王江，熊順，韓偉，付濤，魏彪，梁延峰，鄒佳益，黃國(guó)寧*

(1.重慶市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，重慶 400013；2.人類胚胎工程重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400013)

胚胎選擇是體外受精(in vitro fertilization，IVF)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，選擇具有最佳發(fā)育潛能的胚胎一直是胚胎學(xué)家致力于解決的難題。胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分已有幾十年的歷史，主要是通過評(píng)估卵裂球的數(shù)量、對(duì)稱性以及碎片率來(lái)篩選胚胎，胚胎學(xué)家認(rèn)為典型的卵裂模式使每輪有絲分裂后細(xì)胞數(shù)量翻倍，表現(xiàn)出這種分裂模式的胚胎更有可能經(jīng)歷了正常的有絲分裂，能夠忠實(shí)地復(fù)制受精時(shí)的遺傳物質(zhì)。盡管一些新的方法如代謝物分析、呼吸率測(cè)定、基因表達(dá)和整倍體篩查等逐漸用于胚胎選擇，然而形態(tài)學(xué)評(píng)分具有經(jīng)濟(jì)、快速、無(wú)創(chuàng)等優(yōu)勢(shì)仍為胚胎選擇首選方法[1]。近年來(lái)新起的延時(shí)成像(time-lapse)技術(shù)能夠?qū)ε咛ンw外發(fā)育全過程進(jìn)行監(jiān)控，獲取胚胎發(fā)育的動(dòng)態(tài)信息。Time-lapse 在胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分的基礎(chǔ)上，引入了胚胎分裂時(shí)間和異常分裂的概念，彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)評(píng)分的主觀性和靜態(tài)觀察的局限性，能更加有效預(yù)測(cè)卵裂期胚胎發(fā)育潛能[2-3]。

Time-lapse技術(shù)的應(yīng)用，使得胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)過程的更多細(xì)節(jié)被揭示，一些特殊的卵裂模式被胚胎學(xué)家認(rèn)識(shí)、研究。常見的特殊卵裂模式有直接卵裂、逆卵裂、不規(guī)則卵裂。直接卵裂又分為：多極直接卵裂，即1個(gè)細(xì)胞直接分裂產(chǎn)生2個(gè)以上子細(xì)胞；快速直接卵裂，與直接卵裂相同之處在于每次分裂時(shí)產(chǎn)生2個(gè)以上子細(xì)胞，但快速直接卵裂的胚胎首先表現(xiàn)為正常的1-2細(xì)胞分裂，隨后發(fā)生早成分裂產(chǎn)生3個(gè)或更多的子細(xì)胞，兩次有絲分裂之間無(wú)分裂間期[4-5]。早期胚胎異常卵裂發(fā)生率高達(dá)40%[5]。研究發(fā)現(xiàn)異常卵裂會(huì)直接影響人類胚胎單個(gè)細(xì)胞的基因組，導(dǎo)致染色體丟失、嵌合，從而降低胚胎發(fā)育潛能，導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯，囊胚形成率顯著降低[6-7]。

眾所周知，染色體非整倍性及早期植入胚胎中不正確的染色體拷貝數(shù)，是影響IVF成功的關(guān)鍵因素，它會(huì)導(dǎo)致植入失敗、早期妊娠丟失或染色體異常妊娠持續(xù)進(jìn)行，因而異常卵裂胚胎在臨床上的應(yīng)用一直困擾著胚胎學(xué)家。目前鮮有對(duì)異常卵裂囊胚整倍體率評(píng)估的相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在通過比較不同卵裂模式囊胚的整倍性來(lái)評(píng)估異常卵裂囊胚的應(yīng)用價(jià)值，為異常卵裂胚胎的臨床應(yīng)用提供一個(gè)最佳的實(shí)驗(yàn)室策略。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析了2020年于重慶市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心接受植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing，PGT)患者夫婦的臨床資料。

納入/排除標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)的技術(shù)規(guī)范，所有進(jìn)行PGT治療的夫婦均具備PGT適應(yīng)癥[8]；排除自然周期PGT患者、單基因疾病植入前遺傳學(xué)診斷(PGT-M)患者和睪丸取精患者。

本研究納入符合條件的300個(gè)植入前非整倍體或染色體結(jié)構(gòu)變異遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT-A/SR)周期，共1 048枚活檢囊胚。

二、研究方法

1.控制性促排卵：采用常規(guī)促排卵方案，包括長(zhǎng)方案、拮抗劑和微刺激方案。結(jié)合血清性激素水平和B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，當(dāng)2個(gè)及以上主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm或者3個(gè)及以上卵泡直徑≥17 mm時(shí)，注射HCG(珠海麗珠)并于35～36 h后超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道行穿刺取卵。

