祝立權(quán)，孫明明，梁敏，刁天，楊麗君，張欣，劉婷婷，汪坤，魯聰，陳西華，徐祥波，賀斌*

(1.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所 國(guó)家衛(wèi)生健康委生殖健康工程技術(shù)研究中心，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730)

雌激素和孕激素是重要的甾體類激素，對(duì)于妊娠起始、妊娠中胎盤功能的維持、胎兒生長(zhǎng)發(fā)育以及分娩發(fā)動(dòng)都起著重要作用[1]。雌激素的缺乏會(huì)導(dǎo)致各種并發(fā)癥和不良的妊娠結(jié)局。

雌二醇(E2)刺激體內(nèi)外內(nèi)皮細(xì)胞增殖[2-4]，增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)對(duì)各種基質(zhì)蛋白的粘附，促進(jìn)細(xì)胞遷移，從而促進(jìn)血管生成[2，5]。胎盤是母親和胎兒進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物交換的重要結(jié)構(gòu)，完善的胎盤血管網(wǎng)絡(luò)能夠使這種交換活動(dòng)正常進(jìn)行。前期研究結(jié)果顯示，在著床后短暫抑制雌激素造成了實(shí)驗(yàn)組大鼠胎盤連接區(qū)呈現(xiàn)異常增生，迷路區(qū)血流交換不足，影響了妊娠晚期胎盤的正常發(fā)育[6]，但具體機(jī)制尚不清楚。

血管生成素樣蛋白8(ANGPTL8)是血管生成素樣蛋白(ANGPTLs)家族新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，與ANGPTL1～7不同的是它只有N端結(jié)構(gòu)域，并且與ANGPTL3和ANGPTL4表現(xiàn)出同源性[7]，可以與脂蛋白脂肪酶(LPL)結(jié)合調(diào)節(jié)甘油三酯(TG)的代謝[8]。妊娠并發(fā)癥常常伴有糖脂代謝的異常，本研究旨在探索大鼠著床后雌激素短暫缺乏胎盤中ANGPTL8的表達(dá)及對(duì)HUVEC功能的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPFⅡ級(jí)Wistar雄性大鼠15只(8～10周齡)，SPFⅡ級(jí)Wistar雌性大鼠(8～10周齡)40只，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。Wistar大鼠均自由進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)條件恒溫恒濕，光照和黑暗時(shí)間均為12 h。所有實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作均符合國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.大鼠胚胎著床后短暫雌激素缺乏模型的建立：雌雄大鼠按照1∶1的比例于當(dāng)日21：00合籠，次日上午9：00見(jiàn)陰栓記為妊娠0.5 d(GD 0.5)。實(shí)驗(yàn)組雌性大鼠(n=20)在GD 6.5～GD 8.5的上午9：00按照每只0.16 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃雌二醇(E2)抑制劑來(lái)曲唑(Femara，諾華制藥，瑞士)；對(duì)照組雌性大鼠(n=20)在相同的時(shí)間點(diǎn)灌胃等量溶劑(羧甲基纖維素鈉，北京化學(xué)試劑)。在GD 8.5和GD 19.5的上午9：00處死大鼠，分別取著床點(diǎn)(GD 8.5)和胎盤(GD 19.5)組織凍存于-80℃，用于提取組織蛋白質(zhì)和RNA。

2.檢測(cè)Angptl8 mRNA的表達(dá)：向樣本組織中加入Trizol以提取組織中的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A，Takara，日本)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(RR820A，Takara，日本)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，Angptl8正向引物為5′-CCACCTCTTGTGGGCTCTCAC-3′，反向引物為5′-TCTCTGCTGGATCTGCCGCA-3′，內(nèi)參為β-actin，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后采用2-ΔΔCt法計(jì)算結(jié)果。

3.Western blot檢測(cè)ANGPTL8蛋白的表達(dá)：提取樣本組織中總蛋白；使用BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific，美國(guó))測(cè)定組織中總蛋白的濃度；使用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天)配制10%凝膠，上樣(加樣體積為20 μl)，電泳，轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉室溫封閉后，將ANGPTL8蛋白抗體(1∶1 000；Novus，美國(guó))和β-actin抗體(1∶3 000；Proteintech，美國(guó))分別與山羊抗兔二抗(1∶4 000；Cell Signaling，美國(guó))孵育1.5 h；使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光液試劑盒(蘇州新賽美)進(jìn)行發(fā)光顯影。用Image J分析蛋白條帶。

