn)于美國(guó)東南部，20世紀(jì)30年代開(kāi)始引入我國(guó)，具有適應(yīng)能力強(qiáng)、產(chǎn)脂量高、木材和纖維產(chǎn)量高以及生長(zhǎng)快等特點(diǎn)，是世界范圍內(nèi)重要的造林和工業(yè)用材樹(shù)種之一[1-2]。此外火炬松各組織部位均含有松脂，其主要成分萜類化合物在植物與植物、植物與環(huán)境、植物與病原體等其他生物體的相互作用過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用[3-4]。除此之外，萜類化合物還被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、香料和工業(yè)化學(xué)品等行業(yè)[5-6]。萜類化合物在高等植物體中可以通過(guò)分別發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體中的甲羥戊酸(MVA)和甲基赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)兩種途徑合成。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-Hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase, HMGR)是一種高度保守的酶，在植物組織中催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A形成甲羥戊酸，是MVA途徑的限速酶[8-10]。研究分別對(duì)HMGR基因在19種代表性植物中的系統(tǒng)發(fā)育、在火炬松進(jìn)化枝中的分子進(jìn)化特性及在火炬松不同組織部位的表達(dá)特征進(jìn)行分析，旨在為以HMGR基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行萜類化合物生物合成的分子調(diào)控研究及開(kāi)展基于分子標(biāo)記的高產(chǎn)脂火炬松優(yōu)良品系的改良工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 HMGR基因CDS序列獲取

火炬松HMGR基因的編碼序列(Coding sequence, CDS)來(lái)自火炬松基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=txid3352)。提交火炬松HMGR基因的CDS序列到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，另選取18個(gè)具有代表性物種的HMGR基因CDS序列進(jìn)行比對(duì)分析，同一物種有多條HMGR序列信息的選取和火炬松HMGR基因CDS同源性最高為代表。所選取的物種及其HMGR基因的CDS序列信息如表1所示。

表1 19個(gè)物種及其HMGR基因的CDS序列信息

1.2 序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA7.0軟件[11]中的ClustalW程序?qū)?9個(gè)代表性物種HMGR基因的CDS序列進(jìn)行Align Codons。比對(duì)后手動(dòng)刪除終止密碼子且保證CDS序列的長(zhǎng)度為3的倍數(shù)，序列的第一個(gè)堿基為密碼子的第一位。序列比對(duì)結(jié)果修飾利用GeneDoc序列比對(duì)顯示軟件。利用DnaSP v5軟件[12]進(jìn)行序列間的平均遺傳距離估算與多態(tài)性位點(diǎn)分析。利用DAMBE軟件[13]對(duì)序列進(jìn)行堿基替換飽和度檢測(cè)和作圖。利用MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.3 正向選擇作用檢測(cè)

利用PAML軟件[14]的Codeml程序依賴于似然率檢測(cè)(Likelihood ratio test, LRT)的單比率和二比率兩種分枝模型，M0、M1a、M2a、M3、M7和M8等6種位點(diǎn)模型以及ModelA和ModelB兩種分枝-位點(diǎn)模型來(lái)檢測(cè)HMGR基因在進(jìn)化過(guò)程中是否受到正向選擇作用。利用非同義替換率(dN)和同義替換率(dS)的比值(ω=dN/dS)度量基因在進(jìn)化過(guò)程中受到選擇壓的大小。ω值等于1表明受中性選擇，ω值小于1表明受純化選擇作用，ω值大于1表明受正向選擇作用[15-16]。

1.4 HMGR基因的表達(dá)分析

對(duì)火炬松的芽、嫩葉、成熟葉、樹(shù)皮和根等5個(gè)組織部位進(jìn)行總RNA的提取。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent kit(No:RR047A, TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。選取PtActin(F:5′-GAGCAAAGAGATCACTGCACTTG-3′; R:5′-CTCATATTCGGTCTTGGCAATCC-3′)作為內(nèi)參基因，并利用Primer Premier 5.0軟件對(duì)HMGR基因進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)(F:5′-GTGAGGAG GAGGTCCTGGAGATG-3′ R:5′-ACAGGCAGTTCACAAGCATTGGC-3′)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)根據(jù)試劑盒TB Green PremixExTaqII kit(Code No:RR820A, TaKaRa)的操作說(shuō)明進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR按要求執(zhí)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 HMGR基因CDS序列分析

