張家萌，魏嘉雯，張惠玲，*

(1.寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021)

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)是一種兼性厭氧、革蘭氏陽性、異型發(fā)酵乳酸菌[1]，廣泛存在于發(fā)酵乳制品和人體腸道中，具有平衡腸道菌群、緩解結(jié)腸炎癥狀、增強人體免疫力等多種益生特性[2]。Van Hoorde等[3]研究表明，副干酪乳桿菌在發(fā)酵過程中會代謝產(chǎn)生酶和其他風味調(diào)節(jié)物質(zhì)。Poveda等[4]用L.paracaseissp. CECT 7882菌株發(fā)酵奶酪，檢測到奶酪中的游離脂肪酸和醇類等物質(zhì)含量都有所增加，較傳統(tǒng)的奶酪風味質(zhì)量明顯提升。Sunthornthummas等[5]的研究顯示，服用含有高活菌數(shù)的乳酸菌發(fā)酵制品對調(diào)節(jié)餐后血糖有良好的效果。

紅棗又名大棗，具有旱、澇適應(yīng)力強的特點，在我國有著悠久的種植歷史。紅棗富含氨基酸、多糖、多酚、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，被視為“上等補品”。然而，受到運輸和保藏條件限制，鮮棗銷路不暢，而干棗價格又較低，經(jīng)濟效益不明顯[6]。近年來，利用發(fā)酵方式處理紅棗的研究逐漸增加，如利用乳酸菌發(fā)酵紅棗汁制得具有降血脂功能的紅棗功能型飲料，或者添加麩皮水解物等功能性物質(zhì)來提高產(chǎn)品的腸道益生功能[7]。

固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵相比，具有環(huán)境友好、能耗低、產(chǎn)率高的特點，在生物制造和食品產(chǎn)業(yè)中受到越來越多的關(guān)注。近年來，利用固態(tài)發(fā)酵處理香蕉皮、花生殼、蘋果渣、甘蔗渣、柑橘渣、檸檬皮、麥麩和豆粕等工業(yè)廢渣生產(chǎn)酶制劑、香料和各種有機酸的研究逐漸增加[8]。寧夏盛產(chǎn)紅棗，以紅棗為主要原料的發(fā)酵研究主要集中于液態(tài)發(fā)酵方面，少有關(guān)于固態(tài)發(fā)酵的研究。但液態(tài)產(chǎn)品存在不易攜帶、保質(zhì)期較短等問題，且發(fā)酵相同質(zhì)量的原料需要更大的反應(yīng)器。針對以上問題，本研究利用固態(tài)發(fā)酵手段處理紅棗，基于副干酪乳酸菌固態(tài)發(fā)酵紅棗，減少底物中的還原糖含量，增加活性益生菌，得到具有高活菌數(shù)、高含量活性成分的紅棗益生菌粉，以期為紅棗的精加工提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干紅棗(寧夏同心圓棗)、豆粉、麥麩，均為市售；試驗所用的副干酪乳桿菌TK1501菌種保藏于天津科技大學實驗室，保藏編號為CGMCC No.13130。

沒食子酸(分析純)、α-淀粉酶(生化試劑)、中性蛋白酶(生化試劑)，購于上海源葉生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基(生化試劑)、濃硫酸(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)，購于天津市化學試劑一廠；β-巰基乙醇(分析純)、福林酚(分析純)，購于上海荔達生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DWS-302型恒溫培養(yǎng)箱，天津市天宇實驗儀器有限公司；L3000型冷凍干燥機，美國Thermo Scientific公司；PHS-2C型PH計、AB204-S型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；VM-5S型水分測試儀，泰州市科拓儀器設(shè)備有限公司；高速粉碎機，東莞市華太電器有限公司；NAZDNM-9602A型酶標儀，北京普析通用儀器有限責任公司；1260 Infinity型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；TCL-12型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；SP-2012UV型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.3 種子液與培養(yǎng)基制備

1.3.1 活化培養(yǎng)基

配置液態(tài)MRS培養(yǎng)基：取MRS培養(yǎng)基49.7 g，溶于1 000 mL水中，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.3.2 種子液

一級種子液：向100 mL玻璃瓶中加入活化培養(yǎng)基20 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

