周秀 廖曉現(xiàn) 成力

心力衰竭主要是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常從而促使心室充盈或損傷射血功能的損傷心肌后誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)的復(fù)雜綜合征[1]。急性心力衰竭是指心衰的癥狀和體征迅速發(fā)生或惡化，急性缺血性心力衰竭主要是由于心肌收縮力不足而顯著降低心排血量時(shí)出現(xiàn)左心室舒張末壓升高伴隨癥從而致使肺部周圍循環(huán)不足造成肺部淤血的一組臨床綜合征[2]。急性缺血性心力衰竭患者無特異性臨床表現(xiàn)，以往常依據(jù)患者臨床癥狀體征判斷疾病程度，不具客觀性，心臟彩超檢查可提供一定的客觀指標(biāo)，但仍具有局限性，因此需尋找一些特異性生物標(biāo)志物用于診斷疾病及評(píng)估預(yù)后情況。血清腦利鈉肽前體(pro-brain natriuretic peptide，pro-BNP)作為于人體心室內(nèi)合成的一種多肽類物質(zhì)，心力衰竭發(fā)生時(shí)促使其加快合成與分泌從而提高自身表達(dá)水平，臨床常以pro-BNP評(píng)估患者心功能及預(yù)后，但其表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度并非均呈正相關(guān)關(guān)系且具有不穩(wěn)定性[3]。研究表明鈣整合素結(jié)合蛋白1(calcium-and intergtin-binding protein，CIB1)分布于生物體內(nèi)心、肺等各種組織器官，可通過參與細(xì)胞增殖、遷移及血管形成等過程進(jìn)而調(diào)控心臟等組織器官中各種病理變化過程[4]。因此，本研究主要探討急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA、蛋白與pro-BNP表達(dá)水平及其在臨床診斷與評(píng)估患者預(yù)后中的重要應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月至2018年11月于重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院診治的急性缺血性心力衰竭患者120例為研究組，其中男62例，女58例；年齡45～75歲，平均年齡(62.54±5.19)歲；美國(guó)紐約心臟病協(xié)會(huì)(New York Heart Association，NYHA)心功能分級(jí)：Ⅰ級(jí)時(shí)不影響患者正常生活(本研究中對(duì)此不做深入研究)；Ⅱ級(jí)時(shí)患者體力活動(dòng)受限并出現(xiàn)心衰癥狀；Ⅲ級(jí)時(shí)患者低于一般活動(dòng)時(shí)引起心衰癥狀；Ⅳ級(jí)時(shí)患者不能從事任何活動(dòng)且休息時(shí)也存在心衰癥狀[5]。根據(jù)NYHA心功能分級(jí)將研究組患者分為Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)與Ⅳ級(jí)組，每組40例，另以同期健康體檢者40例為對(duì)照組，其中男21例，女19例；年齡43～72歲，平均年齡(61.79±5.26)歲。2組患者臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合急性缺血性心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②所有受試對(duì)象知曉本研究?jī)?nèi)容且簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①急性心肌梗死者；急性炎癥者；②惡性腫瘤者；③不穩(wěn)定心絞痛者；④嚴(yán)重高血壓患者；⑤自身免疫性疾病者。

1.3 主要儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀與NanoDrop 2000超微量核酸測(cè)定儀均購自美國(guó)Thermo公司，Trizol試劑及RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京恩碩生物科技有限公司。SYBR Green qRT-PCR試劑盒選購于天根生化科技(北京)有限公司，CIB1 mRNA及內(nèi)參基因β-actin引物均由生工生物(上海)工程有限公司合成。

1.4 研究方法

1.4.1 qRT-PCR法檢測(cè)血清CIB1 mRNA表達(dá)水平:收集研究組與對(duì)照組空腹靜脈血標(biāo)本3 ml，離心后提取上清，按照Trizol試劑盒操作方法提取血清總RNA，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)為cDNA，qRT-PCR法檢測(cè)血清CIB1 mRNA表達(dá)水平。CIB1 mRNA上游序列為5’-CACGGCTTAGTGCGTCTGAG-3’，下游序列為5’-AAAGTCTGGAGAACGGGAGAT-3’。β-actin為內(nèi)參基因，上游序列為5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’，下游序列為5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，ddH2O 6 μl。將其放進(jìn)速凍離心機(jī)混勻后放入熒光定量PCR儀，設(shè)置程序?yàn)?5℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共進(jìn)行42個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后將數(shù)據(jù)保存并對(duì)所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算CIB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)CIB1蛋白表達(dá)情況:采用蛋白免疫印跡法以β-actin蛋白作為內(nèi)參，檢測(cè)研究組與對(duì)照組血清CIB1蛋白表達(dá)水平，按照操作說明進(jìn)行檢測(cè)，采用Tanon軟件拍攝圖像并對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.4.3 檢測(cè)血清pro-BNP表達(dá)水平:采集研究組與對(duì)照組空腹靜脈血標(biāo)本3 ml，離心后提取上清，采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及試劑盒進(jìn)行檢測(cè)(羅氏公司)血清pro-BNP表達(dá)水平。

