安普南，楊曉旭，劉 暢，馮國軍，閆志山，劉大軍

(黑龍江大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080)

0 引 言

菜豆(PhaseolusvulgarisL.)又名四季豆、棒豆及蕓豆等，短日型植物，在豆科植物種植面積中僅次于大豆[1-2]。菜豆的種皮在菜豆籽粒的形成和生長發(fā)育過程中起著重要的保護(hù)作用，種皮開裂會(huì)導(dǎo)致子葉暴露在外，受到外界生物因素和非生物因素的破壞，導(dǎo)致種子結(jié)構(gòu)的破損，嚴(yán)重影響到種子的活力和商品性。探究種皮開裂的原因，對(duì)提高菜豆種子質(zhì)量有著重要的意義。

影響種皮開裂的因素有很多，籽粒性狀的表型由基因型、生態(tài)環(huán)境以及基因型與生態(tài)環(huán)境互作多方面共同決定[3]，其中低溫[4]和酚類物質(zhì)積累[5-6]被認(rèn)為是導(dǎo)致大豆種皮開裂的主要原因。許多酚類物質(zhì)是木質(zhì)素合成的前體物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)木質(zhì)素的合成[7]。有研究表明，相比于正常的種子，開裂的種皮中有更高含量的原花青素和木質(zhì)素[4,8]。木質(zhì)素是植物細(xì)胞中苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)生的最重要的次生代謝產(chǎn)物之一[9]；其中苯丙氨酸解氨酶(PAL)是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶，是植物體木質(zhì)素生物合成的的關(guān)鍵酶和限速酶[10]。菜豆PAL2基因被證明與木質(zhì)素前體合成有關(guān)，木質(zhì)素的合成來自苯丙烷類代謝途徑中的苯丙氨酸[11]。PAL可被許多外界因素誘導(dǎo)，低溫、機(jī)械損傷、光、昆蟲取食等都可以誘導(dǎo)PAL基因的表達(dá)[12]。過氧化物酶(POD)[13]是該途徑木質(zhì)素合成的最后一步酶，木質(zhì)素通常通過過氧化物酶(POD)和漆酶(LAC)與3種主要類型的單木酚醇聚合。種皮開裂的機(jī)理研究在花生[14]、鷹嘴豆[15]、大豆[3-4,8,16]中均有研究，但在菜豆中研究較少，本研究旨在探究菜豆種皮開裂的潛在原因，為改良菜豆種子質(zhì)量奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

通過篩選收獲的菜豆種子，選取了黑大盛冠、黑大黛冠和1871-11 3個(gè)具有種皮開裂缺陷的品種為實(shí)驗(yàn)材料。其中黑大黛冠和黑大盛冠擁有相似的莢型，均為綠色寬莢；1871為黃色窄莢。黑大黛冠和1871種皮多為白色，1871的種臍部位有少許黑色；黑大盛冠種皮表面有大量花紋浮現(xiàn)。黑大黛冠和1871種皮的自然開裂率相近，黑大盛冠種皮的自然開裂率相對(duì)較低。

1.2 低溫處理

在采收的相同品種的菜豆種子中，發(fā)現(xiàn)生殖生長時(shí)期平均氣溫低的種子開裂率較高，結(jié)合這一現(xiàn)象，低溫促進(jìn)植物木質(zhì)素生物合成的研究也均有報(bào)道。因此推測(cè)低溫是導(dǎo)致菜豆種皮木質(zhì)素含量升高的環(huán)境因素之一，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。種皮的顏色與花青素的含量相關(guān)，花青素的合成也會(huì)受到許多環(huán)境因素的誘導(dǎo)，為了減少其對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，選取種皮自然開裂率相近、種皮顏色相近的黑大黛冠和1871-11的鼓粒期(R6)豆莢進(jìn)行低溫處理，同一品種常溫處理作對(duì)照放置于人工氣候箱內(nèi)。

常溫條件：25 ℃白天(08：00—18：00)；20 ℃黑夜(18：00—08：00)。低溫條件：15 ℃白天(08：00—18：00)；10 ℃黑夜(18：00—08：00)。分別取低溫處理后0 d、3 d、6 d、9 d、12 d的種皮測(cè)定其木質(zhì)素含量、PAL酶活性，比較分析低溫與常溫狀態(tài)對(duì)菜豆種皮木質(zhì)素以及PAL酶活性的差異性。

