亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        菜豆種皮開裂過程中木質(zhì)素含量及相關(guān)酶活變化

        2021-06-22 09:05:56安普南楊曉旭馮國軍閆志山劉大軍
        關(guān)鍵詞:菜豆種皮常溫

        安普南,楊曉旭,劉 暢,馮國軍,閆志山,劉大軍

        (黑龍江大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院,哈爾濱 150080)

        0 引 言

        菜豆(PhaseolusvulgarisL.)又名四季豆、棒豆及蕓豆等,短日型植物,在豆科植物種植面積中僅次于大豆[1-2]。菜豆的種皮在菜豆籽粒的形成和生長發(fā)育過程中起著重要的保護(hù)作用,種皮開裂會導(dǎo)致子葉暴露在外,受到外界生物因素和非生物因素的破壞,導(dǎo)致種子結(jié)構(gòu)的破損,嚴(yán)重影響到種子的活力和商品性。探究種皮開裂的原因,對提高菜豆種子質(zhì)量有著重要的意義。

        影響種皮開裂的因素有很多,籽粒性狀的表型由基因型、生態(tài)環(huán)境以及基因型與生態(tài)環(huán)境互作多方面共同決定[3],其中低溫[4]和酚類物質(zhì)積累[5-6]被認(rèn)為是導(dǎo)致大豆種皮開裂的主要原因。許多酚類物質(zhì)是木質(zhì)素合成的前體物質(zhì),參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)木質(zhì)素的合成[7]。有研究表明,相比于正常的種子,開裂的種皮中有更高含量的原花青素和木質(zhì)素[4,8]。木質(zhì)素是植物細(xì)胞中苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)生的最重要的次生代謝產(chǎn)物之一[9];其中苯丙氨酸解氨酶(PAL)是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶,是植物體木質(zhì)素生物合成的的關(guān)鍵酶和限速酶[10]。菜豆PAL2基因被證明與木質(zhì)素前體合成有關(guān),木質(zhì)素的合成來自苯丙烷類代謝途徑中的苯丙氨酸[11]。PAL可被許多外界因素誘導(dǎo),低溫、機(jī)械損傷、光、昆蟲取食等都可以誘導(dǎo)PAL基因的表達(dá)[12]。過氧化物酶(POD)[13]是該途徑木質(zhì)素合成的最后一步酶,木質(zhì)素通常通過過氧化物酶(POD)和漆酶(LAC)與3種主要類型的單木酚醇聚合。種皮開裂的機(jī)理研究在花生[14]、鷹嘴豆[15]、大豆[3-4,8,16]中均有研究,但在菜豆中研究較少,本研究旨在探究菜豆種皮開裂的潛在原因,為改良菜豆種子質(zhì)量奠定理論基礎(chǔ)。

        1 材料方法

        1.1 實驗材料

        通過篩選收獲的菜豆種子,選取了黑大盛冠、黑大黛冠和1871-11 3個具有種皮開裂缺陷的品種為實驗材料。其中黑大黛冠和黑大盛冠擁有相似的莢型,均為綠色寬莢;1871為黃色窄莢。黑大黛冠和1871種皮多為白色,1871的種臍部位有少許黑色;黑大盛冠種皮表面有大量花紋浮現(xiàn)。黑大黛冠和1871種皮的自然開裂率相近,黑大盛冠種皮的自然開裂率相對較低。

        1.2 低溫處理

        在采收的相同品種的菜豆種子中,發(fā)現(xiàn)生殖生長時期平均氣溫低的種子開裂率較高,結(jié)合這一現(xiàn)象,低溫促進(jìn)植物木質(zhì)素生物合成的研究也均有報道。因此推測低溫是導(dǎo)致菜豆種皮木質(zhì)素含量升高的環(huán)境因素之一,并進(jìn)行了實驗驗證。種皮的顏色與花青素的含量相關(guān),花青素的合成也會受到許多環(huán)境因素的誘導(dǎo),為了減少其對實驗的干擾,選取種皮自然開裂率相近、種皮顏色相近的黑大黛冠和1871-11的鼓粒期(R6)豆莢進(jìn)行低溫處理,同一品種常溫處理作對照放置于人工氣候箱內(nèi)。

