李瑩瑩，李彤，李巖，李靜雅

(沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院婦科，沈陽 110024)

異位妊娠(Ectopic pregnancy，EP)是指受精卵在子宮體腔以外著床，是婦產(chǎn)科常見的急腹癥之一，也是早期妊娠孕產(chǎn)婦死亡的主要原因。異位妊娠約占所有妊娠的1%～2%，以輸卵管壺腹部妊娠最多見[1-2]。妊娠早期孕婦死亡最常見的原因為輸卵管妊娠所導致的輸卵管破裂出血[3]。與胚胎植入子宮的過程一樣，輸卵管中存活的胚胎也需要局部血液供應，而血管內(nèi)皮細胞可促進滋養(yǎng)層細胞浸潤輸卵管進行血管重塑。滋養(yǎng)層細胞浸潤輸卵管壁后，可引發(fā)一定程度的炎癥反應[4]，炎癥反應會損傷輸卵管上皮纖毛，擾亂輸卵管壁的組織結構，從而損害輸卵管功能，并導致再次異位妊娠的風險增加。滋養(yǎng)層細胞浸潤輸卵管的深度決定輸卵管的損害程度，然而目前尚缺乏有效的方法評估滋養(yǎng)層細胞浸潤輸卵管壁的深度。Slit2是Slit蛋白家族成員之一，是一種分泌型糖蛋白，其與跨膜受體Roundabout(Robo)結合可對細胞生長和遷移發(fā)揮調節(jié)作用[5]。同時Slit2/Robo1信號傳導能夠促進腫瘤血管的生成，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。在胚胎發(fā)育過程中，人絨毛膜促性腺激素可促進子宮內(nèi)膜蛻膜化、血管生成、滋養(yǎng)層細胞侵襲，從而有利于胚胎成功著床[7]。滋養(yǎng)層細胞與腫瘤組織具有高度相似的結構和侵襲性，因此，本研究擬初步探索Slit2蛋白、Robo1蛋白與輸卵管妊娠中滋養(yǎng)層細胞浸潤程度及血管新生的關系，以期為輸卵管妊娠的臨床治療提供全新的藥物靶點。

資料與方法

一、研究對象

選取2018年5月至2019年3月在我院接受腹腔鏡下患側輸卵管切除術治療的74例輸卵管壺腹部妊娠患者的輸卵管樣本作為實驗組。納入標準：符合輸卵管妊娠的診斷標準[8]；術前未接受特殊治療；肝、腎功能正常且無其他嚴重合并癥；患者及其家屬對本次研究內(nèi)容知情同意。

另從同期接受手術切除治療的子宮肌瘤或子宮內(nèi)膜良性病變患者獲取正常輸卵管標本20例為正常組。納入標準：術前均未服用過激素類藥物和放、化療；組織學檢查輸卵管均未見異常。

兩組排除標準：(1)合并有盆腔炎性疾病、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢腫瘤等疾病或病史；(2)雙胎或多胎；(3)非自然受孕；(4)合并甲亢、風濕性疾病、糖尿病、高血壓、心臟病疾病等；(5)近期接受含激素相關藥物治療者。

本次研究已通過我院倫理委員會的批準。

二、研究方法

1.標本切取與鏡檢分組：收集術中切除的輸卵管，采用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚4 μm，取少量切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色。根據(jù)滋養(yǎng)層浸潤輸卵管的深度不同進行組織學分級[9]：滋養(yǎng)層細胞僅浸潤輸卵管黏膜層為Ⅰ級；滋養(yǎng)層細胞浸潤輸卵管肌層為Ⅱ級；滋養(yǎng)層細胞浸潤整個輸卵管壁達漿膜層為Ⅲ級(圖1)。根據(jù)滋養(yǎng)層細胞浸潤輸卵管壁的情況將實驗組分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級組。

