王洪偉 林娟

(海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院婦產科，海南 海口 570311)

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高，手術、放療、化療是目前主要治療方式，雖取得一定效果，但對于晚期和復發(fā)轉移的患者尚未有令人滿意的治療手段，因此探索和發(fā)展更有效的治療方式有重要意義〔1〕。隨著分子生物學的發(fā)展，靶向治療成為癌癥治療新方法，能提高療效、減少毒副作用〔2〕。微小RNA(miRNA)是一類內源性小分子非編碼單鏈RNA，廣泛參與轉錄后水平調控，研究發(fā)現(xiàn)其在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色，有望成為宮頸癌診斷的新標志物和治療的新靶點〔3〕。研究表明在胃癌組織和細胞中miR-411-5p低表達，過表達miR-411-5p抑制胃癌細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡〔4〕。miR-411-5p過表達可降低黑色素瘤細胞A375增殖及侵襲能力，同時可降低癌相關成纖維細胞(CAF)侵襲能力〔5〕。鞘氨醇激酶(SPHK)1是一種致癌激酶，其在多種惡性腫瘤中上調表達，并與其進展相關〔6〕。干擾SPHK1基因表達可有效抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖、遷移能力，誘導細胞凋亡〔7〕。宮頸癌組織中SPHK1的表達顯著增加，與腫瘤大小、侵襲深度、FIGO分期、淋巴結轉移和淋巴血管侵襲顯著相關〔8〕。且還有研究發(fā)現(xiàn)miR-411在宮頸癌組織和細胞系中顯著下調，miR-411的低表達與腫瘤大小、FIGO分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關，可通過直接靶向STAT3抑制宮頸癌的進展〔9〕。但miR-411-5p對宮頸癌存活和凋亡的影響及其分子機制是否與SPHK1有關尚未清楚。本研究探討miR-411-5p是否通過SPHK1影響宮頸癌的存活和凋亡。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 正常宮頸細胞株Ect1/E6E7和宮頸癌細胞HeLa、SiHa、C33a、Caski購自上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；Trizol、熒光定量試劑盒、LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司、二辛可寧酸(BCA)試劑盒、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒；雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。電泳儀、轉膜儀及凝膠成像儀、酶標儀均購自美國BIO-RAD公司；流式細胞儀購自美國FACS caliber公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 正常宮頸細胞株Ect1/E6E7和宮頸癌細胞HeLa、SiHa、C33a、Caski用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液1次，待細胞融和至80%左右時，加入胰蛋白酶進行消化傳代，選取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2細胞轉染 取對數(shù)生長期細胞SiHa培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基，將miR-con、miR-411-5p、anti-miR-con、anti-miR-411-5p、si-con、si-SPHK1分別轉染至SiHa細胞中，分別記為miR-con組、miR-411-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-411-5p組、si-con組、si-SPHK1組；將miR-411-5p質粒分別與pcDNA、pcDNA-SPHK1共轉染至SiHa細胞中，分別記為miR-411-5p+pcDNA組、miR-411-5p+pcDNA-SPHK1組。轉染按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測miR-411-5p表達水平 提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度。用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照熒光定量使用說明配制反應體系，miR-411-5p以U6為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環(huán)條件為95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；72℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。miR-411-5p上游引物：5′-TCGCTGTAGTAGACCGTAT-3′，下游引物：5′-GCACCTCAGGCTTGTACC-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGCAGCACATATACTAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2.4Western印跡檢測SPHK1、細胞核增殖抗原標志物(Ki67)、細胞周期素(Cyclin)D1、酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、酶切caspase-9表達水平 提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。測濃度后上樣，電泳90 min轉膜至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉封閉90 min后加入一抗4℃孵育過夜；TBST洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，再用TBST洗滌3次，每次5～10 min，顯影，定影，用Quantity One凝膠分析軟件處理，測各條帶吸光度值，蛋白相對表達水平=目的條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值。每個蛋白樣品設3個重復。

1.2.5MTT檢測細胞活性 各組細胞培養(yǎng)至48 h時，分別加入5 mg/ml MTT 10 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h；1 000 r/min離心10 min，吸棄培養(yǎng)液，每孔加 150 μl的DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。然后在酶標儀上檢測490 nm波長的吸光度(OD)值。細胞活性(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 各組細胞培養(yǎng)48 h后，1 000 r/min離心5 min，吸去培養(yǎng)液用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，加入Annexin V-FITC和PI，37℃避光反應10 min，流式細胞儀檢測激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射波長560 nm處的熒光強度。實驗重復3次。

1.2.7熒光素酶報告實驗檢測miR-411-5p對SPHK1的靶向調控 構建SPHK1的野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-SPHK1和MUT-SPHK1，用LipofectamineTM2000將WT-SPHK1和MUT-SPHK1分別與miR-con和miR-411-5p共轉染至SiHa細胞中。按照說明書操作進行，檢測熒光活性，實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.00軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1宮頸癌細胞和正常宮頸細胞中miR-411-5p和SPHK1的表達 與正常宮頸細胞Ect1/E6E7相比，宮頸癌細胞HeLa、SiHa、C33a、Caski中miR-411-5p表達水平顯著降低，SPHK1表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測宮頸癌細胞和正常宮頸細胞中SPHK1蛋白的表達