        常溫條件:25 ℃白天(08:00—18:00);20 ℃黑夜(18:00—08:00)。低溫條件:15 ℃白天(08:00—18:00);10 ℃黑夜(18:00—08:00)。分別取低溫處理后0 d、3 d、6 d、9 d、12 d的種皮測定其木質(zhì)素含量、PAL酶活性,比較分析低溫與常溫狀態(tài)對菜豆種皮木質(zhì)素以及PAL酶活性的差異性。

        1.3 木質(zhì)素含量測定

        選取自然開裂率差距較大的黑大黛冠和黑大盛冠始粒期(R5)、鼓粒期(R6)、初熟期(R7)、完熟期(R8)4個時期的菜豆種皮,將完整的菜豆種皮剝出,加入液氮研磨成粉末,并參考張水明的方法進(jìn)行木質(zhì)素含量測定。將木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 812 5、0.003 906 25 mg·mL-1共6個濃度梯度,測定其OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為y=0.059 1x-0.000 5,R2=0.999 5,線性關(guān)系良好。

        1.4 POD活性測定

        1.4.1 酶液的制備

        將初熟期(R7)黑大黛冠和黑大盛冠的種皮(開裂種皮和正常種皮互為對照)完整剝出,加入液氮研磨成粉末,稱取0.2 g的種皮粉末,加入含有1% PVP的pH=7.0的磷酸緩沖液4 mL,研磨成勻漿,4 000 rmp離心10 min,上清液即為所需酶液。

        1.4.2 反應(yīng)液的制備

        取pH=7.0的磷酸緩沖液50 mL,加入28 μL的愈創(chuàng)木酚,19 μL的30%的過氧化氫。取3 mL反應(yīng)液,0.1 mL酶液,在吸光值為470 nm處測定吸光值,每0.5 min測定1次。

        1.5 PAL活性測定

        在開裂種皮與正常種皮酶活性的對比中,將初熟期(R7)黑大黛冠和黑大盛冠的種皮(開裂種皮和正常種皮互為對照)完整剝出,用索萊寶PAL活性檢測試劑盒測定PAL酶活性。

        在低溫對種皮PAL酶活性的影響實驗中,將低溫處理時長為6 d、9 d、12 d黑大黛冠和黑大盛冠種皮(相同時長的低溫處理與常溫處理互為對照)完整剝出,用索萊寶PAL活性檢測試劑盒測定PAL酶活性。1 g組織在1 mL反應(yīng)體系中1 min使 290 nm 下吸光值變化 0.1 定義為一個酶活性單位。

        1.6 組織學(xué)觀察

        取黑大黛冠初熟期(R7)的正常和開裂的種皮,進(jìn)行石蠟切片。傳統(tǒng)石蠟切片在包埋前進(jìn)行的脫色、透明等處理對種皮內(nèi)物質(zhì)有影響,結(jié)合傳統(tǒng)石蠟切片與Senda等人的方法進(jìn)行修改。

        1.6.1 脫色、包埋與切片

        取黛冠新鮮種皮,修剪成長約1 cm的細(xì)條狀,立即浸泡在乙醇冰醋酸溶液(3∶1,v/v)中進(jìn)行脫色。清水沖洗2次進(jìn)行石蠟包埋,冷卻后用石蠟切片機(jī)制備10 μm切片;在載玻片上涂上蛋白膠,把蠟帶轉(zhuǎn)移到載玻片上,右端貼標(biāo)簽,在42 ℃燙板上展片。

        1.6.2 脫蠟、染色

        將2~5張待染的片子放入二甲苯中脫蠟。停留3~10 min;之后依次放入等量二甲苯和無水乙醇;無水乙醇、乙醇(95%、83%、70%、50%、35%)、蒸餾水中各3~5 min。載玻片從水中取出后晾干,放置一滴DMACA染液10 min用于檢測PA,放置蓋玻片,用光學(xué)顯微鏡觀察到PA被染成藍(lán)色;放置一滴間苯三酚-鹽酸染液,浸泡10 min,然后在光學(xué)顯微鏡下觀察木質(zhì)素被染成粉紅或紫紅色。