19個(gè)代表性物種HMGR基因CDS序列的平均遺傳距離為0.323。多態(tài)性位點(diǎn)分析結(jié)果表明，在參與比對(duì)分析的891 bp長(zhǎng)度的HMGR基因CDS序列中，保守位點(diǎn)276個(gè)，變異位點(diǎn)615個(gè)，其中單態(tài)變異位點(diǎn)110個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)505個(gè)。表明HMGR基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。

2.2 堿基替換飽和度檢驗(yàn)

利用DAMBE軟件對(duì)19條HMGR基因的CDS序列進(jìn)行堿基替換飽和度檢測(cè)及遺傳距離與轉(zhuǎn)換和顛換值的作圖分析。結(jié)果表明，19條CDS序列Iss值(0.409 5)極顯著(P<0.000 1)小于其Iss.C值(0.750 9)。由圖1可知，HMGR基因在F84替換模型下，絕大部分序列對(duì)之間的遺傳距離均介于0.25至0.55之間。且所有序列對(duì)之間的遺傳距離均大于其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)換和顛換值。綜合表明，HMGR基因序列間的堿基替換未達(dá)到飽和，適合用于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

x軸：成對(duì)序列遺傳距離；y軸：轉(zhuǎn)換(S)和顛換(V)遺傳距離

2.3 系統(tǒng)發(fā)育與多序列比對(duì)分析

利用MEGA7.0軟件中的鄰近法及程序的默認(rèn)參數(shù)對(duì)19條HMGR基因的CDS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2)。結(jié)果表明，所有的裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物的HMGR基因被分別聚類在3個(gè)不同的單系進(jìn)化枝中。其中，火炬松與北美云杉兩種松科植物及二穗短柄草、玉米、高粱和水稻等4種禾本科植物也分別被聚類在同一進(jìn)化枝中。然而同為棕櫚科的海棗和油棕的HMGR基因則分別被聚類在不同進(jìn)化枝中。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果選取進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的5個(gè)物種的HMGR基因的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析(圖3)，多序列比對(duì)分析的部分結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明HMGR基因在進(jìn)化距離相對(duì)較遠(yuǎn)的物種中同樣表現(xiàn)出較高的同源性，且C-末端序列的保守性高于N-末端。此外，N-端含有兩個(gè)高度保守基序，除火炬松外C-端也含有多個(gè)高度保守基序。

圖2 HMGR基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

不同背景顏色表示序列同源性大小：黑色100%，黃色80%，灰色60%；“-”表示氨基酸缺失

2.4 正向選擇作用檢測(cè)

研究分別利用2種分枝模型、6種位點(diǎn)模型和2種分枝-位點(diǎn)模型來(lái)檢測(cè)HMGR基因在進(jìn)化過(guò)程中受到的選擇壓大小以及是否受到正向選擇作用。單比率分枝模型結(jié)果表明，HMGR基因在19個(gè)代表性物種的進(jìn)化過(guò)程中受到的平均選擇壓大小為0.121 2。以火炬松進(jìn)化枝為前景枝的二比率分枝模型結(jié)果表明，HMGR基因在火炬松的進(jìn)化過(guò)程中受到選擇壓大小為0.429 3(表2)。此外，LRT結(jié)果表明以火炬松為前景枝的二比率模型極顯著優(yōu)于單比率模型(P<0.001)，即HMGR基因在火炬松進(jìn)化枝中受到的選擇壓顯著高于背景枝。

位點(diǎn)模型分析結(jié)果表明，M0和M3模型對(duì)的LRT值小于0.001，即M3模型顯著優(yōu)于M0模型，HMGR基因在進(jìn)化過(guò)程中各位點(diǎn)受到的選擇壓大小差異顯著。M2a和M1a模型對(duì)的比較分析結(jié)果表明，HMGR基因在進(jìn)化過(guò)程中79.85%的位點(diǎn)受純化選擇作用，19.15%的位點(diǎn)受中性選擇作用，只有1%左右的位點(diǎn)在進(jìn)化過(guò)程中受到正向選擇作用(ω2=12.446 7)。正向選擇作用位點(diǎn)貝葉斯與經(jīng)驗(yàn)貝葉斯(Bayes and Empirical Bayes, BEB)的后驗(yàn)概率值均小于0.95，此外，LRT結(jié)果表明M2a模型并不顯著優(yōu)于M1a模型。M8和M7模型對(duì)的比較分析結(jié)果表明，HMGR基因在進(jìn)化過(guò)程中93.09%的位點(diǎn)受中性選擇或純化選擇作用，6.91%的位點(diǎn)受正向選擇作用。LRT結(jié)果表明M8模型顯著優(yōu)于M7模型，然而各受正向選擇作用位點(diǎn)的BEB后驗(yàn)概率值均只介于0.511和0.923之間(表2)。