表1 宮頸癌細胞和正常宮頸細胞中miR-411-5p和SPHK1的表達

2.2轉染miR-411-5p對宮頸癌SiHa細胞存活的影響 與miR-con組相比，miR-411-5p組宮頸癌SiHa細胞中Ki67、CyclinD1表達水平顯著降低，細胞活性顯著降低(P<0.05)，見圖2，表2?？梢姡琺iR-411-5p過表達抑制宮頸癌SiHa細胞存活。

圖2 宮頸癌SiHa細胞Ki67和CyclinD1蛋白表達

表2 轉染miR-411-5p對宮頸癌SiHa細胞存活的影響

2.3轉染miR-411-5p對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響 與miR-con組相比，miR-411-5p組宮頸癌SiHa細胞中酶切caspase-3、酶切caspase-9表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見表3，圖3?？梢姡琺iR-411-5p過表達促進宮頸癌SiHa細胞凋亡。

表3 轉染 miR-411-5p對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響

圖3 宮頸癌SiHa細胞凋亡和細胞中酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白表達

2.4miR-411-5p靶向調控SPHK1的表達 通過targetscan數(shù)據(jù)庫預測到SPHK1與 miR-411-5p存在結合位點見圖4A。熒光素酶報告基因檢測實驗結果顯示，轉染野生型和突變型SPHK1基因表達載體WT-SPHK1和MUT-SPHK1后，相較于miR-con組，miR-411-5p組WT-SPHK1細胞SiHa的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而MUT-SPHK1細胞SiHa的熒光素酶活性差異不顯著。見表4。Western檢測結果顯示，相較于miR-con組SPHK1表達水平(0.68±0.08)，miR-411-5p組(0.19±0.36)顯著降低；相較于anti-miR-con組SPHK1表達水平(0.71±0.08)，anti-miR-411-5p 組(1.25±0.11)顯著升高(P<0.05)。見圖4B?？梢?，miR-411-5p可靶向調控SPHK1的表達。

1～4：miR-con組、miR-411-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-411-5p組圖4 miR-411-5p與SPHK1存在的互補核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5沉默SPHK1對宮頸癌SiHa細胞的存活和細胞凋亡的作用 與si-con組相比，si-SPHK1組宮頸癌SiHa細胞中SPHK1、Ki67、CyclinD1表達水平顯著降低，酶切caspase-3、酶切caspase-9表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低；細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)，見圖5、表5?？梢?，沉默SPHK1抑制宮頸癌SiHa細胞的存活，促進細胞凋亡。

2.6過表達SPHK1部分逆轉miR-411-5p對宮頸癌細胞存活和細胞凋亡的作用 與miR-con組相比，miR-411-5p 組宮頸癌細胞中SPHK1、Ki67、CyclinD1表達水平顯著降低，酶切caspase-3、酶切caspase-9表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低；細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與miR-411-5p +pcDNA組相比，miR-411-5p+pcDNA-SPHK1組宮頸癌細胞中SPHK1、Ki67、CyclinD1表達水平顯著升高，酶切caspase-3、酶切caspase-9表達水平顯著降低，細胞活性顯著升高；細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖6，表6。可見，過表達SPHK1部分逆轉miR-411-5p對宮頸癌細胞存活抑制和凋亡促進作用。

圖5 沉默SPHK1對宮頸癌SiHa細胞凋亡和各蛋白表達的影響

表5 沉默SPHK1抑制宮頸癌SiHa細胞存活和誘導凋亡的作用

1～4:miR-con組、miR-411-5p組、miR-411-5p+pcDNA組、miR-411-5p+pcDNASPHK1組圖6 過表達SPHK1對宮頸癌SiHa細胞凋亡和各蛋白表達的影響

表6 過表達SPHK1和轉染miR-411-5p表達對宮頸癌細胞存活和細胞凋亡的影響

3 討 論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制尚未完全清楚，闡明宮頸癌發(fā)病相關RNA分子機制，可為宮頸癌的診斷和治療提供新思路〔10〕。miRNA在細胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要調節(jié)功能〔11〕。研究顯示miR-411-5p通過靶向GRB2抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移〔12〕。miR-411通過靶向ZnT1抑制膀胱癌細胞的生長和轉移〔13〕。miR-411-5p通過靶向PUM1抑制非小細胞肺癌的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡〔14〕。本研究結果說明過表達miR-411-5p抑制宮頸癌細胞存活，促進細胞凋亡。CyclinD1是調控細胞周期G期的關鍵調控因子，其過量表達可使細胞增殖失調而促進癌變。Ki-67是細胞分裂增殖相關的蛋白抗原，是反映細胞增殖的指標〔15〕。caspase-9活化可以激活caspase-3，而caspase-9和caspase-3活化裂解為酶切caspase-3和酶切caspase-9，促進細胞凋亡〔16〕。進一步說明過表達miR-411-5p抑制宮頸癌細胞存活，促進細胞凋亡。SPHK1與腫瘤細胞的存活、侵襲、遷移密切相關。有研究報道抑制SPHK1能引起細胞G1期阻滯及降低細胞侵襲能力〔17〕；抑制SPHK1可抑制結腸癌細胞的增殖和侵襲并促進細胞的凋亡〔18〕。子宮內膜癌中SPHK1表達升高，其可能參與子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展〔19〕。本研究結果說明沉默SPHK1可抑制抑制宮頸癌細胞存活，促進細胞凋亡。與前人對SPHK1作用研究的結果相符。研究顯示miR-506可通過靶向SPHK1抑制肝癌血管生成〔20〕。本研究結果提示miR-411-5p可能通過調控SPHK1影響宮頸癌細胞增殖和凋亡。