二級種子液：向250 mL玻璃瓶中加入活化培養(yǎng)基100 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.3.3 棗粉制備

干棗原料分選→去核→50 ℃烘干→粉碎→過50目篩→棗粉(備用)。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

取原料紅棗粉和豆粉依9∶1的比例混合均勻，稱取20 g，以料水比(質(zhì)量體積比，下同)1∶0.8的比例加水混合均勻，100 ℃滅菌30 min，冷卻后備用。

1.3.5 計數(shù)培養(yǎng)基

配置固態(tài)MRS培養(yǎng)基：取MRS培養(yǎng)基49.7 g、瓊脂粉20 g，溶于1 000 mL水中，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.3.6 種子液活化

將甘油管中保藏的菌液按照10%的體積分數(shù)接入無菌的活化培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。取活化菌液200 μL接入一級種子液中，37 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL經(jīng)一級活化的種子液接入二級種子液中，37 ℃培養(yǎng)24 h，完成二級活化。按照10%的接種量(接種種子液與基質(zhì)的體積質(zhì)量比，下同)，將經(jīng)二級活化的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵，每隔6 h取樣。

1.4 發(fā)酵工藝流程

純紅棗固態(tài)基質(zhì)黏性大、孔隙率小，不利于固態(tài)發(fā)酵體系內(nèi)部的熱量散發(fā)。只有改變基質(zhì)疏松程度，提高散熱率，才能進一步提高微生物的生物量[9]。因此，向純紅棗固態(tài)基質(zhì)中添加豆粉和麥麩，改善基質(zhì)碳氮比和疏松程度，加快熱量散發(fā)，以利于活菌數(shù)提高。

棗粉→添加不同比例輔料→加水混勻→滅菌(100 ℃，30 min)→接種，37 ℃密閉發(fā)酵→干燥破碎→成品。

1.5 試驗設(shè)計

1.5.1 單因素試驗設(shè)計

(1)麥麩添加量確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基豆粉添加量(質(zhì)量分數(shù)，下同)25%、料水比1∶0.9的條件下，設(shè)置麥麩添加量(質(zhì)量分數(shù)，下同)為4%、7%、10%、13%、16%，按照10%的接種量接入經(jīng)二級活化的種子液，37 ℃發(fā)酵24 h，然后冷凍干燥24 h，進行感官評價，檢測活菌數(shù)。

(2)豆粉添加量確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基麥麩添加量10%、料水比1∶0.9的條件下，設(shè)置豆粉添加量為10%、15%、20%、25%、30%。其他試驗步驟同麥麩添加量確定。

(3)料水比確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基豆粉添加量25%、麥麩添加量10%的條件下，設(shè)置料水比分別為1∶0.5、1∶0.7、1∶0.9、1∶1.1、1∶1.3。其他試驗步驟同麥麩添加量確定。

(4)發(fā)酵時間確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基豆粉添加量25%、麥麩添加量10%、料水比1∶0.9的條件下，按照10%的接種量接入經(jīng)二級活化的種子液，分別發(fā)酵12、18、24、30、36 h。其他試驗步驟同麥麩添加量確定。

(5)接種量確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基豆粉添加量25%、麥麩添加量10%、料水比1∶0.9的條件下，設(shè)置接種量分別為4%、7%、10%、13%、16%。其他試驗步驟同麥麩添加量確定。

(6)干燥方式確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基豆粉添加量25%、麥麩添加量10%、料水比1∶0.9的條件下，按照10%的接種量接入經(jīng)二級活化的種子液，發(fā)酵24 h。每份樣品稱取10.00 g放于直徑9 cm的玻璃平皿中，鋪平，進行干燥。干燥條件分別設(shè)置為-50 ℃冷凍干燥、40 ℃低溫鼓風干燥、65 ℃鼓風干燥，在前述3種干燥條件下均分別設(shè)置烘干時間為6、12、18、24 h。烘干完成后，分別檢測水分含量、活菌數(shù)，并進行感官評價。

1.5.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

以豆粉添加量、麥麩添加量、接種量和發(fā)酵時間為變量，依次編為A～D，進行響應(yīng)面工藝優(yōu)化。編碼水平1、0、-1分別表示各變量的高、中、低水平，以活菌數(shù)和感官評價得分為響應(yīng)值進行試驗。各變量高、中、低水平所對應(yīng)的值詳見表1。