        1.6.3 染色劑配制

        間苯三酚—鹽酸染液:在CH3OH和10 M HCl(3∶1,v / v)的混合液中加入1%(w / v)間苯三酚。

        2 結(jié)果分析

        2.1 菜豆種皮開裂發(fā)生的時期

        菜豆生殖生長可劃分為初花期(R1)、盛花期(R2)、初莢期(R3)、盛莢期(R4)、始粒期(R5)、鼓粒期(R6)、初熟期(R7)、完熟期(R8)(圖1(a))。通過對不同時期的菜豆農(nóng)藝性狀的觀察,在R7時期發(fā)現(xiàn)了種皮開裂的菜豆種子(圖1(b))。在黛冠開裂的種皮上往往有褐變出現(xiàn)(圖1(b),(c)),用間苯三酚—鹽酸染液對黛冠正常種子和開裂種子整染后,發(fā)現(xiàn)開裂種皮在裂口邊緣部位變成紅色,在沒有發(fā)生開裂但出現(xiàn)褐變的種皮上也出現(xiàn)了紅色,正常種子卻沒有發(fā)生任何變化(圖1(d)),這說明木質(zhì)素在種皮褐變和開裂的部位沉積。

        圖1 農(nóng)藝性狀觀察Fig.1 Agronomic traits observation

        2.2 低溫處理種皮木質(zhì)素及酶活測定

        對黑大黛冠,1871-11的R6時期豆莢進(jìn)行低溫處理,常溫處理作對照,測定木質(zhì)素含量、PAL酶活性分析比較差異。結(jié)合圖1發(fā)現(xiàn)種皮開裂最先在R7時期出現(xiàn),選擇R6時期的豆莢作為低溫處理材料。

        在常溫處理組中,隨著時間的增長種皮中木質(zhì)素的含量也逐漸升高,結(jié)合圖4種子發(fā)育過程中木質(zhì)素的含量的變化,可以推測是儲存過程中種子的成熟老化導(dǎo)致的。相對于常溫處理組,低溫處理的種皮木質(zhì)素含量顯著升高。在低溫處理的第6天發(fā)現(xiàn)黛冠品種的種皮的木質(zhì)素含量顯著上升,為對照組的1.85倍;在第9天與常溫處理組相比1871冷處理種皮的木質(zhì)素含量也達(dá)到了顯著差異水平,是常溫處理組含量的2.13倍。直到第12天,木質(zhì)素含量持續(xù)升高,并且同一品種間低溫脅迫的種皮木質(zhì)素含量同樣顯著高于常溫處理組(圖2)。

        圖2 不同時間的低溫處理菜豆種皮木質(zhì)素含量變化 Fig.2 Changes of Lignin content in Phaseolus vulgaris seed coats treated with low temperature for different time 注:不同小寫字母表黛冠品種數(shù)據(jù)差異顯著 (P<0.05) , 不同大寫字母表示1871品種數(shù)據(jù)差異顯著 (P<0.05)。下同

        在第6天分別測定了2個品種種皮PAL活性,發(fā)現(xiàn)低溫處理的種皮PAL活性明顯增強(qiáng)。隨著低溫處理時間的增長,PAL活性的差異逐漸加大。在第12天,與常溫處理組相比,同一品種內(nèi)冷處理的PAL酶活性差異達(dá)到最大值,其中1871低溫處理酶活性為27.15 U·g-1,是常溫組的2.65倍,黛冠冷溫處理組酶活為6.08 U·g-1,達(dá)到常溫組的6.06倍,這與圖2所測定的木質(zhì)素含量變化呈相同趨勢(圖3)。

        圖3 不同時間的低溫處理菜豆種皮PAL活性的變化 Fig.3 Changes of PAL activity in bean seed coats treated with low temperature for different time

