高榮 祖麗皮亞·達(dá)木拉

【摘要】 目的：探討手足口病患兒DLL4/Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及意義。方法：選擇2018年3月-2019年11月本科收治的手足口病患兒86例，其中輕癥患兒76例（普通組），重癥患兒10例（重癥組），同期選擇在本院體檢的健康小兒86例作為對照組。比較三組外周血DLL4、Notch1 mRNA表達(dá)水平與血清IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：重癥組住院天數(shù)、發(fā)熱天數(shù)均長于普通組，休克、呼吸衰竭、EV71感染發(fā)生率均高于普通組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。重癥組與普通組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于對照組，重癥組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于普通組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。重癥組與普通組外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達(dá)水平均高于對照組，重癥組外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達(dá)水平均高于普通組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在手足口病患兒中，Pearson分析顯示DLL4、Notch1表達(dá)水平與IL-6、IL-8、TNF-α存在相關(guān)性（P<0.05）。結(jié)論：手足口病患兒伴隨著DLL4/Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的激活，可誘發(fā)大量炎癥因子的釋放，與患者的病情存在相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 手足口病 DLL4/Notch信號通路 炎癥因子 病情 相關(guān)性

Expression and Significance of DLL4/Notch Signaling Pathway Related Proteins in Children with Hand-foot-mouth Disease/GAO Rong， Zulipiya Damula. //Medical Innovation of China， 2021， 18（12）： 0-084

[Abstract] Objective： To investigate the expression and significance of DLL4/Notch signaling pathway related proteins in children with hand-foot-mouth disease （HFMD）. Method： A total of 86 children with HFMD admitted to our hospital from March 2018 to November 2019 were selected， including 76 children with mild disease （normal group） and 10 children with severe disease （severe group）， and 86 healthy children with physical examination in our hospital during the same period were selected as the control group. The mRNA expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of three groups were compared with the expression levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in serum， and the correlation analysis was conducted. Result： The hospitalization days and fever days in the severe group were longer than those in the normal group， and the incidence of shock， respiratory failure and EV71 infection were higher than those in the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Serum levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in the severe group and normal group were higher than those in the control group， serum levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in the severe group were higher than those in the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The mRNA relative expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of the severe group and the normal group were higher than those of the control group， and the mRNA relative expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of the severe group were higher than those of the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. In children HFMD， Pearson analysis showed that the expression levels of DLL4 and Notch1 were correlated with IL-6， IL-8， TNF-α （P<0.05）. Conclusion： The activation of DLL4/Notch signaling pathway related protein expression in children with hand-foot-mouth disease can induce the release of a large number of inflammatory factors， which is correlated with the patients condition.

[Key words] Hand-foot-mouth disease DLL4/Notch signaling pathway Inflammatory factors Condition

Correlation

First-authors address： Childrens Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830054， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.12.019