2.精液處理和受精培養(yǎng)：男方禁欲3～7 d，取卵日手淫取精，待精液液化后采用密度梯度離心法處理精液，將精液清洗后放于培養(yǎng)箱備用。ICSI受精：取卵后2 h將取出的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體置于40 U預(yù)熱的透明質(zhì)酸酶中用巴氏吸管輕柔地反復(fù)吹打，去除大部分顆粒細(xì)胞(透明質(zhì)酸酶作用時(shí)間約20 s)。然后轉(zhuǎn)入MOPS體外操作液，換用口徑較細(xì)的巴氏吸管繼續(xù)吹打去除多余的顆粒細(xì)胞并在脫顆粒細(xì)胞后3～6 h內(nèi)完成ICSI受精，將受精卵轉(zhuǎn)入G1(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)基中放入Time-lapse培養(yǎng)箱Embryoscope+(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3天，將正常受精發(fā)育胚胎對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)入G2(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

3.胚胎活檢和發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)標(biāo)注：選擇D5或D6發(fā)育至囊胚、Gardner評(píng)分[9]在3BC/3CB及以上的可用囊胚行滋養(yǎng)外胚層活檢，活檢細(xì)胞送公司(上海億康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)公司，嘉寶仁和醫(yī)療科技有限公司)擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序診斷分析。同時(shí)標(biāo)注活檢胚胎發(fā)育到8細(xì)胞期的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和卵裂模式。標(biāo)注時(shí)，參照“輔助生殖實(shí)驗(yàn)室技術(shù)”指南[10]，將第2天胚胎中直徑大于45 μm的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)定義為細(xì)胞，最后依據(jù)不同的卵裂模式對(duì)胚胎整倍性進(jìn)行分組比較。

4.囊胚分組：依據(jù)胚胎動(dòng)態(tài)發(fā)育模式將其分為正常卵裂(n=826)和異常卵裂(n=167)組；異常卵裂中的直接卵裂又分為快速直接卵裂(n=87)和多極直接卵裂(n=41)組。

5.胚胎移植及妊娠判斷：整倍體胚胎解凍后在腹部B超的引導(dǎo)下進(jìn)行單囊胚移植。移植后14 d監(jiān)測(cè)血HCG，28 d后行超聲檢查，見胎心搏動(dòng)判斷為臨床妊娠。比較囊胚正常卵裂和異常卵裂的臨床妊娠結(jié)局。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、納入周期及活檢囊胚

本研究納入的300個(gè)PGT-A/SR周期中PGT-A周期101個(gè)，PGT-SR周期199個(gè)，共獲得1 048枚活檢囊胚，55枚囊胚由于解凍卵母細(xì)胞、解凍胚胎或診斷失敗導(dǎo)致數(shù)據(jù)信息缺失，最終993枚胚胎數(shù)據(jù)有效用于分析比較，其中826枚胚胎(83.18%，826/993)早期卵裂正常，167枚(16.82%，167/993)胚胎早期卵裂異常。993枚胚胎中，PGT-A周期胚胎數(shù)387枚，其中318枚胚胎(82.17%，318/387)早期卵裂正常；PGT-SR周期胚胎數(shù)606枚，其中508枚胚胎(83.82%，508/606)早期卵裂正常。本研究中，兩種不同指征PGT活檢囊胚卵裂模式無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

二、正常卵裂和異常卵裂囊胚組患者基礎(chǔ)資料及PGT結(jié)果

兩組之間患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、Gn用量以及臨床用藥方案、精液質(zhì)量、PGT類型構(gòu)成等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；進(jìn)一步比較二者染色體整倍性發(fā)現(xiàn)，兩組間染色體整倍體率、非整倍體率和嵌合體率亦均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)，早期異常卵裂并不影響形成囊胚的整倍性。

表1 正常卵裂與異常卵裂囊胚組患者基礎(chǔ)資料及PGT結(jié)果

三、直接卵裂囊胚亞組患者基礎(chǔ)資料及PGT結(jié)果

異常卵裂囊胚組中，直接卵裂囊胚128枚，其中快速直接卵裂囊胚有87枚(52.10%，87/167)、多極直接卵裂有41枚(24.55%，41/167)，快速直接卵裂囊胚比例高于多極直接卵裂囊胚。41枚多極直接卵裂囊胚中，僅有6枚發(fā)生于第1次有絲分裂異常，第1次有絲分裂多極直接卵裂囊胚發(fā)生率構(gòu)成比低于第2次、第3次直接卵裂。同時(shí)，直接卵裂囊胚發(fā)育融合過程中至少有44枚觀察到未融合游離細(xì)胞存在。此外，逆卵裂、復(fù)雜異常卵裂囊胚有39枚，其中有17枚表現(xiàn)為快速卵裂后伴隨逆卵裂發(fā)生。