        2.3 發(fā)育時期種皮木質(zhì)素含量變化

        分別取黛冠和盛冠R5~R8 4個時期的種皮,利用巰基乙酸法測定菜豆種皮中總木質(zhì)素的含量。隨著種子的成熟,種皮中木質(zhì)素的含量逐漸升高,在R7階段出現(xiàn)了開裂的種子(圖1b)。相對于正常種皮,開裂種皮的木質(zhì)素含量明顯上升。R7時期盛冠開裂種皮木質(zhì)素含量為對照組的2.69倍,黛冠開裂種皮木質(zhì)素含量為對照組的2.51倍;R8時期種皮木質(zhì)素含量再次升高,盛冠開裂種皮木質(zhì)素含量達(dá)到3.35 mg·g-1,為對照組的1.15倍;黛冠開裂木質(zhì)素含量升至4.05 mg·g-1,為對照組的4.41倍(圖4)。在R7和R8兩個時期中,開裂種皮中木質(zhì)素的含量相比正常種皮顯著升高,定量分析結(jié)果與上述切片觀察結(jié)果一致??赏茰y木質(zhì)素的含量對種皮開裂的發(fā)生有影響。

        圖4 不同生殖生長時期種皮木質(zhì)素含量Fig.4 Lignin content of seed coat at different reproductive growth stages注:不同小寫字母表盛冠品種數(shù)據(jù)差異顯著 (P<0.05) , 不同大寫字母表示黛冠品種數(shù)據(jù)差異顯著 (P<0.05)

        PAL是這條代謝途徑的第一個也是最重要的酶;POD催化細(xì)胞壁木質(zhì)素生物合成的最后一步。分別測定R8時期的黛冠對照、黛冠開裂、盛冠對照和盛冠開裂種皮的上述酶活性,分析比較其差異性。結(jié)果表明在R8時期,黛冠開裂種皮的PAL、POD活性分別為對照組的1.18倍和20.84倍,差異達(dá)到顯著水平,其中POD活性差異達(dá)到極顯著水平;盛冠開裂種皮的PAL、POD活性分別為對照組的1.13倍和2.80倍,差異性達(dá)到顯著水平,其中POD活性差異也達(dá)到了極顯著水平(圖5)。作為木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵酶,PAL、POD活性的增強(qiáng)促進(jìn)苯丙氨酸次生代謝途徑進(jìn)行,導(dǎo)致木質(zhì)素在種皮中積累。

        圖5 R8時期開裂種子與正常種子種皮PAL和POD活性 Fig.5 PAL and POD activities of seed coats of cracked seeds and normal seeds in R8 注:*表示差異顯著 (P<0.05) , **表示差異極顯著 (P<0.01)。

        2.4 切片觀察

        用間苯三酚-鹽酸染色觀察種皮中木質(zhì)素的積累情況(圖6),在種皮的背部切片中,正常種皮切片沒有顏色變化(圖6(c));開裂種皮的角質(zhì)層、柵欄層和墊狀物都被染成不同程度的紅色(圖6(a)、6(b)),說明木質(zhì)素在開裂種皮的背部累積。種臍切片中可發(fā)現(xiàn)種臍部位被間苯三酚鹽酸染液染成分紅或紫紅色(圖6(d)、6(e)),這與報道的木質(zhì)素會在種臍部位沉積一致;種臍部位的種皮有兩層?xùn)艡趯?,開裂種皮的上柵欄層和下柵欄層的連接部位染成紅色(圖6(d)),說明木質(zhì)素在上下柵欄層的連接部位沉積。并且,在開裂種皮切片的過程中往往會出現(xiàn)柵欄細(xì)胞與墊狀物細(xì)胞分離、錯位,墊狀物細(xì)胞基部與其下部的薄壁細(xì)胞分離的現(xiàn)象(圖6(f)),這也說明木質(zhì)素的沉積會降低種皮中各個細(xì)胞層連接緊密程度,在外力的作用下更容易發(fā)生開裂。