1.4.4 研究組臨床特征:檢測(cè)研究組患者左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)水平，并統(tǒng)計(jì)胸腔積液、心房顫動(dòng)發(fā)生例數(shù)。

1.5 隨訪 對(duì)研究組患者進(jìn)行門診復(fù)查、電話方式隨訪6個(gè)月，記錄患者隨訪期間發(fā)生心源性再住院及死亡情況，以心源性再住院或死亡為終點(diǎn)事件，屬于預(yù)后不良。

2 結(jié)果

2.1 4組血清CIB1 mRNA及蛋白、pro-BNP表達(dá)水平比較 研究組(Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)組)血清CIB1 mRNA及蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，且Ⅳ級(jí)組血清CIB1 mRNA及蛋白表達(dá)水平低于Ⅱ級(jí)組與Ⅲ級(jí)組；研究組血清pro-BNP表達(dá)水平高于對(duì)照組，且Ⅳ級(jí)組血清pro-BNP表達(dá)水平高于Ⅱ級(jí)組與Ⅲ級(jí)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 4組血清CIB1 mRNA及蛋白、pro-BNP表達(dá)水平比較

圖1 4組血清CIB1蛋白表達(dá)印跡

2.2 急性缺血性心力衰竭患者臨床特征比較 Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組患者LVEF水平依次降低(P<0.05)，LVEDD、PAH水平依次升高(P<0.05)；Ⅳ級(jí)組胸腔積液患者比例高于Ⅱ級(jí)組(P<0.05)；3組心房顫動(dòng)患者比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 急性缺血性心力衰竭患者臨床特征比較 n=40

2.3 急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA、pro-BNP表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系 Ⅱ級(jí)組患者血清CIB1 mRNA表達(dá)水平與LVEF、胸腔積液均呈正相關(guān)(r=0.360、0.367,P<0.05)，血清pro-BNP表達(dá)水平與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.460,P<0.05)。Ⅲ級(jí)組患者血清CIB1 mRNA表達(dá)水平與LVEF呈正相關(guān)(r=0.362,P<0.05)，血清pro-BNP表達(dá)水平與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.374,P<0.05)。Ⅳ級(jí)組患者血清CIB1 mRNA表達(dá)水平與LVEF、LVEDD、PAH、胸腔積液均呈正相關(guān)(r=0.379、0.468、0.380、0.375,P<0.05)，血清pro-BNP表達(dá)水平與LVEF呈負(fù)相關(guān)，與LVEDD、PAH、胸腔積液均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA、pro-BNP表達(dá)水平與臨床特征的相關(guān)性(r/P)

2.4 影響急性缺血性心力衰竭患者預(yù)后的因素分析 對(duì)患者進(jìn)行隨訪，期間發(fā)生心源性再住院26例(21.67%)，死亡11例(9.17%)，共發(fā)生終點(diǎn)事件37例。以患者預(yù)后情況為因變量，以上述檢測(cè)指標(biāo)為自變量進(jìn)行COX回歸分析，結(jié)果顯示CIB1 mRNA、pro-BNP、LVEF與PAH是影響急性缺血性心力衰竭患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。見表4。

表4 影響急性缺血性心力衰竭患者預(yù)后的單因素與多因素分析

2.5 急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA與pro-BNP表達(dá)水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA與pro-BNP表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.512，P=0.027)。見圖2。

圖2 急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA與pro-BNP表達(dá)水平相關(guān)性分析

3 討論

心力衰竭發(fā)病率隨著心血管疾病發(fā)病率的升高而呈持續(xù)升高的趨勢(shì)，若不及時(shí)診治，則危及患者生命。急性缺血性心力衰竭是多種心血管疾病的共同最終表現(xiàn)形式，主要表現(xiàn)為心肌損傷、心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)和心功能的變化[7]。目前，臨床多采用超聲心動(dòng)圖檢查得到心臟彩超參數(shù)用于診斷疾病發(fā)生情況，但不能準(zhǔn)確診斷急性缺血性心力衰竭患者的疾病嚴(yán)重程度[8]。近來，研究表明血液學(xué)指標(biāo)不僅可用于檢測(cè)各類心力衰竭等心血管疾病，同時(shí)能夠及時(shí)評(píng)價(jià)療效從而有利于及時(shí)調(diào)整治療方案[9]。