2.主要試劑及常規(guī)溶液配制：兔抗人Slit2單克隆抗體、兔抗人Robo1多克隆抗體、兔抗人CD34單克隆抗體(EPR2999)均購自美國Abcam公司；免疫組化S-P通用型試劑盒購自丹麥DAKO公司，濃縮型DAB試劑盒、多聚賴氨酸、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自北京中衫金橋生物技術公司。自配枸櫞酸鹽緩沖液A液：0.1 mol/L枸櫞酸溶液；枸櫞酸鹽緩沖液B液：0.1 mol/L枸櫞酸鈉溶液。取9 ml枸櫞酸鹽緩沖液A液與41 ml枸櫞酸鹽緩沖液B液，加入450 ml蒸餾水中，配置為工作液。

A：正常；B：Ⅰ級；C：Ⅱ級；D：Ⅲ級圖1 滋養(yǎng)層細胞浸潤輸卵管壁的組織學分級(HE染色 ×40)

3.免疫組化染色：將制好的石蠟切片置于60℃烤箱中2 h，取出切片后依次浸泡于二甲苯、無水酒精、95%酒精和75%酒精各5 min，蒸餾水沖洗后置于PBS緩沖液中。將脫蠟水化后的組織放入已沸騰的檸檬酸鹽緩沖液中，煮沸15 min，進行抗原修復。余下操作按照DAB試劑盒說明書進行，Slit2和Robo1的一抗稀釋比例為1∶100，CD34一抗稀釋比例為1∶200。滴加辣根酶標記抗兔免疫球蛋白G聚合物，置入37℃溫箱中孵育20 min。每張切片滴加新鮮配制的DAB溶液覆蓋組織，室溫下顯色3～5 min，蘇木素復染30 s，依次置于50%酒精、75%酒精、95%酒精和無水酒精中各5 min，70℃烘箱中烘干。每張切片滴加中性樹脂適量，蓋玻片覆蓋。

4.結果判定：(1)Slit2及Robo1免疫組化的結果判斷：由專業(yè)的病理人員在不知試驗分組的前提下進行結果的判定。陽性染色為細胞質內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒。染色強度評分標準如下：若著色與背景一致，得0分；若為淡黃色，得1分；若為黃色，得2分；若為棕褐色，得3分。陽性染色細胞數(shù)比例評分標準：若陽性染色細胞占所有細胞的百分比<10%為0分；10%～25%為1分；25%～50%為2分；≥50%為3分。兩項積分相加，≤2分為陰性，≥3分為陽性表達。陽性表達率=陽性表達數(shù)量/總數(shù)量×100%。(2)微血管密度(Microvessel density，MVD)檢測方法及判定：參照Janik等[10]微血管密度計數(shù)標準對CD34免疫組化切片進行檢測及判定。切片先在100倍視野下進行觀察，選擇棕黃色染色最密集的3個區(qū)域，轉至400倍高倍視野下觀看并拍攝，將每個視野血管數(shù)量進行統(tǒng)計，相加后求得的平均數(shù)即為這張切片的MVD定量數(shù)。任何一個與周圍組織有明顯界限的單個細胞或細胞簇，無論有無血管腔，均視為一個微血管。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、患者一般情況比較

本研究實驗組共納入74例，其中Ⅰ級組27例、Ⅱ級組29例、Ⅲ級組18例，正常組20例。各組間年齡及孕齡(正常組無孕齡資料)比較均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組一般情況比較(-±s)

二、各組Slit2蛋白和Robo1蛋白表達

Slit2蛋白在實驗組EP輸卵管組織中(包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ級亞組)共有35例陽性表達，占47.3%，在正常組輸卵管組織中有1例陽性表達；Robo1蛋白在實驗組中共有41例陽性表達，占55.4%，在正常組中有2例陽性表達。且Slit2蛋白和Robo1蛋白在Ⅰ級組、Ⅱ級組和Ⅲ級組的陽性表達率呈遞增趨勢，各組間有顯著差異(P<0.05)(表2)。免疫組化圖中，正常組無陽性染色，Ⅰ級組可見淡黃色染色且陽性染色面積較小，Ⅱ級組陽性染色面積增大且可見黃色染色，Ⅲ級組大部分組織被染成棕褐色(圖2、圖3)。

表2 各組Slit2和Robo1蛋白表達的檢測結果(%)