1.6 指標測定

1.6.1 穩(wěn)定性評價

將發(fā)酵后的樣品干燥至含水量低于7%，把樣品分為8份，每份10 g，裝入無菌袋中抽真空密封，于(37±2)℃條件下保藏90 d。每隔15 d取樣一次，分別檢測樣品活菌數(shù)、pH值和水分含量，同時觀察樣品的顏色、氣味有無明顯變化。

1.6.2 感官評價

在單因素試驗和響應(yīng)面試驗中，首先，對干燥后的固態(tài)粉末狀樣品進行初步觀察評價；然后，取5 g粉末狀樣品加入約40 ℃的飲用水20 mL沖調(diào)，由20名食品專業(yè)的課題組學生(10男10女)組成評定小組，經(jīng)集中培訓合格后，對沖調(diào)后的飲品進行感官評價。感官評價項目、要求，及相應(yīng)的分值詳見表2。

對于按照優(yōu)化后的工藝制成的紅棗益生菌粉，由同一評定小組的20人，從組織形態(tài)、外觀、香氣和口感4個方面進行綜合評價。評分標準參考團體標準T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》和文獻[10-11]中的固態(tài)飲料感官評價，詳見表3。

表1 變量編碼值

表2 感官評價賦分表

1.6.3 理化指標測定

(1)活菌數(shù)檢測。采用傾注平板計數(shù)法，取1 g樣品加入9 mL滅菌生理鹽水，用渦旋振蕩器充分混合后，采用10倍梯度系列稀釋，選擇3個合適稀釋度的樣品，各取1 mL加入無菌玻璃平板中，倒入計數(shù)培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個濃度梯度做3組平行，取平均值。

(2)pH檢測。稱取樣品2 g，放入錐形瓶中，加入18 mL蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌均勻，靜置10 min后測定樣品的pH值。每個樣品平行測定3次，取平均值。

表3 綜合評價標準

(3)含水量檢測。精確稱取2.00 g樣品均勻鋪滿金屬托盤，放入水分測試儀中進行檢測，每個樣品平行測定3次，取平均值。

1.6.4 質(zhì)量指標測定

(1)糖類含量。樣品加3倍體積的水稀釋后，于50 ℃浸泡2 h。取混合液于4 000 r·min-1離心10 min，取上清液用過膜水稀釋20倍，過水膜備用。利用高效液相色譜檢測樣品中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量。色譜條件：流動相為乙腈-水溶液(體積比75∶25)，流速0.8 mL·min-1；色譜柱為Prevall Carb ES Column-W(250 mm×4.6 mm)，柱溫30 ℃；檢測器為蒸發(fā)光檢測器(Alltech 3300 ELSD)；漂移管溫度90 ℃；氣體流速2.4 L·min-1[12]。

(2)有機酸含量。樣品加3倍體積的水稀釋后，于4 ℃浸泡4 h。取混合液于4 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液用過膜水稀釋，過水膜備用。利用高效液相色譜檢測樣品中的有機酸。色譜條件：流動相為5 mmol·L-1H2SO4溶液，流速0.4 mL·min-1；色譜柱為Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)；柱溫30 ℃；紫外檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

(3)γ-氨基丁酸(GABA)含量。樣品加3倍體積的水稀釋后，于4 000 r·min-1離心10 min，取上清液用過膜水稀釋，過水膜備用。參照文獻[13]，利用高效液相色譜檢測基質(zhì)中的GABA含量。

(4)總酚含量。參照文獻[14]，移取樣品提取液0.5 mL，加入稀釋1倍的福林酚試劑0.5 mL，混勻，再加入質(zhì)量分數(shù)為10%的Na2CO3溶液1.5 mL，用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻，75 ℃反應(yīng)10 min，于760 nm波長處測定吸光值。以沒食子酸為標準品。

(5)游離氨基酸含量。取1 g樣品溶于9 mL去離子水，4 ℃靜置4 h，4 000 r·min-1離心20 min，取上清液備用。參照文獻[15]，采用茚三酮比色法檢測樣品中的游離氨基酸含量。