1.3 木質(zhì)素含量測(cè)定

選取自然開裂率差距較大的黑大黛冠和黑大盛冠始粒期(R5)、鼓粒期(R6)、初熟期(R7)、完熟期(R8)4個(gè)時(shí)期的菜豆種皮，將完整的菜豆種皮剝出，加入液氮研磨成粉末，并參考張水明的方法進(jìn)行木質(zhì)素含量測(cè)定。將木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 812 5、0.003 906 25 mg·mL-1共6個(gè)濃度梯度,測(cè)定其OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=0.059 1x-0.000 5，R2=0.999 5,線性關(guān)系良好。

1.4 POD活性測(cè)定

1.4.1 酶液的制備

將初熟期(R7)黑大黛冠和黑大盛冠的種皮(開裂種皮和正常種皮互為對(duì)照)完整剝出，加入液氮研磨成粉末，稱取0.2 g的種皮粉末，加入含有1% PVP的pH=7.0的磷酸緩沖液4 mL，研磨成勻漿，4 000 rmp離心10 min，上清液即為所需酶液。

1.4.2 反應(yīng)液的制備

取pH=7.0的磷酸緩沖液50 mL，加入28 μL的愈創(chuàng)木酚，19 μL的30%的過氧化氫。取3 mL反應(yīng)液，0.1 mL酶液，在吸光值為470 nm處測(cè)定吸光值，每0.5 min測(cè)定1次。

1.5 PAL活性測(cè)定

在開裂種皮與正常種皮酶活性的對(duì)比中，將初熟期(R7)黑大黛冠和黑大盛冠的種皮(開裂種皮和正常種皮互為對(duì)照)完整剝出，用索萊寶PAL活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定PAL酶活性。

在低溫對(duì)種皮PAL酶活性的影響實(shí)驗(yàn)中，將低溫處理時(shí)長為6 d、9 d、12 d黑大黛冠和黑大盛冠種皮(相同時(shí)長的低溫處理與常溫處理互為對(duì)照)完整剝出，用索萊寶PAL活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定PAL酶活性。1 g組織在1 mL反應(yīng)體系中1 min使 290 nm 下吸光值變化 0.1 定義為一個(gè)酶活性單位。

1.6 組織學(xué)觀察

取黑大黛冠初熟期(R7)的正常和開裂的種皮，進(jìn)行石蠟切片。傳統(tǒng)石蠟切片在包埋前進(jìn)行的脫色、透明等處理對(duì)種皮內(nèi)物質(zhì)有影響，結(jié)合傳統(tǒng)石蠟切片與Senda等人的方法進(jìn)行修改。

1.6.1 脫色、包埋與切片

取黛冠新鮮種皮，修剪成長約1 cm的細(xì)條狀，立即浸泡在乙醇冰醋酸溶液(3∶1，v/v)中進(jìn)行脫色。清水沖洗2次進(jìn)行石蠟包埋，冷卻后用石蠟切片機(jī)制備10 μm切片；在載玻片上涂上蛋白膠，把蠟帶轉(zhuǎn)移到載玻片上，右端貼標(biāo)簽，在42 ℃燙板上展片。

1.6.2 脫蠟、染色

將2～5張待染的片子放入二甲苯中脫蠟。停留3～10 min；之后依次放入等量二甲苯和無水乙醇；無水乙醇、乙醇(95%、83%、70%、50%、35%)、蒸餾水中各3～5 min。載玻片從水中取出后晾干，放置一滴DMACA染液10 min用于檢測(cè)PA，放置蓋玻片，用光學(xué)顯微鏡觀察到PA被染成藍(lán)色；放置一滴間苯三酚-鹽酸染液，浸泡10 min，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察木質(zhì)素被染成粉紅或紫紅色。

1.6.3 染色劑配制

間苯三酚—鹽酸染液：在CH3OH和10 M HCl(3∶1，v / v)的混合液中加入1%(w / v)間苯三酚。

2 結(jié)果分析

2.1 菜豆種皮開裂發(fā)生的時(shí)期

菜豆生殖生長可劃分為初花期(R1)、盛花期(R2)、初莢期(R3)、盛莢期(R4)、始粒期(R5)、鼓粒期(R6)、初熟期(R7)、完熟期(R8)(圖1(a))。通過對(duì)不同時(shí)期的菜豆農(nóng)藝性狀的觀察，在R7時(shí)期發(fā)現(xiàn)了種皮開裂的菜豆種子(圖1(b))。在黛冠開裂的種皮上往往有褐變出現(xiàn)(圖1(b)，(c))，用間苯三酚—鹽酸染液對(duì)黛冠正常種子和開裂種子整染后，發(fā)現(xiàn)開裂種皮在裂口邊緣部位變成紅色，在沒有發(fā)生開裂但出現(xiàn)褐變的種皮上也出現(xiàn)了紅色，正常種子卻沒有發(fā)生任何變化(圖1(d))，這說明木質(zhì)素在種皮褐變和開裂的部位沉積。