左側欄為各組免疫染色圖片(×200)；右側欄為左側欄各組相應框區(qū)放大圖像(×400)圖2 各組輸卵管組織Slit2蛋白表達(免疫組化染色)

左側欄為各組免疫染色圖片(×200)；右側欄為左側欄各組相應框區(qū)放大圖像(×400)圖3 各組輸卵管組織Robo1蛋白表達(免疫組化染色)

三、各組MVD計數(shù)比較

正常組、實驗組輸卵管組織中(Ⅰ級組、Ⅱ級組和Ⅲ級組)的MVD計數(shù)，兩兩比較均有顯著差異，且浸潤分級越高，MVD計數(shù)越大(P<0.05)(表3、圖4)。

表3 各組MVD計數(shù)比較(-±s)

四、Slit2蛋白與Robo1蛋白表達的相關性

相關性分析表明EP輸卵管組織中Slit2蛋白與Robo1蛋白表達呈正相關性(r=0.603，P<0.001)(表4)。

表4 異位妊娠輸卵管Slit2蛋白和Robo1蛋白表達的相關性

五、Slit2蛋白和Robo1蛋白表達與MVD計數(shù)的相關性

在EP輸卵管組織中，Slit2表達陽性者MVD計數(shù)顯著高于Slit2表達陰性者(P<0.05)；Robo1表達陽性者MVD計數(shù)顯著高于Robo1表達陰性者(P<0.05)(表5)。經(jīng)Spearman相關性分析顯示，Slit2的陽性表達以及Robo1的陽性表達均與MVD計數(shù)呈正相關性(rSlit2=0.846，rRobol=0.729，P<0.001)。

左側欄為各組免疫染色圖片(×200)；右側欄為左側欄各組相應框區(qū)放大圖像(×400)圖4 各組輸卵管組織CD34-MVD計數(shù)(免疫組化染色)

表5 不同Slit2蛋白和Robo1蛋白表達情況的EP輸卵管中MVD計數(shù)比較(-±s)

討 論

近年來，隨著臨床生殖道感染、輸卵管手術、盆腔炎、輔助生殖、宮內(nèi)節(jié)育器以及流產(chǎn)等病例的不斷增加，EP發(fā)病率不斷上升并呈現(xiàn)年輕化趨勢，其中輸卵管壺腹部妊娠始終占較大比例。O’Donnell等[11]曾報道，輸卵管妊娠以壺腹部妊娠最多見，壺腹部妊娠約占異位妊娠患者的72.5%。這也是本研究將輸卵管壺腹部妊娠作為研究對象的重要原因。近年來，由于醫(yī)療技術的逐漸發(fā)展，EP得到更及時的診斷，患者的存活率和生育力保留也有了一定程度提高。但因為輸卵管壁受滋養(yǎng)層細胞浸潤較深，且滋養(yǎng)層細胞通常難以徹底清除，故保守治療成功率低、復發(fā)率較高[12]。從某種意義而言，了解滋養(yǎng)層細胞浸潤深度應被視為對此類患者實施臨床治療的重要依據(jù)，并在此基礎上進一步明確EP對輸卵管形態(tài)和功能的損害程度，尤其對有再次妊娠意愿的患者，選擇恰當?shù)闹委煼桨福瑥亩苊馇谐^多的組織并改善生殖預后具有重要意義。但當前除手術病理外，在術前能對滋養(yǎng)層細胞浸潤深度做出客觀并有效的評價的指標還比較匱乏。

