黑偉 何志強(qiáng) 張燕偉 張萬鋒 蔡春波 楊陽 高鵬飛 郭曉紅 曹果清 李步高

摘? 要：本試驗(yàn)旨在擴(kuò)增抗纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域蛋白5（Fibronectin Type III Domain Containing Protein 5，F(xiàn)NDC 5）基因的編碼序列（Coding Sequence，CDS），通過生物信息學(xué)軟件分析FNDC5的特性，并分析該基因在晉汾白豬不同組織中的表達(dá)情況。選取1日齡晉汾白豬，以背最長肌cDNA為模板克隆FDNC5基因的CDS序列，利用生物信息學(xué)方法分析FNDC5的結(jié)構(gòu)和功能，采用qRT-PCR檢測FDNC5基因在晉汾白豬不同組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，豬FDNC5基因的CDS序列有843 bp，共編碼280個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)預(yù)測，F(xiàn)NDC5為親水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲分別占31.79%、4.64%、20.36%和43.21%。qRT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)DNC5基因在肌肉、肝臟和心臟中高表達(dá)，在其他組織中的表達(dá)量較少。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討豬FDNC5基因的功能提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：FDNC5基因;擴(kuò)增;表達(dá)

中圖分類號(hào)：S813 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2021）02-0025-06

2002年，纖連蛋白Ⅲ型重復(fù)含蛋白（Fibronectin type Ⅲ Repeat Containing Protein，F(xiàn)RCP2）被發(fā)現(xiàn)，它包含信號(hào)肽、纖維蛋白結(jié)構(gòu)域和疏水性C末端結(jié)構(gòu)域，可以水解形成具有分泌功能的蛋白質(zhì)鳶尾素（Irisin）[1-2]。在小鼠上，抗纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域蛋白5（Fibronectin Type III Domain Containing Protein 5，F(xiàn)NDC5）基因定位在四號(hào)染色體上，包含6個(gè)外顯子，翻譯209個(gè)氨基酸殘基，信號(hào)肽為第1個(gè)至第30個(gè)氨基酸殘基，纖維蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?1個(gè)至第114個(gè)氨基酸殘基，疏水性C末端結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?15個(gè)至第172個(gè)氨基酸殘基。Irisin包含112個(gè)氨基酸殘基，分子量約為12 kDa。生物化學(xué)和X射線晶體學(xué)研究都表明，Irisin以同二聚體的形式存在，在同二聚體之間形成β-折疊。這種結(jié)構(gòu)通過氫鍵與相鄰亞單位（特別是Arg-75和Glu-79）之間相互作用，保護(hù)二聚體末端[3]。

Varela等報(bào)道，F(xiàn)NDC5在骨骼肌中高表達(dá)，在心血管、脂肪和肝組織中也有少量表達(dá)[4]。Irisin通過p38 MAPK和ERK MAPK通路可促進(jìn)脂肪組織UCP-1、PGC-1α、Cox7α、Ebf3等產(chǎn)熱特異性基因的表達(dá)，引起白色脂肪棕色化，增加機(jī)體能量消耗[5]。FNDC5可以增加高脂飲食小鼠的能量消耗，從而使小鼠體重減輕，并且能提高胰島素的敏感性[6]。大鼠靜脈注射Irisin，通過AMPK信號(hào)通路可改善自發(fā)性高血壓大鼠內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而降低其血壓[7]。Irisin通過抑制小鼠CD36、NF-κB的表達(dá)可減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，還可以使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)浸潤的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞以及主動(dòng)脈炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量降低，進(jìn)而減緩病情發(fā)展[8]。

目前國內(nèi)外關(guān)于FNDC5基因的研究大多都是針對(duì)人和小鼠上的FNDC5基因，對(duì)豬FNDC5基因的研究報(bào)道較少。本研究利用RT-PCR擴(kuò)增豬FNDC5基因的編碼序列（Coding Sequence，CDS），運(yùn)用軟件對(duì)FNDC5基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用qRT-PCR檢測FNDC5基因在晉汾白豬各組織中的表達(dá)量，為以后研究豬FNDC5基因的功能提供參考。

1? 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本采集

選取3頭1日齡晉汾白豬，屠宰后取其背最長肌、腎、肝、心、胃、肺、皮下脂肪和脾等組織，迅速放入液氮罐中，之后于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑

2×ES Tap MasterMix購自CWBIO公司;TRIZOL? Reagent購自Life Technologies公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司;氯仿、異丙醇和乙醇等均為分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)和合成

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找豬FNDC5 mRNA序列，運(yùn)用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)普通PCR引物以及qRT-PCR引物，選取18S rRNA為內(nèi)參基因，引物由上海生工生物工程公司合成，引物信息見表1。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

按照Trizol? Reagent試劑盒說明書提取晉汾白豬各組織的總RNA，測定純度和濃度后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA合成采用兩步法， 20 ?L體系，第1步：RNA 800 ng，加去除基因組DNA反應(yīng)試劑至10 ?L，混勻后42 ℃反應(yīng)2 min;第2步：在上述混合液中加入反轉(zhuǎn)錄試劑10 ?L，總體系為20 ?L，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。得到的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 FNDC5基因CDS序列擴(kuò)增