        3 討 論

        菜豆種皮開裂嚴(yán)重影響菜豆品種種子質(zhì)量,結(jié)合前人在大豆等豆科植物中的研究,對菜豆種皮開裂發(fā)生的時期和主要原因進(jìn)行討論。

        3.1 菜豆種皮開裂的時期

        種皮的分化是在雙受精之后開始的,受精完成后中央細(xì)胞會受到一個受精信號,該信號使得珠被細(xì)胞的細(xì)胞層開始分化形成種皮。在豆類植株生殖生長時期(R1~R8)都有可能發(fā)生種皮開裂的現(xiàn)象[17],在大豆種皮開裂的研究中最先在始粒期(R5)發(fā)現(xiàn)了種皮開裂的種子[18];本研究在R7時期發(fā)現(xiàn)了裂種皮的籽粒,種皮開裂的同時往往伴隨著種皮褐變的發(fā)生,在同一個豆莢中的種子沒有發(fā)生開裂的種皮背部也會有褐變現(xiàn)象出現(xiàn)(圖1(b))

        3.2 低溫促進(jìn)種皮木質(zhì)化

        木質(zhì)化現(xiàn)象是果實在受到低溫冷害等脅迫時的一種癥狀。通過對R6時期的豆莢低溫處理發(fā)現(xiàn),隨著低溫時間的延長,種皮中木質(zhì)素的含量升高。發(fā)現(xiàn)低溫會加快菜豆的苯丙氨酸代謝途徑,增強(qiáng)該途徑中的酶活性,導(dǎo)致木質(zhì)素在組織中累積。在擬南芥的葉片中發(fā)現(xiàn)低溫會影響AtPAL1和AtPAL2的表達(dá)[19];并且低溫脅迫也會導(dǎo)致煙草中PAL等苯丙烷途徑表達(dá)基因的上調(diào),從而導(dǎo)致煙草木質(zhì)素合成增加[20]。實驗結(jié)果表明低溫增加苯丙烷途徑中PAL酶活性,加快木質(zhì)素的合成,導(dǎo)致木質(zhì)素在種皮中沉積。

        3.3 種皮內(nèi)PAL和POD酶活性增強(qiáng)促進(jìn)了木質(zhì)素合成

        植物體內(nèi)木質(zhì)素合成的最主要的途徑是苯丙烷途徑,種皮內(nèi)木質(zhì)素的累計與苯丙烷途徑的促進(jìn)有很大的關(guān)系。對R8時期開裂種皮和正常種皮中PAL和POD兩種酶活性以及木質(zhì)素含量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)無論是黛冠還是盛冠,裂種皮的兩種酶活性都要顯著高于正常種皮,其中POD活性的差別最為明顯,最高可達(dá)到正常種皮的20.80倍。在無殼美洲南瓜的研究中,薛應(yīng)鈺等[21]發(fā)現(xiàn)無殼美洲南瓜種皮中缺乏木質(zhì)素的合成,并且PAL和POD酶活性的變化與木質(zhì)素合成呈正相關(guān)性。PAL和POD作為苯丙烷途徑合成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶,在許多植物的研究中也證實了木質(zhì)化與 PAL活性呈正相關(guān)[17]。研究結(jié)果也證實了PAL和POD的活性與木質(zhì)素含量呈正相關(guān)這一觀點。

        3.4 種皮木質(zhì)素沉積導(dǎo)致種皮開裂

        開裂的種皮往往伴隨著木質(zhì)素含量的升高。通過石蠟切片染色觀察,發(fā)現(xiàn)在黛冠開裂種皮的背部都有木質(zhì)素的沉積,并且在木質(zhì)素沉積的種皮中,出現(xiàn)了柵欄細(xì)胞、墊狀物細(xì)胞和薄壁細(xì)胞之間錯位分離的現(xiàn)象。說明木質(zhì)素的沉積會降低種皮中各個細(xì)胞層連接緊密性,在外力的作用下更容易發(fā)生開裂。種皮木質(zhì)素定量分析與切片觀察的結(jié)果一致,隨著植株生殖生長的進(jìn)行,種皮中木質(zhì)素含量逐漸升高,并且開裂種皮中的木質(zhì)素含量要顯著高于正常種皮。也有研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量增加導(dǎo)致種皮的開裂:Mineo S等[8]在大豆的種皮切片中發(fā)現(xiàn),大豆開裂種皮的柵欄層和墊狀物細(xì)胞層的連接處有木質(zhì)素的沉積。文獻(xiàn)[4]指出原花青素和木質(zhì)素在種皮內(nèi)沉積會降低種皮的物理強(qiáng)度,隨著子葉的生長發(fā)育在種皮腹部形成裂紋。木質(zhì)素的沉積是種皮開裂的主要原因。

