李瑞岐，區(qū)頌邦，廖早文，林海燕，李迪，張清學(xué)，王文軍*

(1.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖內(nèi)分泌專科，廣州 510120；2.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，喀什 840000)

透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)是一種非硫酸化的糖胺聚糖聚合物，天然存在于許多哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)中，也是女性生殖道中含量最豐富的大分子之一[1]。EmbryoGlue是一種專用于胚胎移植的富含HA(0.5 mg/ml)的試劑。一些臨床研究顯示，EmbryoGlue作為移植液，可提高胚胎植入率和臨床妊娠率[2-4]。一些臨床研究結(jié)果并不支持該結(jié)論[5-7]。使用富含HA的培養(yǎng)基作為移植液的臨床效果，在國(guó)內(nèi)外仍存在較大爭(zhēng)議。因此，為進(jìn)一步明確EmbryoGlue對(duì)胚胎移植患者臨床結(jié)局的影響和使用范圍，本研究回顧性分析了在同一時(shí)間段內(nèi)使用EmbryoGlue(Vitrolife，10085，瑞典)或者G2囊胚培養(yǎng)基(Vitrolife，10132，瑞典)作為移植液進(jìn)行胚胎移植的患者的臨床結(jié)局。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2018年8月至2019年1月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院行IVF助孕的患者臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡≤45歲；(2)新鮮胚胎移植周期或者FET周期；(3)胚胎移植液為EmbryoGlue或者G2培養(yǎng)基。排除標(biāo)準(zhǔn)：二步移植周期、晚補(bǔ)救ICSI周期、移植日胚胎質(zhì)量未達(dá)到可用胚胎標(biāo)準(zhǔn)的周期。

本研究共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的患者胚胎移植資料1 207個(gè)周期，根據(jù)所用移植液不同分為EmbryoGlue組(n=596)和G2組(n=611)。

二、研究方法

1.胚胎培養(yǎng)：本研究所有患者的配子和胚胎均使用Vitrolife公司G5系列培養(yǎng)基進(jìn)行體外受精和胚胎培養(yǎng)。受精當(dāng)天(D0)患者配子以及ICSI后的卵母細(xì)胞均培養(yǎng)在G-IVF培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。取卵第2天(D1)將受精卵轉(zhuǎn)移至平衡過(guò)的G1培養(yǎng)基培養(yǎng)至D3。如果進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，則在D3時(shí)將胚胎移入平衡過(guò)的G2培養(yǎng)基培養(yǎng)至D5或者D6。D0至D3培養(yǎng)環(huán)境為37℃、6%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱。囊胚培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、6%CO2、5%O2飽和濕度培養(yǎng)箱。

2.胚胎解凍：本研究所有冷凍液和解凍液分別為玻璃化冷凍液(加滕，VT101，日本)和玻璃化解凍液(加滕，VT102，日本)。胚胎解凍前預(yù)熱1號(hào)解凍液至37℃，2～4號(hào)解凍液平衡至室溫。解凍時(shí)將裝有胚胎的載桿從液氮拿出后快速摔下載桿上的液氮，并迅速將載桿的前端浸入1號(hào)解凍液，1 min后將胚胎分別轉(zhuǎn)移至2～4號(hào)解凍液，停留時(shí)間分別為3 min、5 min、5 min。結(jié)束后，將胚胎培養(yǎng)至G2培養(yǎng)基，觀察胚胎存活情況并評(píng)分。在胚胎移植開(kāi)始前1 h，挑選所要移植的胚胎至移植液(EmbryoGlue或G2)中。

3.觀察指標(biāo)：臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%，活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)(包括異位妊娠)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計(jì)方法

結(jié) 果

一、兩組患者的基本臨床資料及妊娠結(jié)局比較

本研究共納入1 207個(gè)胚胎移植周期，EmbryoGlue組和G2組分別為596和611個(gè)周期，除EmbryoGlue組的胚胎移植數(shù)顯著低于G2組(P<0.05)外，兩組患者的其他基本臨床資料以及臨床妊娠結(jié)局比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的基本臨床資料及妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

二、行卵裂期胚胎移植的兩組患者基本情況及妊娠結(jié)局比較

患者中行卵裂期胚胎移植的共有836個(gè)周期，EmbryoGlue組和G2組的周期數(shù)分別為408和428個(gè)周期。兩組患者基本資料除移植胚胎數(shù)[(1.84±0.50)vs.(1.87±0.46)](P<0.05)外，其他基本資料比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；兩組患者的臨床妊娠率、胚胎種植率、活產(chǎn)率以及流產(chǎn)率無(wú)論是在新鮮周期還是FET周期，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 卵裂期胚胎移植的兩組患者基本情況及妊娠結(jié)局[(-±s)，%]

三、EmbryoGlue對(duì)囊胚移植妊娠結(jié)局的影響

患者中行囊胚移植的共有371個(gè)周期，EmbryoGlue組和G2組的周期數(shù)分別為188和183個(gè)周期，兩組患者的一般資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；新鮮周期囊胚移植的周期數(shù)較少(n=65)，各項(xiàng)臨床結(jié)局觀察指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；FET周期囊胚移植的結(jié)果顯示，EmbryoGlue組的臨床妊娠率和種植率均顯著高于G2組(P<0.05)，EmbryoGlue組的活產(chǎn)率雖然高于G2組，但差異尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組間的流產(chǎn)率無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 囊胚移植的兩組患者基本情況及妊娠結(jié)局[(-±s)，%]