(6)粗多糖含量。參照文獻[16]，每份樣品稱取0.5 g，用超聲復(fù)合酶法提取多糖。根據(jù)SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚-硫酸法》，測定粗多糖含量。

(7)黃酮含量。參照SN/T 4592—2016《出口食品中總黃酮的測定》，測定樣品中的總黃酮含量。

(8)膳食纖維含量。稱取2 g樣品，粉碎過100目篩，加入95%(體積分數(shù))乙醇脫糖30 min，4 000 r·min-1離心10 min，60 ℃干燥24 h；再次粉碎加水調(diào)節(jié)pH(控制pH值在6.0左右)，加入質(zhì)量分數(shù)為0.5%的α-淀粉酶，50 ℃酶解40 min，100 ℃滅酶10 min；加入質(zhì)量分數(shù)為0.6%的中性蛋白酶，50 ℃酶解40 min，100 ℃滅酶10 min，4 000 r·min-1離心10 min；濾液加入3倍體積的95%(體積分數(shù))乙醇，60 ℃沉淀 12 h，4 000 r·min-1離心10 min，干燥稱重，得可溶性膳食纖維含量[17]。依次用10 mL去離子水、10 mL 75%(體積分數(shù))乙醇、10 mL丙酮洗滌濾渣，干燥稱重，得不溶性膳食纖維含量[18]。

(9)乙醇含量。根據(jù)GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》測定樣品中的乙醇含量。

(10)總酸含量。根據(jù)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》測定食品中的總酸含量。

1.6.5 微生物安全指標檢測

分別依據(jù)GB/T 13092—2006《飼料中霉菌總數(shù)的測定》、GB/T 18869—2019《飼料中大腸菌群的測定》、GB/T 23743—2009《飼料中凝固酶陽性葡萄球菌的微生物學檢驗 Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)法》、GB/T 13091—2018《飼料中沙門氏菌的測定》，測定樣品中的霉菌、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵棗粉工藝的單因素優(yōu)化

2.1.1 麥麩添加量對產(chǎn)品活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

圖1 麥麩添加量對產(chǎn)品活菌數(shù)和感官評價得分的影響Fig.1 Effect of wheat bran content on viable count and sensory evaluation score of products

隨著麥麩添加量的增加，產(chǎn)品活菌數(shù)與感官評價得分均呈先上升后下降的趨勢(圖1)，當麥麩添加量為10%時，產(chǎn)品活菌數(shù)與感官評價評分均達最大值。麥麩含量會影響發(fā)酵基質(zhì)的疏松程度和氧氣傳遞，當麥麩添加量大于13%時，基質(zhì)疏松程度明顯增大，氧氣含量上升，導(dǎo)致活菌數(shù)下降[19]。麥麩對產(chǎn)品口感有明顯不良影響，麥麩含量過高，會導(dǎo)致產(chǎn)品口感粗糙，且有不愉快氣味產(chǎn)生。綜上，麥麩添加量宜為10%。

2.1.2 豆粉添加量對產(chǎn)品活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

在試驗條件下，隨著豆粉添加量的增加，活菌數(shù)快速增長(圖2)，但感官評價得分先緩增后下降，在25%的豆粉添加量下取得最高的感官評價得分。當豆粉添加量>25%時，菌體快速繁殖，產(chǎn)生大量的有機酸，使樣品口感偏酸，并且產(chǎn)生尖酸氣味，致使感官評價得分下降。綜上，豆粉添加量宜為25%。

2.1.3 料水比對產(chǎn)品活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

隨著料水比的降低，產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官評價得分均呈先上升后下降的趨勢(圖3)。當料水比為1∶0.5時，基質(zhì)難以拌勻，有少量干粉狀物質(zhì)存在，副干酪乳桿菌幾乎不能生長；當料水比在1∶0.9～1∶1.1，產(chǎn)品活菌數(shù)無明顯差別，但當料水比為1∶0.9時，產(chǎn)品的感官評價得分略高；當料水比為1∶1.3時，基質(zhì)為黏稠狀液體，不能算作固態(tài)發(fā)酵。考慮到基質(zhì)中含水量高會延長凍干時間，綜合上述分析，料水比宜為1∶0.9。