        4 結(jié) 論

        在菜豆經(jīng)低溫處理之后種皮木質(zhì)素的含量顯著上升,但由于菜豆的種皮開裂也受到子葉發(fā)育和菜豆生殖生長等方面的影響,在短時間內(nèi)沒有觀察到開裂種子的產(chǎn)生。綜上所述,得到了兩個結(jié)論:①低溫增強(qiáng)了菜豆種皮內(nèi)PAL酶活性,導(dǎo)致木質(zhì)素在菜豆的種皮背部沉積;②開裂的種皮中木質(zhì)素含量及相關(guān)酶活性要顯著高于正常種皮,木質(zhì)素的沉積使得種皮各細(xì)胞層之間更容易發(fā)生分離從而導(dǎo)致種皮開裂。

        猜你喜歡
        菜豆種皮常溫
        東北地理所發(fā)現(xiàn)PG 031基因具有改良大豆種皮吸水性的應(yīng)用潛力
        滲透固結(jié)型環(huán)氧樹脂基油氣井常溫固泥材料
        常溫發(fā)黑工藝在軸承工裝上的應(yīng)用
        哈爾濱軸承(2021年1期)2021-07-21 05:43:14
        閩產(chǎn)薏苡種皮油的提取工藝研究
        常溫磷化工藝技術(shù)漫談
        應(yīng)用種皮葉綠素?zé)晒庵甘緹煵莘N子成熟度的研究
        新型捕收劑DTX-1常溫分步浮選東鞍山鐵礦混磁精
        金屬礦山(2014年7期)2014-03-20 14:19:52
        脫脂椰子種皮多肽的抗氧化活性研究
        菜豆采后生理及貯藏技術(shù)的研究進(jìn)展
        春播菜豆如何實現(xiàn)一播全苗
        長江蔬菜(2013年23期)2013-03-11 15:09:39
        国产精品一区二区三区黄片视频| 末发育娇小性色xxxxx视频| 91精品手机国产在线能| 放荡人妻一区二区三区| 麻豆久久91精品国产| 国产免费艾彩sm调教视频| 国产亚洲精品久久久久久久久动漫| 久久久国产精品ⅤA麻豆百度| 视频一区视频二区自拍偷拍| 久久久久99精品成人片| 欧美 国产 日产 韩国 在线| 无码伊人66久久大杳蕉网站谷歌| 亚洲一区二区三区成人网| 亚洲日韩国产av无码无码精品| 伊人久久综合精品无码av专区| 久久精品午夜免费看| 日本一区二区三区不卡在线| 精品国产性色无码av网站| 99久久精品免费看国产情侣| 久久亚洲精品一区二区| 看女人毛茸茸下面视频| 在线视频观看免费视频18| 国产精品无码无片在线观看3D| 免费人成网站在线观看| 每日更新在线观看av| 国产精品成人一区二区三区 | 亚洲最大在线视频一区二区| 亚洲图片日本视频免费| 日本国产视频| 熟妇人妻丰满少妇一区| 成人午夜高潮a∨猛片| 亚洲av无码专区在线电影| 中文字幕一区韩国三级| 国产精品国产三级国产专区不| 色综合色狠狠天天综合色| 中文字幕一区二区三区乱码不卡| 国产精品亚洲精品专区| 日本a片大尺度高潮无码| 精品无码一区二区三区爱欲九九| 国产丝袜高跟美腿一区在线| 精品人妻一区二区三区浪人在线|