楊 超，李海英，馬春泉,*

(黑龍江大學(xué) a.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心;b.生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080)

0 引 言

天然橡膠是基礎(chǔ)工業(yè)原料之一，廣泛應(yīng)用于航空航天、醫(yī)療器械、交通運輸?shù)溶娪煤兔裼霉I(yè)，在諸多高精度領(lǐng)域中均無法被合成橡膠所取代。天然橡膠是由異戊二烯聚合生成的一種生物高分子材料(C5H8)n，包括順式異戊二烯(cis-polyisoprene，CPI)和反式異戊二烯(trans-polyisoprene，TPI)兩種同分異構(gòu)體，簡稱為順式膠和反式膠[1]。順式膠具有高彈性、耐沖擊、應(yīng)誘變結(jié)構(gòu)特征、耐穿刺、耐撕裂等諸多優(yōu)良的理化性能，在低溫下也能保持優(yōu)秀的彈性和延展性[2-3]，順式膠的這些優(yōu)異特性與其自身的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、高分子量以及膠乳(橡膠顆粒的膠狀懸浮物)中的一些次要成分(如蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物和礦物質(zhì))息息相關(guān)。與順式膠相比，反式膠的綜合性能稍差，但其優(yōu)勢在于硬度高、熱膨脹/收縮系數(shù)較低、絕緣性好以及耐酸堿腐蝕[4]。以化石資源為原料生產(chǎn)的合成橡膠雖為反式膠，但目前技術(shù)手段生產(chǎn)出的合成橡膠中含有的其他分子結(jié)構(gòu)雜質(zhì)，破壞了合成橡膠中的大分子排列規(guī)律，影響了其理化性能，致使工業(yè)未能生產(chǎn)出性能上與天然橡膠相匹配的合成橡膠材料。此外，合成橡膠來源的石油供應(yīng)和價格的不確定性以及快速增長的經(jīng)濟(jì)體對橡膠的高需求均導(dǎo)致了天然橡膠和合成橡膠價格的迅速上漲，提高了開發(fā)新型天然橡膠替代資源的必要性與緊迫性。因此，尋找和開發(fā)與天然橡膠相近的產(chǎn)膠替代植物是當(dāng)前的研究熱點之一。

高分子量是決定天然橡膠質(zhì)量的重要因素之一。目前在自然界中已經(jīng)鑒定出不少于8科、300屬、2 500 多種可以產(chǎn)生順式膠的植物中[5]，除了巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)外，僅有橡膠草(Taraxacumkok-saghyz)和銀膠菊(Partheniumargentatum)兩個物種可以合成產(chǎn)量可觀且分子量高的順式膠；自然界中可生產(chǎn)反式膠的植物數(shù)量也較少，目前僅有杜仲(Eucommiaulmoides)報道較為廣泛。無論是生產(chǎn)順式膠還是反式膠，理想的產(chǎn)膠植物需要具備生長快、產(chǎn)膠量高、適應(yīng)范圍廣等優(yōu)良特性，使其推廣到農(nóng)作系統(tǒng)中，并且根據(jù)市場需求考慮與其他作物進(jìn)行輪作，以更好地滿足人類生活的需要。

1 天然產(chǎn)膠植物

1.1 巴西橡膠樹

巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)是目前天然橡膠唯一的商業(yè)來源。巴西橡膠樹的生長周期長，6～7 a才能進(jìn)入出產(chǎn)期，給巴西橡膠樹遺傳育種帶來了困難[6]。同時，巴西橡膠樹對生長環(huán)境要求十分嚴(yán)格，種植條件限制了其只能在熱帶環(huán)境下種植，也成為了巴西橡膠樹的種植無法擴(kuò)大到非熱帶國家的主要障礙。此外，現(xiàn)如今對巴西橡膠樹威脅最大的疾病是南美葉疫病(SALB)，是由南美葉疫病菌(Microcyclusulei)引起的真菌性疾病[7]。由于東南亞地區(qū)主要引進(jìn)并推廣種植的均為Henry Wickham系統(tǒng)22株橡膠樹品系，品種單一化導(dǎo)致該地區(qū)橡膠樹遺傳基因狹窄，生產(chǎn)系統(tǒng)的局限性和脆弱性使其更容易受南美葉疫病(SALB)的威脅，給通過基因工程手段改造培育高產(chǎn)抗病橡膠樹品種帶來了困難[8]。開發(fā)天然橡膠替代植物來源的另一原因是橡膠樹膠乳中的蛋白質(zhì)可引起人體的過敏反應(yīng)，而且對于乳膠過敏反應(yīng)的人群數(shù)量約占普通人群的1%～6%，研究表明，醫(yī)護(hù)人員中存在過敏反應(yīng)風(fēng)險高達(dá)17%[5]。

