楊松 康曉明 孟慶云 楊舒賀 陳衛(wèi)紅 韓宇鵬 梅梅 聶晶 楊麗微 周曉昭

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1兒內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154003;2消化一科；3佳木斯中心醫(yī)院兒科；4佳木斯大學(xué)研究生院)

各種慢性腎臟疾病(CKD)進行性發(fā)展的最終后果是腎臟纖維化(RIF)〔1〕。RIF的特征在于腎實質(zhì)細(xì)胞的損傷及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常沉積及上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)〔2〕。腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)是過度合成和ECM分解減少之間不平衡的結(jié)果，這可能是由于正常修復(fù)基質(zhì)失調(diào)，炎癥反應(yīng)不受控制和成肌纖維細(xì)胞增殖所致〔3〕。RIF也可被認(rèn)為是TIF，因為該過程具有腎小管破壞的特征。TIF會加速受損腎的變性，并干擾鄰近的健康腎小管，從而促進纖維化發(fā)展〔4〕。關(guān)于RIF進展的現(xiàn)有知識極其復(fù)雜，因此難以預(yù)防甚至消除。目前尚無有效的方法來預(yù)防RIF的發(fā)展。吡非尼酮〔5甲基1苯基2-(1H)吡啶酮〕是一種口服生物可利用的人工合成分子，為白色或淡黃色結(jié)晶性粉末，研究發(fā)現(xiàn)其對纖維化過程中的重要促纖維化因子及氧化-應(yīng)激通路、抗氧化通路均有一定的調(diào)節(jié)作用，能抑制成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，減少細(xì)胞和組織纖維化標(biāo)志物的產(chǎn)生〔5〕。吡非尼酮參與多種纖維化疾病的病理過程，在腫瘤、眼底及腸道纖維化、肺臟纖維化、RIF方面已表現(xiàn)出其臨床應(yīng)用的價值〔6～9〕。目前國內(nèi)外關(guān)于吡菲尼酮影響腎間質(zhì)纖維化組織中磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號通路之間關(guān)系的研究較少，本文探討吡菲尼酮與PI3K/Akt/mTOR信號通路的關(guān)系，探究吡菲尼酮在腎間質(zhì)纖維化進程中可能存在的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物分組 由佳木斯大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)，雄性Wistar大鼠90只，體重(150±10)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，按照隨機數(shù)字法分為假手術(shù)組、UUO組，實驗治療組各30只。

1.2動物模型 除假手術(shù)組外，其他各組無菌條件下行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)：術(shù)前器械消毒，大鼠稱重后用10%水合氯醛0.3～0.4 ml/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉，備皮，常規(guī)消毒，在大鼠背部，左側(cè)肋腰點下約0.5 cm、脊柱左側(cè)約1.0 cm做一縱向切口，1.5～2.0 cm長，逐層進腹，充分暴露腎臟，用小彎鑷輕輕分離出輸尿管，用“0”號絲線分別在緊靠腎盂處及遠離腎盂約1 cm處結(jié)扎輸尿管，在兩結(jié)中間剪斷輸尿管，用一代頭孢類藥物及生理鹽水沖洗腹腔后，逐層縫合腹膜腔各層及背部皮膚，覆蓋無菌紗布。假手術(shù)組除不結(jié)扎、不剪斷輸尿管外，其余所有處理同上。

1.3實驗方法 健康大鼠制成UUO模型，實驗治療組給予吡菲尼酮200 mg/(kg·d)灌胃，假手術(shù)組和UUO組給予等量生理鹽水灌胃，1次/d。各組分別在手術(shù)后第3，7，14天分別處死10只大鼠。留取左側(cè)梗阻腎標(biāo)本，梗阻腎沿矢狀面用手術(shù)剪小心剖開，腎組織在4%多聚甲醛中固定24 h，待做蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化等。

1.3.1HE染色 將石蠟包埋的腎組織制成4 μm厚切片，行HE染色觀察，低倍鏡下單盲依序觀察5個腎小管間質(zhì)視野，按腎間質(zhì)損傷8項指標(biāo)評分：腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腎小管擴張、腎小管萎縮、紅細(xì)胞管型、蛋白管型、間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)細(xì)胞浸潤，計算其均值，作為該標(biāo)本的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)。

1.3.2免疫組化 所有腎組織按常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋，切片4 μm。腎細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR蛋白表達部位染色呈棕黃色，每例切片隨機觀察10個連續(xù)不重疊的200倍視野，計算陽性染色面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)面積(除去腎小管管腔) 的比值，取平均值為每只大鼠的檢測值。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23．0統(tǒng)計軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組不同時間點TIF比較 鏡下觀察，假手術(shù)組不同時間點小管結(jié)構(gòu)無明顯異常，UUO組術(shù)后第3天HE染色結(jié)構(gòu)顯示腎小管輕度擴張，上皮細(xì)胞輕度水腫，間質(zhì)見少量炎性細(xì)胞浸潤；術(shù)后第7天可見管腔擴張明顯，且數(shù)量增多，部分?jǐn)U張管腔可見少許脫落的上皮細(xì)胞及蛋白管型，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤明顯；術(shù)后第14天可見腎臟皮髓質(zhì)層明顯萎縮，腎小管管腔嚴(yán)重變形(擴張、塌陷、萎縮)，上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落較重，大量炎性細(xì)胞浸潤。與UUO組對應(yīng)時間點相比，實驗治療組腎組織損傷程度明顯減輕(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 3組術(shù)后不同時間點TIF比較分,n=10)