四、EmbryoGlue對(duì)FET周期妊娠結(jié)局影響的Logistic回歸分析

通過(guò)logistic回歸分析，對(duì)可能影響FET囊胚移植臨床結(jié)局的因素進(jìn)行校正分析。結(jié)果顯示，在校正女方年齡、治療周期數(shù)、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)胚數(shù)以及是否自然周期移植因素后，EmbryoGlue對(duì)臨床妊娠率的影響仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)，對(duì)種植率和活產(chǎn)率的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4 FET周期臨床結(jié)局影響因素的多因素回歸分析

討 論

EmbryoGlue在IVF領(lǐng)域中已應(yīng)用多年，但是其臨床作用一直存在爭(zhēng)議。早期有研究顯示，EmbryoGlue有利于D3和D5新鮮胚胎移植的臨床結(jié)局，尤其是對(duì)于高齡和胚胎質(zhì)量較差以及有過(guò)胚胎著床失敗史的患者，可以獲得較好的臨床妊娠率[3，8]。吳芳等[9]的研究結(jié)果也顯示，使用EmbryoGlue作為移植液可以提高IVF-ET的妊娠率和種植率。而有的研究結(jié)果則相反[6，10]。本研究結(jié)果顯示，EmbryoGlue作為移植液可以改善FET周期囊胚移植的臨床結(jié)局。但是對(duì)于D3卵裂期胚胎，EmbryoGlue未改善其臨床結(jié)局，與其他研究報(bào)道結(jié)果一致[11]。另外，我們還進(jìn)一步分析了新鮮移植周期和FET周期的臨床結(jié)局，結(jié)果無(wú)論是新鮮移植還是FET移植，EmbryoGlue同樣未改善卵裂期胚胎移植的臨床結(jié)局。

劉輝等[5]在其研究中指出，EmbryoGlue作為移植液并不能改善D2、D3和D5胚胎移植的臨床結(jié)局，在D3移植組中，EmbryoGlue組的活產(chǎn)率反而要低于G2組，流產(chǎn)率顯著高于G2組。張克榮等[12]的研究結(jié)果顯示，EmbryoGlue可以改善卵裂期移植周期的臨床妊娠率，但是其研究中未納入流產(chǎn)率的觀察指標(biāo)。Hambiliki等[13]的研究結(jié)果顯示，EmbryoGlue能夠提高卵裂期胚胎FET周期的胚胎種植率，但是存在較高的流產(chǎn)率和生化妊娠率，以至于最終的活產(chǎn)率相似。同樣，最近王致輝等[14]的研究也顯示，EmbryoGlue用于卵裂期胚胎移植時(shí)也存在較高的流產(chǎn)率。在本研究中，對(duì)于卵裂期胚胎而言，盡管EmbryoGlue組的流產(chǎn)率與G2組相似，但是對(duì)于臨床結(jié)局而言，EmbryoGlue并未表現(xiàn)出任何優(yōu)勢(shì)，反而G2組的臨床觀察指標(biāo)要稍好于EmbryoGlue。提示在卵裂期胚胎移植時(shí)選擇G2作為移植液可能更為合適。原因可能是由于 EmbryoGlue 中富含的透明質(zhì)酸雖然增強(qiáng)胚胎與子宮內(nèi)膜之間的附著，但是也抑制了胚胎在宮腔的游走，阻止了卵裂期胚胎選擇合適的種植位點(diǎn)，導(dǎo)致胚胎種植后引發(fā)早期流產(chǎn)[15]。

另外，在哺乳類動(dòng)物的卵泡、輸卵管、子宮黏液中都存在HA。有研究表明，HA在小鼠胚胎著床期被大量表達(dá)[16]，同時(shí)HA的主要受體CD44在小鼠囊胚滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，以及植入期子宮內(nèi)膜的基質(zhì)中高表達(dá)，并且在人的子宮內(nèi)膜中也有類似的發(fā)現(xiàn)[17]，表明HA對(duì)胚胎種植非常重要。Wang等[11]通過(guò)比較卵裂期和囊胚期胚胎中兩個(gè)主要的HA受體的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CD44和透明質(zhì)酸介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)受體(RHAMM，也稱為細(xì)胞內(nèi)透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，IHABP)在囊胚中的表達(dá)水平顯著高于8-細(xì)胞期胚胎。由此以上研究可以推斷，在移植液中添加透明質(zhì)酸有利于囊胚期胚胎和子宮內(nèi)膜間的相互作用，誘導(dǎo)胚胎著床。而對(duì)于卵裂期胚胎移植，HA的添加可能為時(shí)過(guò)早，作用效果不大。本文研究的臨床結(jié)果也與此相一致。

總之，本研究結(jié)果顯示，EmbryoGlue未改善新鮮周期和FET周期的卵裂期胚胎移植結(jié)局，但是可以改善FET囊胚移植的臨床結(jié)局。是否能夠改善新鮮囊胚移植周期的臨床結(jié)局還需要大樣本量的臨床研究進(jìn)行證實(shí)。