1.2 橡膠草

橡膠草(Taraxacumkok-saghyz)是一種草本植物，是前蘇聯(lián)科學(xué)家Rodin于1931—1932年在哈薩克斯坦境內(nèi)天山山谷中發(fā)現(xiàn)并引種培育，根是主要產(chǎn)膠部位，橡膠草橡膠的分子量非常高，在質(zhì)量方面與巴西橡膠樹橡膠相似，在二戰(zhàn)期間橡膠草橡膠被廣泛應(yīng)用[9]。橡膠草作為巴西橡膠樹最具競爭力的產(chǎn)膠替代植物，具有眾多優(yōu)點：①橡膠草適應(yīng)能力強，可在溫帶地區(qū)廣泛種植，且具有良好的耐鹽堿能力；②橡膠草產(chǎn)膠周期短，僅一年就可收獲，在選育高產(chǎn)膠量品種方面具有優(yōu)勢；③橡膠草目前已建立較為成熟的再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系，可利用分子育種的手段培育橡膠草新品種；④橡膠草在田間可與其它作物輪流種植或者間隔種植，充分利用土地面積，增加經(jīng)濟(jì)效益；⑤橡膠草具有較強的經(jīng)濟(jì)競爭力，加工的副產(chǎn)品菊糖可應(yīng)用于食品和非食品領(lǐng)域，剩下的植物殘渣可以發(fā)酵成生物乙醇和沼氣[10]。

盡管橡膠草擁有和橡膠樹一樣的乳管，但卻無法通過割膠來收獲膠乳，只能通過破碎橡膠草的根后才能提??；而且橡膠草橡膠顆粒相比巴西橡膠樹含有更多的蛋白質(zhì)，致敏可能性更高，這也增加了人體對橡膠草橡膠過敏的風(fēng)險，因此橡膠草需要考慮應(yīng)用于傳統(tǒng)、非醫(yī)療用途，如輪胎制造等[11]。另外，橡膠草基本上未經(jīng)馴化，存在一些固有問題，如發(fā)芽期間需要穩(wěn)定的含水量、生長速度慢、與雜草的競爭力差、橡膠產(chǎn)量只有在成熟時才能測量、高度雜合度以及自交不親和性等特性，這些問題嚴(yán)重限制了橡膠草的替代和應(yīng)用速度，也成為了正在重點攻克的研究領(lǐng)域[10]。因此，在未來橡膠草成為商業(yè)上可行且具有競爭力的天然橡膠植物之前，通過分子育種和常規(guī)育種相結(jié)合，提高橡膠草橡膠產(chǎn)量和改善農(nóng)藝性狀至關(guān)重要，最終目標(biāo)是培育出地下生物量高、橡膠積累量高的新品種。

1.3 銀膠菊

銀膠菊(Partheniumargentatum)，生長于墨西哥和美國南部半干旱地區(qū)的一種多年生灌木。銀膠菊需要1 000～2 200 mm的總用水量(灌溉加降雨)才能保證橡膠的產(chǎn)量。銀膠菊橡膠分子量與巴西橡膠樹橡膠基本相同，因而也是主要的產(chǎn)膠替代植物之一[12]。

銀膠菊從種植到收獲和膠乳生產(chǎn)可以完全機械化，但銀膠菊膠乳在樹皮薄壁細(xì)胞中形成毫米大小的顆粒，必須通過機械手段徹底破壞植物材料，從單個細(xì)胞中釋放出膠乳，再通過離心和乳化等步驟來純化膠乳，或者通過溶劑萃取來分離橡膠，因而銀膠菊橡膠加工技術(shù)十分復(fù)雜，增加了生產(chǎn)成本[13]。銀膠菊橡膠的優(yōu)勢在于它所產(chǎn)橡膠的蛋白質(zhì)含量比巴西橡膠樹橡膠低得多，相關(guān)蛋白數(shù)量不超過10種，因此銀膠菊橡膠滿足了市場上對低過敏性橡膠的需求，如醫(yī)用手套、導(dǎo)管等高附加值的商業(yè)產(chǎn)品。但銀膠菊的缺點也給其商業(yè)化進(jìn)程帶來了障礙。在歐洲和美國大部分地區(qū)，銀膠菊只有部分品種馴化成兩年或多年生植物，而在中國，銀膠菊被歸為外來入侵物種，存在著破壞生態(tài)環(huán)境的風(fēng)險。此外，銀膠菊不耐冷，只有在特定的冬季溫度下才能生產(chǎn)高質(zhì)量的橡膠，這也限制了銀膠菊橡膠的產(chǎn)量。