圖2 豆粉添加量對產(chǎn)品活菌數(shù)和感官評價得分的影響Fig.2 Effect of soybean flour content on viable count and sensory evaluation score of products

2.1.4 發(fā)酵時間對產(chǎn)品活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

隨著發(fā)酵時間延長，產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官評價得分均呈先增長后減小的趨勢(圖4)，并在24 h達到最大值。若發(fā)酵時間過長，基質(zhì)中會積累較多有機酸，導(dǎo)致感官評價得分略降。綜合活菌數(shù)和感官評價得分，發(fā)酵時間宜為24 h。

圖3 料水比對產(chǎn)品活菌數(shù)和感官評價得分的影響Fig.3 Effect of ratio of material to water on viable count and sensory evaluation score of products

圖4 發(fā)酵時間對產(chǎn)品活菌數(shù)和感官評價得分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on viable count and sensory evaluation score of products

2.1.5 接種量對產(chǎn)品活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

隨著接種量增加，產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官評價得分先增加后減少(圖5)。當接種量較低時，接入基質(zhì)中的副干酪乳桿菌數(shù)量少，生長緩慢；當接種量大于10%時，接入基質(zhì)中的副干酪乳桿菌數(shù)量較多，菌體繁殖快速，產(chǎn)酸量大，且快速發(fā)酵過程中產(chǎn)生刺激性氣味，導(dǎo)致感官評價得分降低；當接種量為10%時，產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官評價得分均最高。綜上。接種量宜為10%。

圖5 接種量對產(chǎn)品活菌數(shù)和感官評價得分的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on viable count and sensory evaluation score of products

2.1.6 干燥方式對產(chǎn)品含水量、活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

-50 ℃冷凍干燥、40 ℃鼓風干燥、65 ℃鼓風干燥將樣品含水量降至7%所需的時間分別為24、18、12 h(圖6)。待樣品含水量降至7%時，-50 ℃冷凍干燥、40 ℃鼓風干燥、65 ℃鼓風干燥樣品中的活菌數(shù)分別為6.34×108、4.53×108、7.50×106CFU·g-1，說明-50 ℃冷凍干燥和40 ℃鼓風干燥對產(chǎn)品活菌數(shù)的影響較小，而65 ℃鼓風干燥樣品中的活菌數(shù)明顯下降；-50 ℃冷凍干燥樣品的感官評價得分最高，且產(chǎn)品有明顯的紅棗香氣，40 ℃鼓風干燥樣品的感官評價得分次之，65 ℃鼓風干燥樣品的質(zhì)地較硬，且有焦糊味，感官評價得分最低。綜上，-50 ℃冷凍干燥所需時間最長，但其產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官評價得分優(yōu)于另外2種干燥方式的產(chǎn)品，宜選擇-50 ℃冷凍干燥作為產(chǎn)品的干燥方式。

圖6 干燥方式對產(chǎn)品含水量、活菌數(shù)和感官評價得分的影響Fig.6 Effect of drying method on water content，viable count and sensory evaluation score of products

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以豆粉添加量(A)、麥麩添加量(B)、接種量(C)、發(fā)酵時間(D)為供試因素，開展4因素3水平的Box-Behnken試驗(表4)。

基于試驗數(shù)據(jù)，分別對活菌數(shù)(R1)、感官評價得分(R2)進行二次方程的回歸擬合：

R1=6.95+0.16A-0.42B+0.11C+0.33D-0.39AB-0.72AC-0.73AD-0.087BC-0.50BD+0.50CD-1.42A2-0.86B2-0.83C2-0.60D2；

(1)

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

R2=87.46-2.57A-7.14B+2.5×10-3C-0.95D+0.34AB-3.45AC-1.47AD-1.88BC+0.42BD-1.47CD-2.90A2-7.00B2-3.10C2-4.17D2。

(2)

對構(gòu)建的方程進行方差分析，結(jié)果顯示，所構(gòu)建的方程均達到極顯著(P<0.01)水平。關(guān)于R1、R2的方程的失擬項均不顯著(P>0.05)，說明方程的擬合程度較好[20]。關(guān)于R1的方程中，B、AC、AD、A2、B2、C2、D2項均通過了P<0.01的顯著性檢驗；關(guān)于R2的方程中，A、B、B2、D2項均通過了P<0.01的顯著性檢驗。