以火炬松進(jìn)化枝為前景枝的分枝-位點(diǎn)模型分析結(jié)果如表2所示。Model A模型分析結(jié)果表明，HMGR基因在火炬松進(jìn)化過(guò)程中有76.89%的位點(diǎn)受純化選擇作用，10.98%的位點(diǎn)受中性選擇作用，12.13%的位點(diǎn)被檢測(cè)到正向選擇作用，其中14個(gè)位點(diǎn)的BEB后驗(yàn)概率P>0.95。Model B模型分析結(jié)果表明，分別有62.77%、23.99%和13.24%的位點(diǎn)受純化選擇、中性選擇和正向選擇作用。在Model A中檢測(cè)到的后驗(yàn)概率大于0.95的14個(gè)位點(diǎn)同樣在Model B中被檢測(cè)到。

表2 HMGR基因在不同模型下的參數(shù)估計(jì)值、對(duì)數(shù)似然值及正向選擇位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

2.5 HMGR基因表達(dá)分析

為探索HMGR基因的表達(dá)特征從而進(jìn)一步了解萜類化合物的生物合成機(jī)制，分別對(duì)HMGR基因在火炬松5個(gè)不同組織部位中的表達(dá)特性進(jìn)行倍分析(圖4)。結(jié)果表明HMGR基因在嫩葉組織中具最高的表達(dá)量，分別是根和樹(shù)皮組織的9倍和10倍，是成熟葉子和芽組織中的4倍和3倍。其次是在芽和成熟葉組織中。在根和樹(shù)皮組織中HMGR基因的表達(dá)量則相對(duì)較低。

圖4 HMGR基因在火炬松各組織部位的表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

研究對(duì)HMGR編碼基因的系統(tǒng)發(fā)育在火炬松進(jìn)化枝中的分子進(jìn)化及其不同組織部位的表達(dá)特性進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物的HMGR基因分別被聚類在同一進(jìn)化枝中。這表明HMGR基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。但同為棕櫚科的海棗和油棕的HMGR基因則被聚類在不同的進(jìn)化枝中，可能是因?yàn)镠MGR基因的進(jìn)化速率與對(duì)應(yīng)物種的進(jìn)化速率不一致導(dǎo)致的[17]。多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)火炬松HMGR基因CDS序列的C-端比其他物種的短500～800 bp，可能是火炬松在進(jìn)化過(guò)程中由于核苷酸的突變作用提前形成了終止密碼子導(dǎo)致了C-端部分片段的丟失[18]。

分枝模型中火炬松進(jìn)化枝并未檢測(cè)到正向選擇作用，位點(diǎn)模型中雖然有部分位點(diǎn)的ω值大于1，但其BEB后驗(yàn)概率值均小于0.95。這很大程度上是受正向選擇頻率差異的影響，因?yàn)榇蟛糠钟泄δ艿幕蚨己苌偈艿綇?qiáng)烈的正向選擇作用，這種情況下部分受到正向選擇作用的位點(diǎn)很容易被中和掉[19-20]。隨后的分枝位點(diǎn)模型也證明了這一點(diǎn)，Model A和Model B兩種分枝-位點(diǎn)模型均檢測(cè)到14個(gè)BEB后驗(yàn)概率值大于0.95的正向選擇位點(diǎn)[21]。

HMGR基因在火炬松針葉組織中的表達(dá)量相對(duì)較高，在樹(shù)皮組織中的表達(dá)量最低。據(jù)此推測(cè)，雖然人工割脂部位是在樹(shù)干處，但其主要作用是松脂儲(chǔ)存，松脂的主要合成部位則是在松針組織中。這意味著在高脂火炬松的定向培育工作中，活冠體積這一性狀也應(yīng)重視。