1.4 杜仲

杜仲(Eucommiaulmoides)，分布于我國溫帶和亞熱帶地區(qū)，引種栽培面積達(dá)35×104hm2。杜仲作為我國本土生長的特有樹種，是珍貴的中藥材，其組織器官包括樹皮、葉片和種子均可入藥，杜仲的這些部位均分布有高分子量的反式膠，是具有開發(fā)潛力的橡膠資源[14]。

杜仲的生態(tài)環(huán)境適應(yīng)能力極強，能夠在酸性土壤和鹽堿土壤中生長，可在我國大部分地區(qū)種植，開發(fā)前景巨大。另外，杜仲膠具有橡塑二重性，即在常溫下呈現(xiàn)類似塑料的狀態(tài)，而在50 ℃以上表現(xiàn)為橡膠的性質(zhì)，是具備熱塑性及熱彈性的優(yōu)良功能材料[15]。這一性質(zhì)使得杜仲膠在航天、船舶等領(lǐng)域得到應(yīng)用，但也極大地限制了其在常溫下的應(yīng)用范圍。目前，對于杜仲的研究主要局限于藥理研究，對杜仲膠合成及提取的研究相對較少，制約了杜仲膠在國內(nèi)的發(fā)展。生物量多的葉片是提取杜仲橡膠的主要原料，但含膠量僅2%～6%，提取過程中需要處理大量廢渣，提高了杜仲膠提取的加工生產(chǎn)成本[16]。

2 天然橡膠的生物合成機制

天然橡膠的生物合成途徑(圖1)包括3個階段：①異戊烯基焦磷酸(IPP)的形成；②聚異戊二烯基焦磷酸鏈的延伸；③橡膠分子的合成[5]。

圖1 天然橡膠的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of natural rubber

2.1 異戊烯基焦磷酸(IPP)的合成

異戊烯基焦磷酸(IPP)是橡膠生物合成的單體亞單位，由乙酰輔酶A或3-磷酸甘油醛和丙酮酸通過兩種途徑合成，即甲羥戊酸途徑(MVA)和甲基赤蘚糖醇磷酸鹽途徑(MEP)，這兩個途徑分別在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體中進(jìn)行[1,8]。MVA途徑也稱作細(xì)胞質(zhì)途徑。天然產(chǎn)膠植物體內(nèi)的蔗糖由轉(zhuǎn)化酶催化下分解為葡萄糖和果糖，然后葡萄糖通過糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸，再由丙酮酸脫氫酶復(fù)合體生成乙酰輔酶A，之后乙酰輔酶A作為起始底物進(jìn)入MVA途徑，經(jīng)過6步的縮合反應(yīng)生成IPP[5]。MEP途徑也稱作質(zhì)體途徑。MEP途徑是以糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸和甘油醛-3-磷酸為起始底物，經(jīng)過7步反應(yīng)合成IPP和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)[8]。

2.2 聚異戊烯基焦磷酸鏈的延伸

DMAPP是IPP的雙鍵異構(gòu)體，兩者可通過異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)相互轉(zhuǎn)化，DMAPP通過反式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(TPT)與IPP進(jìn)行連續(xù)順式-1,4-縮合反應(yīng)，形成牻牛兒基焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)。上述這些反式短鏈異戊二烯基焦磷酸已被證明可以作為橡膠合成的引發(fā)劑，引發(fā)劑的分子量與天然橡膠的合成速度呈正相關(guān)[6]。異戊二烯基焦磷酸與IPP結(jié)合，引發(fā)聚異戊烯基焦磷酸鏈的結(jié)合，這一過程需要二價金屬陽離子(Mg2+或Mn2+)的參與，之后的延伸過程就是異戊烯基焦磷酸在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(PT)的催化下不斷地連接到聚異戊烯基焦磷酸焦磷酸長鏈上[7]。