手足口?。╤and-foot-mouth disease， HFMD）是由腸道病毒引起嬰幼兒常見急性傳染病，以皰疹、發(fā)熱、口腔疼痛為主要臨床特征的傳染病[1]。其主要的病原體為柯薩奇病毒A組16型（coxsackie virus， CA16）或腸道病毒71型（enterovirus 71， EV71），其中EV71感染具有極強(qiáng)的傳染性[2-3]。輕度感染患兒預(yù)后良好;重度感染患兒多伴隨著神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，包括腦干腦炎、無菌性腦膜炎、神經(jīng)源性肺水腫、急性弛緩性麻痹，多為EV71感染引起，具有一定的致死率[4]。有研究報(bào)道顯示EV71具有親神經(jīng)性，使得手足口病患兒容易出現(xiàn)腦炎，導(dǎo)致疾病惡化。DLL4/Notch信號通路是進(jìn)化上比較保守的跨膜蛋白家族，主要由配體、受體、結(jié)合蛋白、調(diào)節(jié)分子、效應(yīng)物等組成[5]。人體共有多種Notch配體（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1）和多種Notch受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）等，其中Notch1屬于Ⅰ型跨膜蛋白，當(dāng)胞外區(qū)域與配體結(jié)合后，Notch受體被解聚素和金屬蛋白酶水解，跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)由γ-分泌酶復(fù)合體催化為Notch胞內(nèi)區(qū)，然后進(jìn)入胞核后，可水解成組蛋白去乙酰化酶、核受體輔阻遏物2等因子，從而發(fā)揮生物學(xué)調(diào)節(jié)作用[6]。當(dāng)DLL4/Notch信號通路激活后，尤其是DLL4的高表達(dá)可促進(jìn)CD4+ Th1淋巴細(xì)胞的分化，可誘發(fā)炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)Treg淋巴細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致疾病惡化[7]。本文具體探討了手足口病患兒DLL4/Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的差異及意義，以明確手足口病的發(fā)生機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年3月-2019年11月本科收治的手足口病患兒86例，其中輕癥患兒76例（普通組），重癥患兒10例（重癥組），同期選擇在本院體檢的健康小兒86例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：普通組與重癥組均符合手足口病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即咽拭子或肛拭子EV71-PCR或CA16-PCR檢測陽性，都有發(fā)熱癥狀;重癥組伴隨著神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥;對照組為健康查體的小兒;研究對象年齡1～6歲;臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：無法安靜且對鎮(zhèn)靜劑過敏;合并慢性基礎(chǔ)疾病需長期服用糖皮質(zhì)激素;合并先天性疾病;伴先天性或獲得性免疫缺陷病。研究對象家屬知情同意本研究，本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此次研究。

1.2 方法 DLL4、Notch1 mRNA檢測：采集所有研究對象的外周血2～3 mL，抗凝，分離單個(gè)核細(xì)胞，抽提總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測DLL4、Notch1表達(dá)水平，采用PCR Mix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系為20 μL，引物序列如下，DLL4正向引物：5-CTTGGTGTCACGCTTGCT-3，反向引物：5-GGGTCATCCTTGTCCTCAT-3;Notch1正向引物：5-AGTTCCAGTGCGATGCCTACA-3，反向引物：5-AATGGTTATCGCTGTATCTG-3，以GAPDH作為內(nèi)標(biāo)，做3次重復(fù)取平均值。

1.3 觀察指標(biāo) 再次抽取所有患者外周血樣本

2～3 mL，不抗凝，靜置30 min后，1 000 r/min離心10 min，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫法檢測血清IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子表達(dá)水平，比較三組血清炎癥因子表達(dá)水平。比較三組外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達(dá)水平。調(diào)查所有手足口病患兒的臨床資料，包括住院天數(shù)、發(fā)熱天數(shù)、臨床癥狀、感染病原體類型等。分析手足口病患兒外周血DLL4、Notch1表達(dá)水平與血清炎癥因子表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較 普通組中男38例，女38例;平均年齡（4.21±0.28）歲。重癥組中男6例，女4例;平均年齡（4.24±0.33）歲。對照組中男43例，女43例;平均年齡（4.28±0.33）歲。三組的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組臨床相關(guān)指標(biāo)比較 重癥組的住院天數(shù)、發(fā)熱天數(shù)均長于普通組，休克、呼吸衰竭、EV71感染發(fā)生率均高于普通組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 三組血清炎癥因子表達(dá)水平比較 重癥組與普通組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于對照組，重癥組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于普通組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.4 三組外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達(dá)水平比較 重癥組與普通組的外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達(dá)水平均高于對照組，重癥組的外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達(dá)水平均高于普通組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.5 手足口病患兒外周血DLL4、Notch1表達(dá)水平與血清炎癥因子表達(dá)水平的相關(guān)性分析 在手足口病患兒中，Pearson分析顯示DLL4、Notch1表達(dá)水平與IL-6、IL-8、TNF-α存在相關(guān)性（P<0.05），見表4。