圖1 農(nóng)藝性狀觀察Fig.1 Agronomic traits observation

2.2 低溫處理種皮木質(zhì)素及酶活測(cè)定

對(duì)黑大黛冠，1871-11的R6時(shí)期豆莢進(jìn)行低溫處理，常溫處理作對(duì)照，測(cè)定木質(zhì)素含量、PAL酶活性分析比較差異。結(jié)合圖1發(fā)現(xiàn)種皮開裂最先在R7時(shí)期出現(xiàn)，選擇R6時(shí)期的豆莢作為低溫處理材料。

在常溫處理組中，隨著時(shí)間的增長種皮中木質(zhì)素的含量也逐漸升高，結(jié)合圖4種子發(fā)育過程中木質(zhì)素的含量的變化，可以推測(cè)是儲(chǔ)存過程中種子的成熟老化導(dǎo)致的。相對(duì)于常溫處理組，低溫處理的種皮木質(zhì)素含量顯著升高。在低溫處理的第6天發(fā)現(xiàn)黛冠品種的種皮的木質(zhì)素含量顯著上升，為對(duì)照組的1.85倍；在第9天與常溫處理組相比1871冷處理種皮的木質(zhì)素含量也達(dá)到了顯著差異水平，是常溫處理組含量的2.13倍。直到第12天，木質(zhì)素含量持續(xù)升高，并且同一品種間低溫脅迫的種皮木質(zhì)素含量同樣顯著高于常溫處理組(圖2)。

圖2 不同時(shí)間的低溫處理菜豆種皮木質(zhì)素含量變化 Fig.2 Changes of Lignin content in Phaseolus vulgaris seed coats treated with low temperature for different time 注:不同小寫字母表黛冠品種數(shù)據(jù)差異顯著 (P<0.05) , 不同大寫字母表示1871品種數(shù)據(jù)差異顯著 (P<0.05)。下同

在第6天分別測(cè)定了2個(gè)品種種皮PAL活性，發(fā)現(xiàn)低溫處理的種皮PAL活性明顯增強(qiáng)。隨著低溫處理時(shí)間的增長，PAL活性的差異逐漸加大。在第12天，與常溫處理組相比，同一品種內(nèi)冷處理的PAL酶活性差異達(dá)到最大值，其中1871低溫處理酶活性為27.15 U·g-1，是常溫組的2.65倍，黛冠冷溫處理組酶活為6.08 U·g-1，達(dá)到常溫組的6.06倍，這與圖2所測(cè)定的木質(zhì)素含量變化呈相同趨勢(shì)(圖3)。

圖3 不同時(shí)間的低溫處理菜豆種皮PAL活性的變化 Fig.3 Changes of PAL activity in bean seed coats treated with low temperature for different time

2.3 發(fā)育時(shí)期種皮木質(zhì)素含量變化

分別取黛冠和盛冠R5～R8 4個(gè)時(shí)期的種皮，利用巰基乙酸法測(cè)定菜豆種皮中總木質(zhì)素的含量。隨著種子的成熟，種皮中木質(zhì)素的含量逐漸升高，在R7階段出現(xiàn)了開裂的種子(圖1b)。相對(duì)于正常種皮，開裂種皮的木質(zhì)素含量明顯上升。R7時(shí)期盛冠開裂種皮木質(zhì)素含量為對(duì)照組的2.69倍，黛冠開裂種皮木質(zhì)素含量為對(duì)照組的2.51倍；R8時(shí)期種皮木質(zhì)素含量再次升高，盛冠開裂種皮木質(zhì)素含量達(dá)到3.35 mg·g-1，為對(duì)照組的1.15倍；黛冠開裂木質(zhì)素含量升至4.05 mg·g-1，為對(duì)照組的4.41倍(圖4)。在R7和R8兩個(gè)時(shí)期中，開裂種皮中木質(zhì)素的含量相比正常種皮顯著升高，定量分析結(jié)果與上述切片觀察結(jié)果一致?？赏茰y(cè)木質(zhì)素的含量對(duì)種皮開裂的發(fā)生有影響。