2.3 橡膠分子的合成

橡膠分子的合成是聚異戊二烯鏈從橡膠轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體上解離下來的過程，之后橡膠分子就會貯存于橡膠粒子內(nèi)部。橡膠分子終止合成的信號仍需要進(jìn)一步探討，有觀點認(rèn)為聚異戊二烯鏈的終止可能涉及到由焦磷酸酶催化焦磷酸基團(tuán)解離而形成羥基這一過程，也有觀點認(rèn)為由于橡膠轉(zhuǎn)移酶(RT)附著在橡膠粒子的膜上，因此在合成橡膠分子時，會產(chǎn)生一定程度的幾何空間阻礙而終止合成橡膠[8]。

3 天然橡膠生物合成相關(guān)基因和關(guān)鍵酶的研究

3.1 羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)

3-羥基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)在HMGR的催化下生成甲羥戊酸(MVA)，此過程不可逆。像脫落酸、赤霉素、類胡蘿卜素以及輔酶Q等初生代謝物的前體就是MVA[14]，HMGR是MVA途徑的一個限速酶。在橡膠樹中發(fā)現(xiàn)了3個HMGR基因(HMGR1-3)，其中HMGR1在乳管中表達(dá)量最高，可以被乙烯誘導(dǎo)，與天然橡膠合成最為相關(guān)，煙草中異源表達(dá)HbHMGR1后發(fā)現(xiàn)處理組HMGR活性與野生型相比增加了4～8倍，甾醇含量也增加到6倍[17]。從構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)克隆得到的AnHMGR基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化銀膠菊，轉(zhuǎn)基因銀膠菊與野生型銀膠菊相比,膠乳產(chǎn)量顯著增加，天然橡膠含量增加了65%[12]。

3.2 1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)

DXS是MEP途徑中的首個關(guān)鍵酶，丙酮酸和3-磷酸甘油醛在其催化下生成脫氧木酮糖磷酸(DXP)，這一過程需要焦磷酸硫胺素(TPP)作為輔酶參與。DXS基因最早在大腸桿菌(Escherichiacoli)中被分離，同時基因敲除結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)DXS基因菌株的萜類化合物產(chǎn)量顯著提高[18]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)是最早分離出DXS基因的植物之一，將該基因轉(zhuǎn)入到薰衣草中異源表達(dá)，顯著提高了轉(zhuǎn)基因薰衣草中主要成分單萜烯精油的含量[19]。

3.3 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)

DXR是MEP途徑中的第二個關(guān)鍵酶，參與催化DXP生成MEP，該過程需要二價金屬離子(Mg2+、Mn2+或Co2+)和NADPH作為輔酶參與。藥用植物雷公藤(Tripterygiumwilfordii)過表達(dá)DXR基因植株的雷公藤內(nèi)酯醇的產(chǎn)量提高，藥用價值增加[20]。DXR過表達(dá)擬南芥植株中類胡蘿卜素的含量也有明顯提高[21]。

3.4 法尼基焦磷酸合酶(FPS)

法尼基焦磷酸合酶(FPS)是天然橡膠合成途徑中限速酶之一，催化兩分子的IPP和一分子的DMAPP以1～4頭尾結(jié)合的方式連續(xù)縮合形成法尼基焦磷酸(FPP)。法尼基焦磷酸是植物體內(nèi)多種萜類衍生物的前體，參與合成的物質(zhì)有類胡蘿卜素、甾醇、質(zhì)體醌和倍半萜衍生物(如植保素)等對植物生長發(fā)育及抗病過程具有重要作用。Cornish K[22]研究發(fā)現(xiàn)，天然橡膠的生物合成速率和FPP濃度呈正相關(guān)，即細(xì)胞內(nèi)FPP濃度越高，天然橡膠的生物合成速率就越快。因此，可以通過分子生物學(xué)技術(shù)過表達(dá)FPS，增加植物細(xì)胞內(nèi)FPP的濃度，從而實現(xiàn)提高天然橡膠產(chǎn)量的目標(biāo)。

3.5 牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(GGPPS)

GGPPS在植物體內(nèi)催化合成萜類物質(zhì)合成前體之一的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)。最早在辣椒(Capsicumannuum)中克隆出GGPPS基因，氨基酸序列比對表明GGPPS包括7個保守的氨基酸殘基結(jié)構(gòu)域。GGPPS過表達(dá)橡膠草株系的根部膠乳含量明顯提高，同時外源施加茉莉酸甲酯(MeJA)使GGPPS的表達(dá)量極顯著提高[10]。