以晉汾白豬背最長肌cDNA為模板擴(kuò)增豬FNDC5基因的CDS序列，PCR反應(yīng)體系為：2×ES Tap MasterMix 10 ?L，上下游引物各1 ?L，cDNA 2 ?L，RNase-free H2O 6 ?L。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)加熱4 min;94 ℃變性30 s;61 ℃退火30 s;72 ℃延伸60 s;共40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測后進(jìn)行膠回收。將回收純化的產(chǎn)物與pMD18-T載體于16 ℃下過夜連接。得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂板挑菌，菌液經(jīng)PCR鑒定后送華大基因公司測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder預(yù)測FNDC5基因的開放閱讀框;利用在線軟件 ProtParam 對(duì)FNDC5基因的編碼蛋白進(jìn)行理化特性分析;利用ProtScale軟件分析豬FNDC5的疏水性圖譜;利用在線軟件PSORT域預(yù)測FNDC5的亞細(xì)胞定位;運(yùn)用SOPMA在線軟件對(duì)FNDC5的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測;利用SWISS-MODEL軟件分析FNDC5三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.6 晉汾白豬各組織FNDC5基因的表達(dá)水平分析

以1日齡晉汾白豬各組織cDNA為模板，18S rRNA為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR檢測FNDC5基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系如下：上下游引物各0.3 ?L，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）5 ?L，cDNA 1 ?L，RNase-free H2O 3.4 ?L。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s，60 ℃? ?1 min;95 ℃ 30 s。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)，基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt方法分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果采用 Duncan's 法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2? 結(jié)果

2.1 FNDC5基因CDS序列擴(kuò)增

以晉汾白豬背最長肌cDNA為模板克隆FNDC5基因的CDS序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的目的條帶與預(yù)期條帶大小相符（圖1）。膠回收后與pMD18-T載體連接，經(jīng)菌液PCR篩選后送去測序，測序結(jié)果與NCBI中豬FNDC5基因CDS序列完全匹配。

2.2 FNDC5基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 FNDC5基因開放閱讀框預(yù)測

運(yùn)用NCBI中的ORF Finder程序進(jìn)行分析，F(xiàn)NDC5基因的開放閱讀框位于1 bp～843 bp，編碼280個(gè)氨基酸（圖2）。

2.2.2 FNDC5的理化特性分析

利用在線軟件 ProtParam 對(duì)FNDC5基因的編碼蛋白進(jìn)行理化特性分析，結(jié)果表明，F(xiàn)NDC5的分子式為C1382H2223N385O401S17，總原子數(shù)為4 408個(gè)，分子量為31.19 ku，理論等電點(diǎn)（PI）為8.55。FNDC5共包含20種氨基酸，含量最高的為亮氨酸（10.4%），最少的為組氨酸和酪氨酸，所占比例都為1.4%（表2）。帶正電氨基酸殘基（精氨酸和賴氨酸）33個(gè)，帶負(fù)電氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）29個(gè)。平均親水性系數(shù)是-0.069，不穩(wěn)定系數(shù)為58.43。該蛋白半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為94。

2.2.3 FNDC5疏水性分析及亞細(xì)胞定位

利用ProtScale軟件分析豬FNDC5的疏水性圖譜（圖3）。FNDC5第152位氨基酸的疏水性分值最高，為4.022，疏水性最強(qiáng)，第177位和第199位氨基酸的分值最低，為-3.078，親水性最強(qiáng)。FNDC5共編碼280個(gè)氨基酸，其中145個(gè)氨基酸的分值小于0，135個(gè)氨基酸的分值大于0，親水性氨基酸比疏水性氨基酸多，但均勻分布在整個(gè)肽鏈中。

利用在線軟件PSORT域預(yù)測FNDC5的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，F(xiàn)NDC5主要位于細(xì)胞質(zhì)中，44.4%位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，33.3%位于高爾基體，22.2%位于細(xì)胞質(zhì)膜。

2.2.4 FNDC5高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用SOPMA在線軟件對(duì)FNDC5的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲分別占31.79%、4.64%、20.36%和43.21%（圖4）。利用SWISS-MODEL軟件分析FNDC5的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，F(xiàn)NDC5含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等復(fù)雜結(jié)構(gòu)（圖5）。

2.2.5 FDNC5基因在各組織的表達(dá)特性分析

利用qRT-PCR檢測FNDC5基因在晉汾白豬8種組織（背最長肌、腎、肝、心、胃、肺、皮下脂肪和脾）中的表達(dá)量。由圖6可知，在所檢測的8種組織中，F(xiàn)NDC5基因均有表達(dá)，但存在較大差異。FNDC5基因在肌肉、肝臟和心臟中高表達(dá)，在其他組織中的表達(dá)量較少。

3? 討論

FNDC5基因在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、能量代謝和血管生成方面有重要作用。目前，F(xiàn)NDC5基因在人類心血管疾病方面以及在小鼠肌肉與脂肪等組織上的研究較多[9-11]，在豬上的報(bào)道較少。本試驗(yàn)運(yùn)用PCR擴(kuò)增得到晉汾白豬FNDC5基因的CDS序列，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用qRT-PCR檢測FNDC5基因在晉汾白豬各組織中的表達(dá)情況。

骨骼肌是能量代謝最旺盛的器官，參與機(jī)體各種生命活動(dòng)。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（Peroxisome Proliferator-activated Receptor Gamma Coactivator 1α，PGC1α）是一種參與基因表達(dá)調(diào)控的因子，在維持葡萄糖、脂質(zhì)和能量穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用。PGC1α通過運(yùn)動(dòng)在骨骼肌中被誘導(dǎo)，并具有刺激運(yùn)動(dòng)的有益作用[12]。Bostrom等[6]在小鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PGC 1α水平升高時(shí)會(huì)上調(diào)Irisin表達(dá)，在其分泌到血液時(shí)會(huì)促進(jìn)UCP1的表達(dá)，并誘導(dǎo)白色脂肪細(xì)胞向米色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加機(jī)體總能量的消耗。有報(bào)道顯示，耐力訓(xùn)練可提高快肌中Irisin蛋白水平，降低慢肌中Irisin蛋白水平[13]。FNDC5基因在豬上的功能及其調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

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