圖4 不同生殖生長時(shí)期種皮木質(zhì)素含量Fig.4 Lignin content of seed coat at different reproductive growth stages注:不同小寫字母表盛冠品種數(shù)據(jù)差異顯著 (P<0.05) , 不同大寫字母表示黛冠品種數(shù)據(jù)差異顯著 (P<0.05)

PAL是這條代謝途徑的第一個(gè)也是最重要的酶；POD催化細(xì)胞壁木質(zhì)素生物合成的最后一步。分別測(cè)定R8時(shí)期的黛冠對(duì)照、黛冠開裂、盛冠對(duì)照和盛冠開裂種皮的上述酶活性，分析比較其差異性。結(jié)果表明在R8時(shí)期，黛冠開裂種皮的PAL、POD活性分別為對(duì)照組的1.18倍和20.84倍，差異達(dá)到顯著水平，其中POD活性差異達(dá)到極顯著水平；盛冠開裂種皮的PAL、POD活性分別為對(duì)照組的1.13倍和2.80倍，差異性達(dá)到顯著水平，其中POD活性差異也達(dá)到了極顯著水平(圖5)。作為木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵酶，PAL、POD活性的增強(qiáng)促進(jìn)苯丙氨酸次生代謝途徑進(jìn)行，導(dǎo)致木質(zhì)素在種皮中積累。

圖5 R8時(shí)期開裂種子與正常種子種皮PAL和POD活性 Fig.5 PAL and POD activities of seed coats of cracked seeds and normal seeds in R8 注:*表示差異顯著 (P<0.05) , **表示差異極顯著 (P<0.01)。

2.4 切片觀察

用間苯三酚-鹽酸染色觀察種皮中木質(zhì)素的積累情況(圖6)，在種皮的背部切片中，正常種皮切片沒有顏色變化(圖6(c))；開裂種皮的角質(zhì)層、柵欄層和墊狀物都被染成不同程度的紅色(圖6(a)、6(b))，說明木質(zhì)素在開裂種皮的背部累積。種臍切片中可發(fā)現(xiàn)種臍部位被間苯三酚鹽酸染液染成分紅或紫紅色(圖6(d)、6(e))，這與報(bào)道的木質(zhì)素會(huì)在種臍部位沉積一致；種臍部位的種皮有兩層?xùn)艡趯?，開裂種皮的上柵欄層和下柵欄層的連接部位染成紅色(圖6(d))，說明木質(zhì)素在上下柵欄層的連接部位沉積。并且，在開裂種皮切片的過程中往往會(huì)出現(xiàn)柵欄細(xì)胞與墊狀物細(xì)胞分離、錯(cuò)位，墊狀物細(xì)胞基部與其下部的薄壁細(xì)胞分離的現(xiàn)象(圖6(f))，這也說明木質(zhì)素的沉積會(huì)降低種皮中各個(gè)細(xì)胞層連接緊密程度，在外力的作用下更容易發(fā)生開裂。

3 討 論

菜豆種皮開裂嚴(yán)重影響菜豆品種種子質(zhì)量，結(jié)合前人在大豆等豆科植物中的研究，對(duì)菜豆種皮開裂發(fā)生的時(shí)期和主要原因進(jìn)行討論。

3.1 菜豆種皮開裂的時(shí)期

種皮的分化是在雙受精之后開始的，受精完成后中央細(xì)胞會(huì)受到一個(gè)受精信號(hào)，該信號(hào)使得珠被細(xì)胞的細(xì)胞層開始分化形成種皮。在豆類植株生殖生長時(shí)期(R1～R8)都有可能發(fā)生種皮開裂的現(xiàn)象[17]，在大豆種皮開裂的研究中最先在始粒期(R5)發(fā)現(xiàn)了種皮開裂的種子[18]；本研究在R7時(shí)期發(fā)現(xiàn)了裂種皮的籽粒，種皮開裂的同時(shí)往往伴隨著種皮褐變的發(fā)生，在同一個(gè)豆莢中的種子沒有發(fā)生開裂的種皮背部也會(huì)有褐變現(xiàn)象出現(xiàn)(圖1(b))