快速直接卵裂和多極直接卵裂兩組之間患者年齡、BMI、Gn用量以及臨床用藥方案、精液質(zhì)量、PGT類型構(gòu)成等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，兩組囊胚整倍體率也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 直接卵裂囊胚亞組患者基礎(chǔ)資料及PGT結(jié)果

四、早期不同卵裂整倍體囊胚移植結(jié)局

正常卵裂與異常卵裂整倍體囊胚的臨床妊娠及流產(chǎn)率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)，卵裂模式不影響整倍體囊胚臨床結(jié)局。此外，13個(gè)直接異常卵裂整倍體囊胚移植周期中12個(gè)周期獲得臨床妊娠，不同異常卵裂(快速直接卵裂和多極直接卵裂)整倍體囊胚的臨床妊娠率及流產(chǎn)率無(wú)明顯差異(表3)。

表3 不同卵裂來(lái)源整倍體囊胚移植結(jié)局

討 論

人類胚胎發(fā)育從受精卵開始，經(jīng)歷一系列有絲分裂事件分裂、分化形成，整個(gè)有絲分裂過程按特定的規(guī)律進(jìn)行，嚴(yán)格遵循每輪有絲分裂后細(xì)胞數(shù)量翻倍(1-2-4-8細(xì)胞)。但胚胎體外有絲分裂實(shí)際過程中，會(huì)發(fā)生一些特殊分裂活動(dòng)(異常卵裂)。這些特殊分裂通常導(dǎo)致胚胎遺傳物質(zhì)異常，嚴(yán)重影響胚胎的發(fā)育潛能[11]。McCollin等[6]的研究證實(shí)異常卵裂會(huì)直接影響人類胚胎單個(gè)細(xì)胞基因組，從而導(dǎo)致染色體丟失、嵌合和胚胎發(fā)育停滯。Lagalla等[7]研究了100多例異常卵裂胚胎，其中，有78.4%的胚胎因發(fā)育停滯或胚胎質(zhì)量差而丟棄，并且卵裂期停滯的頻率最高。這些發(fā)現(xiàn)與本研究中正常卵裂和異常卵裂囊胚構(gòu)成比一致，本研究993枚活檢囊胚中83.18%早期卵裂正常，僅有16.82%早期卵裂異常，異常卵裂胚胎囊胚形成率低。然而，通過進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)異常卵裂不影響囊胚染色體整倍性。胚胎發(fā)育過程中的自我篩選、自我校正和低比例嵌合可以解釋這一現(xiàn)象：(1)自我篩選：異常胚胎發(fā)育阻滯淘汰了大部分染色體異常胚胎，篩選出部分具有發(fā)育潛能的二倍體胚胎。相關(guān)研究也證實(shí)了發(fā)育阻滯胚胎非整倍體率更高[11-12]。(2)自我矯正：異常卵裂主要導(dǎo)致子細(xì)胞遺傳物質(zhì)的增加或減少，這類異常子細(xì)胞在細(xì)胞壓實(shí)過程中無(wú)法正常融合而被排除[7，12]。本研究觀察到26.35%(44/167)早期異常卵裂胚胎在融合期有未融合的游離細(xì)胞，游離細(xì)胞最終以退化、空泡化、碎片化或直接排出等方式消失，也支持了胚胎自我矯正假說，即通過排除染色體異常細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)染色體的整倍性。此外，第二種自我校正方式是三極分裂產(chǎn)生的三個(gè)子細(xì)胞中，有兩個(gè)在分裂末期又發(fā)生融合，形成一個(gè)雙核細(xì)胞[13]。本研究39枚有逆卵裂活動(dòng)的胚胎中43.59%(17/39)經(jīng)歷了一個(gè)1-3-2的快速卵裂活動(dòng)。(3)異常細(xì)胞以嵌合方式存在：嵌合體發(fā)生在15%～90%的卵裂期胚胎中，當(dāng)前診斷技術(shù)無(wú)法檢測(cè)出低比例嵌合，嵌合位置、比例和所涉及的染色體決定胚胎臨床結(jié)局，因而嵌合體胚胎也有機(jī)會(huì)發(fā)育成健康胎兒，目前臨床上已有嵌合體胚胎移植健康胎兒出生報(bào)道[14-15]。