pro-BNP是一種有心室內(nèi)合成與分泌的多肽類物質(zhì)，不僅有利于血管擴(kuò)張，同時(shí)可有效反應(yīng)心血管疾病的狀態(tài)[10]。研究表明pro-BNP可用于診斷心力衰竭、冠心病等心血管疾病，其表達(dá)水平愈高可反應(yīng)疾病愈嚴(yán)重，同時(shí)pro-BNP表達(dá)水平與患者預(yù)后情況緊密相關(guān)，但其對(duì)疾病嚴(yán)重程度診斷具有不穩(wěn)定性[3]。CIB1是一個(gè)位于15號(hào)染色體22 kD的活性調(diào)節(jié)蛋白，可通過與不同蛋白結(jié)合從而影響鈣信號(hào)傳遞、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等過程[11]。研究表明，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中CIB1對(duì)其內(nèi)皮細(xì)胞及癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[12]。此外，CIB1可通過調(diào)節(jié)AKT通路進(jìn)而促使肝癌細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及乳腺癌細(xì)胞的增殖[13]。CIB1不僅與腫瘤發(fā)生具有密切關(guān)系，同時(shí)可特異性地參與細(xì)胞分裂、血管發(fā)生等過程[14]。有研究顯示，CIB1可促使缺血性p21激活酶1活化，從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能并促使血管形成[15]。本研究結(jié)果顯示急性缺血性心力衰竭患者體內(nèi)血清pro-BNP表達(dá)水平高于對(duì)照組，且Ⅳ級(jí)組高于Ⅱ級(jí)組與Ⅳ級(jí)組，而血清CIB1 mRNA及蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，且Ⅳ級(jí)低于Ⅱ級(jí)組與Ⅳ級(jí)組，說明隨著急性缺血性心力衰竭患者病情加重，體內(nèi)血清pro-BNP表達(dá)水平逐漸升高，而血清CIB1 mRNA表達(dá)水平降低，這可能是由于CIB1 mRNA表達(dá)降低并抑制心血管中細(xì)胞的存活或增殖從而影響血管生成造成心肌缺血。Western法檢測(cè)CIB1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示其蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，Ⅳ級(jí)組患者顯著低于Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)組，說明急性缺血性心力衰竭疾病嚴(yán)重程度不同，患者CIB1蛋白表達(dá)也隨之不同，且不同等級(jí)間具有明顯差異，推測(cè)CIB1蛋白表達(dá)水平可預(yù)測(cè)該病的疾病嚴(yán)重程度。

急性缺血性心力衰竭患者Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)組LVEF逐漸降低，而LVEDD、PAH及胸腔積液比例逐漸增加，表明隨著患者病情嚴(yán)重程度的增加，心功能明顯下降，且發(fā)生胸腔積液風(fēng)險(xiǎn)性也隨之增加。本研究進(jìn)一步分析顯示血清pro-BNP表達(dá)水平均與LVEF呈負(fù)相關(guān)，血清CIB1 mRNA表達(dá)水平均與LVEF呈正相關(guān)，LVEDD、PAH及胸腔積液均與Ⅳ級(jí)組血清CIB1 mRNA、pro-BNP表達(dá)水平呈正相關(guān)，說明臨床診療急性缺血性心力衰竭時(shí)檢測(cè)血清CIB1 mRNA、pro-BNP表達(dá)可有效預(yù)判疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA與pro-BNP表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步說明血清CIB1 mRNA與pro-BNP在患者體內(nèi)相互影響，推測(cè)二者可作為預(yù)測(cè)急性缺血性心力衰竭的生物學(xué)指標(biāo)。另對(duì)患者進(jìn)行隨訪，期間發(fā)生終點(diǎn)事件心源性再住院及死亡共37例，采用COX單因素及多因素回歸分析，結(jié)果顯示CIB1 mRNA、pro-BNP、LVEF與PAH是影響急性缺血性心力衰竭患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。說明血清CIB1 mRNA與pro-BNP表達(dá)水平可有效評(píng)估患者預(yù)后情況，同時(shí)臨床也應(yīng)密切監(jiān)測(cè)LVEF與PAH水平變化情況，對(duì)重點(diǎn)人群進(jìn)行隨訪，以最大程度改善患者預(yù)后，降低患者經(jīng)濟(jì)成本。

綜上所述，血清CIB1 mRNA、蛋白與pro-BNP表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)急性缺血性心力衰竭的生物學(xué)指標(biāo)，二者對(duì)臨床診療及病情評(píng)估具有重要價(jià)值，且能夠作為評(píng)估患者預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究也存在不足之處，針對(duì)二者具體的分子調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。