3 討論

手足口病多發(fā)生于5歲以下小兒，在春夏季高發(fā)，多表現(xiàn)為發(fā)熱和手足、口腔等部位的皮疹。該病的發(fā)生與發(fā)展呈現(xiàn)多個(gè)階段，第一階段為常規(guī)期，第二階段為神經(jīng)系統(tǒng)受累期，第三階段為心肺功能衰竭期，第四階段為恢復(fù)期。引發(fā)手足口病的腸道病毒比較多，其中CoxA 16和EV71最為常見。兩者都屬微小核糖核酸病毒科、人腸道病毒屬，EV71具有明顯嗜神經(jīng)性，更易引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，而CoxA 16可能為單純的手足口病患兒[8]。研究表明手足口病可分為輕癥和重癥病例，其中輕癥相當(dāng)于第一階段，重癥相當(dāng)于第二及其以后階段，神經(jīng)系統(tǒng)損害是手足口病惡化的早期表現(xiàn)，合并病毒性腦炎也屬于第二階段[9]。輕癥患兒多只表現(xiàn)為口痛拒食、發(fā)熱、皮疹等癥狀，重癥患兒還伴隨有神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)。本研究也顯示重癥組的住院天數(shù)、發(fā)熱天數(shù)均長于普通組，休克、呼吸衰竭、EV71感染發(fā)生率均高于普通組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明手足口病患兒的病情可能與腸道病毒EV71感染相關(guān)。

手足口病侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)可分為病毒直接侵犯所致的炎癥和機(jī)體免疫功能異常所致的急性脫髓鞘改變。炎癥改變包括神經(jīng)元變性、壞死和嗜神經(jīng)細(xì)胞作用，血管周圍主要單核細(xì)胞浸潤形成袖套樣改變，其病理改變主要是在腦干及脊髓，尤其灰質(zhì)區(qū)可見彌漫性炎癥[10]。本研究顯示重癥組與普通組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于對照組，重癥組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于普通組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。從機(jī)制上分析，IL-6是一種重要的促炎性細(xì)胞因子，除對血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞具有直接激活和毒性作用外，其大量釋放也可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)功能損害與多器官細(xì)胞代謝障礙[11]。IL-8也被稱為前炎癥細(xì)胞因子，是啟動(dòng)抗炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生眾多繼發(fā)性炎癥介質(zhì)。而EV71感染可以刺激機(jī)體大量釋放TNF-α，激活靶基因轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞因子合成和釋放，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生級聯(lián)“瀑布式”炎癥反應(yīng)[12-13]。

在DLL4/Notch信號通路中，Notch1為一種單次跨膜蛋白，可參與調(diào)節(jié)機(jī)體的胚胎發(fā)育、血管形成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等，Notch1與DLL4相結(jié)合，從而將活化的Notch區(qū)域釋放出來，再將釋放出來的活化的Notch轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，從而對下游基因起到調(diào)控作用[14-15]。有研究顯示Notch1與DLL4在機(jī)體中存在動(dòng)態(tài)平衡，可參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)活動(dòng)，也可通過影響免疫細(xì)胞的數(shù)量和狀態(tài)從而影響疾病的預(yù)后[16-18]。本研究顯示重癥組與普通組的外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達(dá)水平均高于對照組，重癥組的外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達(dá)水平均高于普通組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明手足口病疾病發(fā)生多伴隨有DLL4/Notch信號通路激活。本研究Pearson分析顯示手足口病患兒的DLL4、Notch1與IL-6、IL-8、TNF-α存在相關(guān)性（P<0.05）。從機(jī)制上分析，隨著手足口病患兒病情的惡化，可刺激DC細(xì)胞成熟以刺激T細(xì)胞對抗病毒，可激活DLL4/Notch信號通路，從而增強(qiáng)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)改變，使患兒病情惡化[19-21]。不過本研究也存在一定的不足，沒有進(jìn)行影響因素分析，調(diào)查的小兒數(shù)量比較少，將在后續(xù)研究中進(jìn)行探討。

綜上所述，手足口病患兒伴隨著DLL4/Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的激活，可誘發(fā)大量炎癥因子的釋放，與患兒的病情存在相關(guān)性。

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（收稿日期：2021-03-03） （本文編輯：姬思雨）