Slit/Robo信號系統(tǒng)最早作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中軸突導向抑制因子而被發(fā)現(xiàn)[13]。Slit 蛋白家族成員分別較廣，不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與血管內(nèi)皮細胞等正常的組織中表達，在多種腫瘤組織中也有表達[14-16]。Slit2是Slit蛋白家族成員之一，是一種分泌型糖蛋白。Slit的4種受體包括Robo1、Robo2、Robo3和Robo4，皆可與Slit2結合發(fā)揮生物學作用。研究發(fā)現(xiàn)，Slit/Robo信號系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切，有望成為腫瘤診斷、治療的潛在靶點[5]。近些年來有關Slit/Robo的研究表明，Slit/Robo信號傳導在生殖系統(tǒng)中仍起到了重要作用，可調節(jié)成人生殖細胞的生理功能，對子宮內(nèi)膜、卵巢及輸卵管組織的生理功能起到了重要的作用[17]。其中，Slit2/Robo1信號被認為在妊娠期間的滋養(yǎng)層細胞功能中發(fā)揮重要作用。Li等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，EP輸卵管的絨毛外滋養(yǎng)層中Slit2和Robo1均有表達。在本研究中我們進一步發(fā)現(xiàn)，Slit2蛋白與Robo1蛋白在EP輸卵管組織中陽性表達率分別為47.3%和55.4%，且二者的陽性表達率均隨滋養(yǎng)層細胞浸潤輸卵管壁的組織學分級同步增高。該結果提示Slit2蛋白、Robo蛋白的高水平表達可能預示滋養(yǎng)層細胞浸潤輸卵管壁的程度較深，而由此導致的輸卵管功能損害程度也越大。

在所有哺乳動物的妊娠組織中都有著較豐富的血管網(wǎng)，這些新生的血管無論在正常狀態(tài)下還是在病理狀態(tài)下均受到嚴格的調控。Slit/Robo信號系統(tǒng)可通過參與內(nèi)皮細胞的遷移來調控妊娠組織中的血管網(wǎng)絡。Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Slit/Robo信號系統(tǒng)與血管重塑有關，Slit2與Robo1蛋白結合形成復合物，通過肌動蛋白細胞骨架傳遞信號，進而誘導絲狀偽足的形成，引起內(nèi)皮細胞的遷移，這被認為是血管重塑過程中的基本事件。張學敬等[20]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠月經(jīng)周期中Slit與Robo的表達也不同，其中Slit2和Robo1在小鼠卵巢組織，主要是黃體細胞中高表達，且晚期黃體Slit2和Robo1 mRNA的表達水平均顯著上調(P<0.05)；阻斷Slit/Robo信號通路后，晚期黃體細胞的凋亡率顯著下降(P<0.05)，說明Slit/Robo家族成員主要參與調控黃體細胞的凋亡過程。Shen等[21]通過比較正常女性和子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜發(fā)現(xiàn)，后者Slit、Robo1表達上調，提示Slit過表達能夠誘導異位的子宮內(nèi)膜血管新生。此外，在哺乳動物眼角膜及雞胚尿囊絨膜組織中，Slit/Robo均可調節(jié)血管新生，并已得到實驗證實[22-23]。由此可見，Slit/Robo廣泛參與了機體組織和器官的血管重塑過程。但Slit/Robo對EP輸卵管中血管重塑的影響尚未見文獻報道。本研究結果顯示，正常輸卵管組織以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級滋養(yǎng)層細胞浸潤的輸卵管組織的MVD計數(shù)逐漸升高，提示浸潤分級越高，血管重塑越活躍。且Slit2或Robo1表達陽性組的MVD計數(shù)高于對應表達陰性組的MVD計數(shù)，提示血管重塑與Slit2蛋白、Robo1蛋白表達水平密切相關。

綜上所述，本研究結合免疫組化等技術手段，證實了在EP輸卵管組織中，Slit2蛋白和Robo1蛋白的表達隨滋養(yǎng)層細胞浸潤分級的升高而增加，并提示Slit2蛋白和Robo1蛋白可能具有促進血管新生的作用。然而本研究尚存在某些局限性，本階段試驗還不能對Slit2/Robo1信號在輸卵管組織新生血管的進程中差異表達的信號誘導機制以及促進血管新生的機制做出解釋。此外，Slit2和Robo1蛋白在非妊娠輸卵管中也有少量陽性表達，目前考慮Slit2和Robo1蛋白并非滋養(yǎng)層細胞特異性表達，但正常妊娠是否影響輸卵管組織中Slit2和Robo1蛋白的表達、HCG的變化是否對其表達具有影響，這些疑問將在后續(xù)的研究中進一步探明。