4.細(xì)胞培養(yǎng)與分組：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC，北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)用ECM培養(yǎng)基(Sciencell，美國(guó))進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃、5%CO2。添加不同濃度的重組人ANGPTL8(Novus，美國(guó))處理HUVEC，使其終濃度分別為0、1、2、4、8 nmol/L，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，其中0 nmol/L組為對(duì)照組。

5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度為5×105/ml，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。次日用無(wú)菌槍頭在培養(yǎng)皿底部劃出水平劃痕，用PBS清洗劃下的細(xì)胞，清洗3次；然后加入無(wú)血清培養(yǎng)基放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0、12、24、48 h拍照記錄；采用Image J軟件對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

6.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel基質(zhì)膠(BD，美國(guó))用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋15倍，100 μl/孔平鋪于Transwell小室內(nèi)，并置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h待其充分凝固；按照1×105/ml的比例將細(xì)胞懸液加入到Transwell上室內(nèi)，每孔100 μl，在下室中加入600 μl完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12、24 h；用1×PBS清洗后加入甲醇固定細(xì)胞15 min；2.5%的結(jié)晶紫染液染色15 min，洗凈小室，用棉簽輕輕拭去小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，倒置風(fēng)干后用倒置顯微鏡觀察記錄Transwell小室內(nèi)5個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量。

7.血管生成實(shí)驗(yàn)：將預(yù)冷的Matrigel基質(zhì)膠按照每孔50 μl的體積快速鋪于96孔板中，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置2 h，待其充分凝固，按照2×105/ml的比例將細(xì)胞懸液加入到96孔板中，每孔100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，觀察各組細(xì)胞的成管情況，并隨機(jī)選擇6個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用Image J軟件對(duì)成管情況進(jìn)行分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、著床點(diǎn)和胎盤組織中Angptl8 mRNA以及蛋白的表達(dá)

在GD 8.5時(shí)，實(shí)驗(yàn)組著床點(diǎn)Angptl8 mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而在GD 19.5時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胎盤組織中Angptl8 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖1)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖1 大鼠著床點(diǎn)(GD8.5)和胎盤組織(GD19.5)中的Angtpl8 mRNA表達(dá)

在GD 8.5時(shí)，實(shí)驗(yàn)組著床點(diǎn)ANGPTL8蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；在GD 19.5時(shí)，實(shí)驗(yàn)組胚胎組織中ANGPTL8蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(圖2)。

A：GD8.5著床點(diǎn)組織；B：GD19.5胎盤組織；C：ANGPTL8蛋白的相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 大鼠著床點(diǎn)(GD8.5)和胎盤組織(GD19.5)中的ANGPTL8蛋白表達(dá)

二、ANGPTL8對(duì)HUVECs功能的影響

1.ANGPTL8對(duì)HUVECs遷移的影響：在ANGPTL8對(duì)HUVECs處理24 h后，與對(duì)照組(0 nmol/L組)比較，ANGPTL8的濃度越高，劃痕的間隔越大，提示HUVECs的遷移率顯著降低(P<0.01)(表1、圖3)。

圖3 不同濃度ANGPTL8對(duì)HUVECs細(xì)胞遷移的影響

表1 不同濃度ANGPTL8對(duì)HUVECs遷移的影響(-±s)

2.ANGPTL8對(duì)HUVECs侵襲的影響：與對(duì)照組(0 nmol/L組)比較，不同濃度ANGPTL8分別處理HUVECs 12 h和24 h后，HUVECs細(xì)胞侵襲數(shù)目均隨著ANGPTL8濃度的升高而顯著降低(P<0.05)(表2、圖4)。

圖4 不同濃度ANGPTL8對(duì)HUVECs細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色 ×100)

表2 不同濃度ANGPTL8對(duì)HUVECs侵襲的影響(-±s)

3.ANGPTL8對(duì)HUVECs成管的影響：與對(duì)照組(0 nmol/L組)比較，不同濃度ANGPTL8處理HUVECs后，HUVECs細(xì)胞成管數(shù)目隨著ANGPTL8濃度的升高而顯著降低(P<0.01)(表3、圖5)。

圖5 不同濃度ANGPTL8對(duì)HUVECs細(xì)胞成管的影響(×100)

表3 不同濃度ANGPTL8對(duì)HUVECs成管的影響(-±s)