3.6 橡膠延長因子(REF)

橡膠延長因子(REF)是一種橡膠粒子膜蛋白，分子量為14.6 kDa。研究分析表明REF和SRPP(小橡膠粒子蛋白)是來自同一原始基因的同源蛋白，它們屬于一個與植物脅迫相關(guān)的蛋白家族，即REF/SRPP超家族，包含REF和SRPP兩個亞家族。REF在對杜仲葉片、莖皮研究發(fā)現(xiàn)，EuREF1的表達(dá)量與含膠量呈正相關(guān)[16]。

3.7 小橡膠粒子蛋白(SRPP)

橡膠生物合成在乳管細(xì)胞內(nèi)的橡膠粒子中進(jìn)行，小橡膠粒子蛋白(SRPP)在橡膠生物合成中發(fā)揮重要的作用，是決定橡膠生物合成速率和膠乳產(chǎn)量與橡膠質(zhì)量的關(guān)鍵橡膠粒子蛋白。SRPP定位在小橡膠粒子膜上，分子量約為24 kDa，ORF全長612 bp，SRPP與REF具有較高同源性，而REF則已被證實參與天然橡膠的生物合成。Xie Q等[11]在橡膠草成熟根中橡膠合成相關(guān)基因表達(dá)的研究結(jié)果顯示，SRPP極可能通過構(gòu)建一個最有利且穩(wěn)定的橡膠粒子體系而影響橡膠的生物合成和最終存儲，進(jìn)而在橡膠合成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要作用。銀膠菊中也發(fā)現(xiàn)SRPP能促使異戊二烯添加到橡膠分子中[13]。

3.8 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(PT)

IPP與DMAPP通過縮合反應(yīng)生成GPP，以此為基礎(chǔ)連續(xù)加入IPP的鏈伸長反應(yīng)由PT催化合成。PT又稱為異戊烯基二磷酸合酶，根據(jù)產(chǎn)物雙鍵構(gòu)型可分為催化反式雙鍵的E-PT和催化合成順式雙鍵的Z-PT。杜仲中FPS作為E-PT參與合成天然反式橡膠[23]。橡膠轉(zhuǎn)移酶(RT)是PT中的一員，其酶活性影響著天然順式橡膠的質(zhì)量和產(chǎn)量，是產(chǎn)膠能力評價指標(biāo)之一。目前在巴西橡膠樹中發(fā)現(xiàn)2個高度同源的橡膠轉(zhuǎn)移酶RT1和RT2，這兩個酶在膠乳中特異性表達(dá)[24]，同時Schmidt T等[9]研究發(fā)現(xiàn)橡膠草中有RT參與橡膠合成，其活性與橡膠產(chǎn)量呈正相關(guān)。

4 結(jié)論與展望

天然橡膠的生物合成過程復(fù)雜，至今仍不完全清楚橡膠在橡膠樹中確切的生物學(xué)功能。雖然膠乳可起防衛(wèi)作用，但橡膠分子本身并無這種功能，并且橡膠分子在植物中似乎屬于代謝終產(chǎn)物，迄今還未發(fā)現(xiàn)可降解此類分子的具體酶類。盡管已知天然產(chǎn)膠植物中大多數(shù)植物的天然橡膠生產(chǎn)量少、質(zhì)量差、分子量低，但隨著對天然橡膠生物合成途徑研究的不斷深入以及基因工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，天然產(chǎn)膠植物的篩選及改良必將集中開發(fā)高質(zhì)量產(chǎn)膠植物的培育上，可縮短天然橡膠的產(chǎn)膠周期。此外，充分利用當(dāng)下成熟的基因編輯技術(shù)在傳統(tǒng)植物體內(nèi)引入編碼天然橡膠生物合成關(guān)鍵酶基因，或者進(jìn)行天然橡膠合成途徑整體轉(zhuǎn)移的合成生物學(xué)技術(shù)的開發(fā)與利用，將成為未來天然產(chǎn)膠植物研究的熱點，這些策略需要建立在植物中天然橡膠產(chǎn)量和質(zhì)量的生物化學(xué)調(diào)控具有一個全面深入的了解基礎(chǔ)之上。