3.2 低溫促進(jìn)種皮木質(zhì)化

木質(zhì)化現(xiàn)象是果實(shí)在受到低溫冷害等脅迫時(shí)的一種癥狀。通過對(duì)R6時(shí)期的豆莢低溫處理發(fā)現(xiàn)，隨著低溫時(shí)間的延長，種皮中木質(zhì)素的含量升高。發(fā)現(xiàn)低溫會(huì)加快菜豆的苯丙氨酸代謝途徑，增強(qiáng)該途徑中的酶活性，導(dǎo)致木質(zhì)素在組織中累積。在擬南芥的葉片中發(fā)現(xiàn)低溫會(huì)影響AtPAL1和AtPAL2的表達(dá)[19]；并且低溫脅迫也會(huì)導(dǎo)致煙草中PAL等苯丙烷途徑表達(dá)基因的上調(diào)，從而導(dǎo)致煙草木質(zhì)素合成增加[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低溫增加苯丙烷途徑中PAL酶活性，加快木質(zhì)素的合成，導(dǎo)致木質(zhì)素在種皮中沉積。

3.3 種皮內(nèi)PAL和POD酶活性增強(qiáng)促進(jìn)了木質(zhì)素合成

植物體內(nèi)木質(zhì)素合成的最主要的途徑是苯丙烷途徑，種皮內(nèi)木質(zhì)素的累計(jì)與苯丙烷途徑的促進(jìn)有很大的關(guān)系。對(duì)R8時(shí)期開裂種皮和正常種皮中PAL和POD兩種酶活性以及木質(zhì)素含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)無論是黛冠還是盛冠，裂種皮的兩種酶活性都要顯著高于正常種皮，其中POD活性的差別最為明顯，最高可達(dá)到正常種皮的20.80倍。在無殼美洲南瓜的研究中，薛應(yīng)鈺等[21]發(fā)現(xiàn)無殼美洲南瓜種皮中缺乏木質(zhì)素的合成，并且PAL和POD酶活性的變化與木質(zhì)素合成呈正相關(guān)性。PAL和POD作為苯丙烷途徑合成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶，在許多植物的研究中也證實(shí)了木質(zhì)化與 PAL活性呈正相關(guān)[17]。研究結(jié)果也證實(shí)了PAL和POD的活性與木質(zhì)素含量呈正相關(guān)這一觀點(diǎn)。

3.4 種皮木質(zhì)素沉積導(dǎo)致種皮開裂

開裂的種皮往往伴隨著木質(zhì)素含量的升高。通過石蠟切片染色觀察，發(fā)現(xiàn)在黛冠開裂種皮的背部都有木質(zhì)素的沉積，并且在木質(zhì)素沉積的種皮中，出現(xiàn)了柵欄細(xì)胞、墊狀物細(xì)胞和薄壁細(xì)胞之間錯(cuò)位分離的現(xiàn)象。說明木質(zhì)素的沉積會(huì)降低種皮中各個(gè)細(xì)胞層連接緊密性，在外力的作用下更容易發(fā)生開裂。種皮木質(zhì)素定量分析與切片觀察的結(jié)果一致，隨著植株生殖生長的進(jìn)行，種皮中木質(zhì)素含量逐漸升高，并且開裂種皮中的木質(zhì)素含量要顯著高于正常種皮。也有研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量增加導(dǎo)致種皮的開裂：Mineo S等[8]在大豆的種皮切片中發(fā)現(xiàn)，大豆開裂種皮的柵欄層和墊狀物細(xì)胞層的連接處有木質(zhì)素的沉積。文獻(xiàn)[4]指出原花青素和木質(zhì)素在種皮內(nèi)沉積會(huì)降低種皮的物理強(qiáng)度，隨著子葉的生長發(fā)育在種皮腹部形成裂紋。木質(zhì)素的沉積是種皮開裂的主要原因。

4 結(jié) 論

在菜豆經(jīng)低溫處理之后種皮木質(zhì)素的含量顯著上升，但由于菜豆的種皮開裂也受到子葉發(fā)育和菜豆生殖生長等方面的影響，在短時(shí)間內(nèi)沒有觀察到開裂種子的產(chǎn)生。綜上所述，得到了兩個(gè)結(jié)論：①低溫增強(qiáng)了菜豆種皮內(nèi)PAL酶活性，導(dǎo)致木質(zhì)素在菜豆的種皮背部沉積；②開裂的種皮中木質(zhì)素含量及相關(guān)酶活性要顯著高于正常種皮，木質(zhì)素的沉積使得種皮各細(xì)胞層之間更容易發(fā)生分離從而導(dǎo)致種皮開裂。