討 論

胎兒的健康發(fā)育有賴于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣通過(guò)胎盤的傳遞，胎盤適當(dāng)?shù)难芑凸嘧?胎盤血管生成)對(duì)于胎盤的發(fā)育和成熟至關(guān)重要。胎盤血管發(fā)育和適應(yīng)性的破壞與不良妊娠結(jié)局有關(guān)，包括先兆子癇、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、死胎等。前期研究中發(fā)現(xiàn)，在大鼠著床后短暫雌激素缺乏模型中，胎盤迷路區(qū)血管網(wǎng)發(fā)育呈現(xiàn)異常，然而雌激素僅在妊娠早期偏低，在妊娠中后期雌激素水平并無(wú)顯著差異，提示雌激素并不是導(dǎo)致胎盤發(fā)育異常的直接原因[1，9]。因此在雌激素短暫缺乏下，胎盤發(fā)育異常的機(jī)制需進(jìn)一步研究。

ANGPTL8是ANGPTLs家族成員之一，是一種具有198個(gè)氨基酸的22 kDa蛋白[7]。ANGPTL1～7由常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)域包括氨基端(N-末端)信號(hào)肽、N-端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CCD)、羧基末端(C-末端)纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域組成(FLD)和連接區(qū)域，但是ANGPTL8缺少C端FLD[10]，它和ANGPTL3與ANGPTL4具有相同的N端結(jié)構(gòu)域。ANGPTL8和ANGPTL3與ANGPTL4形成復(fù)合物的形式共同參與調(diào)節(jié)脂蛋白脂酶(LPL)的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)甘油三酯(TG)代謝，ANGPTL8被認(rèn)為是ANGPTL家族里一種新穎但非典型的成員并且能夠在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)[7，10-11]。有研究顯示，ANGPTL3/8復(fù)合物蛋白比為3∶1，ANGPTL4/8復(fù)合物蛋白比為1∶1，通過(guò)形成復(fù)合物，ANGPTL3/8的LPL抑制活性比ANGPTL3強(qiáng)100倍以上，而ANGPTL4/8的LPL抑制活性比ANGPTL4弱100倍以上[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎著床后短暫抑制雌激素后的胎盤發(fā)育過(guò)程中，GD 8.5和GD 19.5時(shí)實(shí)驗(yàn)組著床點(diǎn)及胎盤組織中蛋白的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，但實(shí)驗(yàn)組Angptl8 mRNA僅在GD 8.5的著床點(diǎn)組織中表達(dá)升高，而在GD 19.5時(shí)，Angptl8 mRNA在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胎盤組織中的表達(dá)無(wú)顯著差異，提示ANGPTL8蛋白的升高可能不是由胎盤組織表達(dá)增強(qiáng)的原因，更可能是來(lái)自子宮組織合成或來(lái)自母體循環(huán)。我們利用重組人ANGPTL8分子研究了其對(duì)HUVEC細(xì)胞功能的影響，結(jié)果顯示，隨著ANGPTL8濃度的升高，其對(duì)HUVECs的遷移、侵襲和成管產(chǎn)生了抑制作用且有劑量依賴性，這表明ANGPTL8的上調(diào)抑制了大鼠胚胎著床后短暫雌激素缺乏模型中胎盤血管網(wǎng)的正常發(fā)育。原因可能是高濃度的ANGPTL8通過(guò)影響ANGPTL3/4復(fù)合體對(duì)LPL的抑制作用進(jìn)而抑制甘油三酯水解，從而影響到血管內(nèi)皮的功能，具體機(jī)制包括ANGPTL8升高的原因有待于進(jìn)一步深入研究。另一方面，有流行病學(xué)研究表明，外周循環(huán)的ANGPTL8水平在代謝性疾病，包括糖尿病、肥胖和代謝綜合征中發(fā)生變化，呈現(xiàn)高水平[13]。不僅如此，有研究顯示在患有妊娠期糖尿病的孕婦中，胎兒臍帶血中的ANGPTL8水平高于母體血清中的ANGPTL8水平，提示母體和臍帶血ANGPTL8的增加可能是增強(qiáng)妊娠期糖尿病患者胰島素需求的補(bǔ)償機(jī)制[14]。有關(guān)ANGPTL8在病理性妊娠中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

胎盤發(fā)生過(guò)程中新生血管生成的過(guò)程稱為血管生成，起始于胚外中胚層尿囊中內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)的形成[15]，完善的胎盤血管網(wǎng)絡(luò)是母體和胎兒之間進(jìn)行物質(zhì)交換的保證。胎盤血管生成異常會(huì)產(chǎn)生不良的妊娠結(jié)局以及母親和胎兒患有各種并發(fā)癥。因此，通過(guò)研究在雌激素缺乏下ANGPTL8對(duì)胎盤發(fā)育的影響機(jī)制，有助于為妊娠并發(fā)癥以及各種不良妊娠結(jié)局提供預(yù)防和治療的手段。