對供試因素及其交互作用進行響應(yīng)面分析(圖7～圖10)。從各因素及其交互作用對產(chǎn)品活菌數(shù)的影響來看，曲面圖皆為開口向下的凸形曲面，說明響應(yīng)值在試驗因素變化范圍內(nèi)存在極高值。AC、BD曲面彎曲程度大，且等高線均為密集的橢圓形，說明接種量與豆粉添加量、麥麩添加量與發(fā)酵時間的交互作用明顯，且對活菌數(shù)有明顯影響；AB、BC曲面彎曲程度大，但等高線均為圓形，說明兩者交互作用明顯，但對活菌數(shù)沒有明顯影響。

從各因素及其交互作用對產(chǎn)品感官評價得分的影響來看，AC、CD曲面陡峭，等高線均為密集的橢圓形，說明接種量與豆粉添加量、接種量與發(fā)酵時間的交互作用明顯，且對感官評價得分影響明顯；BC、BD曲面坡度較大，等高線為稀疏的圓形，說明麥麩添加量與接種量、麥麩添加量與發(fā)酵時間的交互作用明顯，但對感官評價得分無明顯影響。

2.3 驗證試驗結(jié)果與分析

圖7 不同因素對活菌數(shù)影響的三維曲面圖Fig.7 Three-dimensional surface plot of factors on viable count of products

圖8 因素交互作用對活菌數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot of interactions of factors on viable count of products

圖9 不同因素對感官評價得分影響的三維曲面圖Fig.9 Three-dimensional surface plot of factors on sensory evaluation score of products

圖10 因素交互作用對感官評價得分影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface plot of interactions of factors on sensory evaluation score of products

對所構(gòu)建的方程進行分析，得到的最佳發(fā)酵工藝條件為：豆粉添加量24.21%，麥麩添加量8.74%，接種量10.40%，發(fā)酵時間24.92 h。在此工藝條件下，基于所構(gòu)建方程的預(yù)測活菌數(shù)為7.05×108CFU·g-1，感官評價得分為89.21。為了驗證上述結(jié)果的可靠性，在得到的最佳工藝條件下進行試驗。考慮到實際操作的方便性，將工藝參數(shù)修正為：豆粉添加量24%，麥麩添加量9%，接種量10%，發(fā)酵時間24 h。經(jīng)實測，產(chǎn)品活菌數(shù)為7.21×108CFU·g-1，感官評價得分為90.24。驗證試驗的結(jié)果與預(yù)測值接近，說明所構(gòu)建的二次回歸方程準確有效，對試驗結(jié)果的擬合程度較好，具有一定的實用價值[21]。

由于制得的紅棗粉末中仍含有大量未發(fā)酵完的有機原料和乳酸菌活菌，在適宜的溫度和濕度條件下微生物會繁殖生長，因此一些功能成分，如酚類物質(zhì)、糖類和酯類物質(zhì)在一定條件下會產(chǎn)生變化，造成產(chǎn)品變質(zhì)[22]。為此，特開展穩(wěn)定性試驗，檢測發(fā)酵后的樣品在存放過程中的活菌數(shù)、含水量和pH值變化情況(表5)，檢驗樣品是否會在短期存放過程快速變質(zhì)。

在產(chǎn)品存放期間，含水量無明顯變化，pH值緩慢下降，60 d內(nèi)活菌數(shù)未明顯下降，說明產(chǎn)品有一定的穩(wěn)定性。含活菌的功能性產(chǎn)品想要發(fā)揮其相應(yīng)的益生作用，需要保證活菌數(shù)≥106CFU·g-1。在試驗期間(90 d)，產(chǎn)品的活菌數(shù)均符合該要求。綜上，該產(chǎn)品有一定的穩(wěn)定性。這可能得益于固態(tài)產(chǎn)品含水量低，微生物基本處于休眠狀態(tài)，因而產(chǎn)品具有較好的保藏性。