本研究還比較了兩種直接卵裂模式與囊胚整倍體率的相關(guān)性，結(jié)果表明不同直接卵裂模式不影響囊胚整倍性?；顧z囊胚中快速直接卵裂和多極直接卵裂的比例分別是52.10%、24.55%。有文獻(xiàn)報(bào)道，直接卵裂和多極直接卵裂的發(fā)生概率分別是18.0%、8.0%[5，16]，由此猜想快速直接分裂對(duì)胚泡形成的破壞似乎更小。它與多極有絲分裂不同的是，快速分裂產(chǎn)生的細(xì)胞系并不都是亞二倍體，基因的分割只會(huì)發(fā)生在兩個(gè)產(chǎn)生的子細(xì)胞中，仍會(huì)留下一個(gè)二倍體細(xì)胞繼續(xù)正常發(fā)育和囊胚形成，而多極卵裂胚胎的發(fā)育能力取決于錯(cuò)誤分裂發(fā)生的階段，異常卵裂發(fā)生越早，染色體非整倍性越高。如果第一次有絲分裂發(fā)生直接卵裂可能會(huì)產(chǎn)生三個(gè)核型明顯完全不同的細(xì)胞，胚胎發(fā)育成整倍體的幾率小[17]。本研究由41枚多極卵裂發(fā)育而來(lái)囊胚中，僅6枚多極卵裂發(fā)生在第1次有絲分裂，胚胎發(fā)育潛能差，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此區(qū)分這兩種類型的直接卵裂很重要，它們可能發(fā)育至囊胚的幾率不同，這對(duì)細(xì)胞期移植胚胎選擇具有指導(dǎo)意義，但兩種卵裂來(lái)源囊胚整倍體率及發(fā)育潛能無(wú)明顯差異。由于樣本量限制，這一結(jié)論有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

異常卵裂發(fā)生機(jī)制尚不清楚。Boveri等[18]發(fā)現(xiàn)中心體周期調(diào)節(jié)受損可導(dǎo)致多極紡錘體的形成，可能是直接卵裂的發(fā)生機(jī)制。中心體調(diào)節(jié)功能受遺傳、環(huán)境和精子等因素影響。精子質(zhì)量是影響異常紡錘體形成的一個(gè)因素，因?yàn)榫又行捏w控制受精后第一次有絲分裂[19]。例如精子氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA碎片等都會(huì)增加直接卵裂和逆卵裂發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[20]。有文獻(xiàn)報(bào)道逆卵裂的發(fā)生與促排方案相關(guān)[21]；母體年齡也會(huì)影響卵裂模式[22]。此外，遺傳因素也會(huì)影響卵裂活動(dòng)，有文獻(xiàn)報(bào)道母體plk4中心體調(diào)控因子變異很可能使胚胎發(fā)生減數(shù)分裂和有絲分裂錯(cuò)誤[23]。然而，本研究由于樣本量限制，納入了199個(gè)PGT-SR周期，該周期患者主要存在一方或雙方染色體易位問題。文獻(xiàn)回顧，目前未見染色體易位患者胚胎異常卵裂率高于染色體正常人群的相關(guān)報(bào)道，從本研究結(jié)果部分可知PGT-SR組胚胎異常卵裂率與PGT-A組沒有明顯差異。由此看來(lái)，胚胎異常分裂與有絲分裂相關(guān)細(xì)胞器及相關(guān)調(diào)控組件關(guān)系更密切。

雖然早期異常卵裂胚胎染色體異常率高，發(fā)育能力差，但本研究通過比較囊胚期不同卵裂模式胚胎的整倍體率發(fā)現(xiàn)，早期異常卵裂并未顯著影響到囊胚染色體整倍性。眾所周知，非整倍體在早期人類胚胎中普遍存在，是導(dǎo)致妊娠失敗的主要因素，本研究通過比較正常卵裂和異常卵裂整倍體囊胚的移植結(jié)局，目前未發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著性差異，因而異常卵裂囊胚與正常卵裂囊胚可能具有相似的臨床價(jià)值。該研究結(jié)果與Ozbek等[24]報(bào)道的不一致，有必要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究早期異常卵裂對(duì)囊胚移植結(jié)局影響；然而，Ozbek等[24]認(rèn)為異常卵裂囊胚整倍體率更高，值得斟酌。

異常卵裂會(huì)直接影響人類胚胎單個(gè)細(xì)胞基因組，從而導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯，囊胚形成率降低。但是，我們的研究發(fā)現(xiàn)，早期異常卵裂胚胎發(fā)育到囊胚期其染色體整倍性及發(fā)育潛能與正常卵裂囊胚并沒有明顯差異。因此，胚胎移植、凍存時(shí)，優(yōu)先選擇卵裂正常的細(xì)胞期胚胎；對(duì)于異常卵裂胚胎建議行囊胚培養(yǎng)后選擇利用，具有與正常卵裂胚胎相似的臨床價(jià)值。