除活菌外，發(fā)酵后基質(zhì)中的多項活性物質(zhì)含量有所增加(表6)。其中，粗多糖、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、乙酸、游離氨基酸、GABA含量均有明顯增加。副干酪乳桿菌有產(chǎn)胞外多糖的能力，同時發(fā)酵體系還提供了合成胞外多糖所必需的乙酸和蔗糖等物質(zhì)，為合成多糖提供了良好的營養(yǎng)條件[23]。副干酪乳桿菌可以通過谷氨酸脫羧酶(GAD)體系產(chǎn)生GABA[24]。蘋果酸、乙酸、乳酸含量增加的原因可能是，固態(tài)發(fā)酵體系中存在頂空層(氣相層)和物料層，菌體參與了有氧代謝和厭氧代謝2種代謝途徑，乳酸菌在厭氧代謝中，利用其他物質(zhì)合成蘋果酸，同時有氧代謝會利用蘋果酸產(chǎn)生少量乙酸和乳酸[25]。富馬酸含量沒有發(fā)生明顯變化，說明該菌既不產(chǎn)生也不利用富馬酸。副干酪乳桿菌代謝過程產(chǎn)生了大量的有機酸，體系pH降低，激活了植物內(nèi)某些內(nèi)源性蛋白酶的活性，在酸性環(huán)境和酶的共同作用下，大分子的蛋白質(zhì)被降解，導(dǎo)致游離氨基酸含量增加[26]。有研究顯示，乳酸菌發(fā)酵可以有效分解小麥蛋白，形成小分子多肽和氨基酸。因此，發(fā)酵后游離氨基酸含量明顯增加，基質(zhì)具有更好的消化性和生理活性[27]。

表5 穩(wěn)定性試驗檢測結(jié)果

表6 發(fā)酵前后基質(zhì)中質(zhì)量指標的變化

發(fā)酵后基質(zhì)中的葡萄糖和蔗糖含量明顯減少，說明副干酪乳桿菌在發(fā)酵過程中主要消耗葡萄糖和蔗糖進行生長代謝。發(fā)酵過程中果糖含量無明顯變化，說明該菌幾乎不分解代謝果糖。發(fā)酵后黃酮、總酚含量分別下降了6.8%、20.3%。這可能是因為，副干酪乳桿菌沒有產(chǎn)生多酚類物質(zhì)的能力，而固態(tài)發(fā)酵環(huán)境中氧氣含量較高，可能對黃酮和酚類等成分有一定的破壞作用，因此造成該類物質(zhì)含量下降。

檢測的5個樣品中有1個樣品檢出大腸埃希菌，經(jīng)檢驗，系取樣過程染菌；其他樣品中均未檢測到金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、霉菌。由于上述試驗均處于實驗室環(huán)境中，所有原材料均經(jīng)過嚴格篩選，所有流程也都嚴格按照無菌操作進行，因此染菌風險較小。

對產(chǎn)品進行綜合評價，產(chǎn)品沖泡后香氣純正，有濃郁紅棗香，口感酸甜度適中，口感協(xié)調(diào)度較高，但順滑度、均一狀態(tài)和溶解性較差。這可能是由產(chǎn)品含有麥麩、紅棗顆粒所致，還需改進?？傮w而言，用副干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵制得的紅棗益生菌粉沖泡后口感良好，總體評價得分為7.35。

圖11 綜合評價結(jié)果雷達圖Fig.11 Radar chart of comprehensive evaluation results

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗與響應(yīng)面試驗，確定了副干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵棗粉的最佳發(fā)酵條件為：豆粉添加量24%，麥麩添加量9%，料水比1∶0.9，接種量10%，發(fā)酵時間24 h，-50 ℃冷凍干燥24 h。該工藝條件下制得樣品的穩(wěn)定性好，在(37±2)℃條件下存放60 d后活菌數(shù)仍然大于108CFU·g-1。該工藝條件下制得的紅棗益生菌粉產(chǎn)品質(zhì)量指標均能達到行業(yè)標準要求，并且粗多糖、GABA、游離氨基酸含量較發(fā)酵前提高。綜上所述，在此工藝條件下，副干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵紅棗制得的紅棗益生菌粉不僅含有大量活菌，還提高了部分活性物質(zhì)的產(chǎn)量，且產(chǎn)品綜合評價得分較高，有濃郁棗香味，口感酸甜度適中且協(xié)調(diào)度較高，是一種口感良好、有較高營養(yǎng)價值的固態(tài)飲料。