2.2各組PI3K、Akt、mTOR蛋白表達 假手術(shù)組腎小管內(nèi)PI3K、Akt、mTOR表達較少；UUO組PI3K、Akt、mTOR表達較假手術(shù)組增加明顯，且隨梗阻時間的延長表達量明顯增加(P<0．05)；與UUO組相比，實驗治療組相應(yīng)時間PI3K、Akt、mTOR表達明顯減少，且顯著高于假手術(shù)組(P<0.05) 。見表2。

圖1 各組術(shù)后不同時間點腎組織變化(HE，×400)

表2 各組術(shù)后不同時間點PI3K、Akt、mTOR蛋白表達

3 討 論

PI3Ks是磷酸化磷脂酰肌醇，是真核細(xì)胞膜的組成部分之一〔10〕,在廣泛的細(xì)胞過程中起著重要作用，包括運動性和細(xì)胞周期進程，并與氧化應(yīng)激有關(guān)，高糖微環(huán)境導(dǎo)致活性氧過度產(chǎn)生，使PI3K和Akt 磷酸化比率增加，從而導(dǎo)致 EMT〔11〕。PIP3可與Akt的PH區(qū)結(jié)合，使Akt發(fā)生轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，促進其構(gòu)象改變。PI3K/Akt信號通路可通過調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶磷酸化水平來調(diào)節(jié)其DNA甲基化，也可調(diào)控組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的甲基化、磷酸化和乙?；?，從而調(diào)節(jié)組蛋白甲基化來調(diào)控其生物活性〔12〕。

Akt包含3個結(jié)構(gòu)域：根據(jù)絲氨酸/蘇氨酸殘基的差異，Akt分為3種同種型，PI3K激活A(yù)kt1上蘇氨酸激動磷酸化過程，隨后磷酸化在羧基末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，其由PI3K依賴性機制啟動，完全激活A(yù)kt〔13〕。mTOR是眾所周知的Akt磷酸化靶點，特異性結(jié)合具有GTP酶活化蛋白(GAP)活性的Rheb GTP酶，其直接激活mTORC1〔14〕。Meier等〔15〕通過實驗證實雷公藤內(nèi)酯可通過PI3K/Akt信號通路影響miR-188-5p和磷酸酶基因(PTEN)之間的相互作用改善腎間質(zhì)纖維化的EMT過程，改善預(yù)后。在正常細(xì)胞中，PI3K/Akt途徑是細(xì)胞代謝、增殖、分化和存活的中樞信號調(diào)節(jié)因子。該途徑在多種疾病中經(jīng)常失調(diào)，包括實體瘤、免疫介導(dǎo)的疾病和特發(fā)性肺纖維化，是一個有吸引力的治療纖維化疾病的靶標(biāo)〔16〕。該途徑被細(xì)胞表面受體激活，例如酪氨酸激酶受體，其激活PI3K的p110亞基。催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)轉(zhuǎn)化為PIP3激活A(yù)kt。Akt向幾種下游效應(yīng)子發(fā)出信號，包括mTOR、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Fox蛋白)和Bcl-2抗凋亡蛋白。雖然PI3K/Akt/mTOR途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程逐漸出現(xiàn)在研究者的視線中，但是蛋白激酶相互作用是復(fù)雜的反饋回路〔17，18〕。mTOR參與了大量其他細(xì)胞過程，包括代謝、炎癥、細(xì)胞凋亡和衰老。因此mTOR在調(diào)節(jié)許多疾病，包括纖維化和癌癥中發(fā)揮中心作用〔19，20〕。

PI3K/Akt/mTOR依賴性途徑是與多種細(xì)胞生理代謝存活高度相關(guān)的因子途徑〔21〕。該途徑在多種疾病中表現(xiàn)出活躍的調(diào)節(jié)功能，參與多種細(xì)胞反應(yīng)過程〔22〕。mTOR激酶通常被稱為該途徑的主要調(diào)節(jié)物。mTOR引起可干預(yù)基質(zhì)的異常沉積及細(xì)胞轉(zhuǎn)分化進程，mTOR抑制劑是有希望的纖維增生性疾病調(diào)節(jié)劑〔23〕，mTOR逐漸成為纖維化性疾病的研究新熱點。mTORC1作為對于雷帕霉素高度敏感的靶蛋白，控制著細(xì)胞生長和代謝〔24〕。Akt活化抑制結(jié)節(jié)性硬化綜合征基因(TSC)1和TSC2，其通過富集在組織中的GTP結(jié)合蛋白Ras同源物(Rheb)間接激活mTOR激酶活性〔25〕。由于mTOR的作用由上游PI3K/Akt信號調(diào)控，在各種生理及病理性疾病過程發(fā)揮作用。PI3K依賴性通路激活通過mTORC1依賴性4E-BP1/真核翻譯起始因子(EIF)4E信號傳導(dǎo)導(dǎo)致膠原蛋白Ⅰ表達增加，發(fā)揮調(diào)節(jié)纖維化的作用。并且mTORC1主要在壓力環(huán)境中調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和自噬，這會改變成纖維細(xì)胞的增殖和活力。由于Ⅰ型膠原細(xì)胞相互作用在肺纖維化的進展中起關(guān)鍵作用，因此異常的mTORC1調(diào)節(jié)在許多慢性纖維增生性疾病中至關(guān)重要〔26〕。

吡非尼酮已被證明可減輕RIF，但是其具體的作用機制仍需要進一步探究。吡非尼酮治療5 w導(dǎo)致菊粉清除率的顯著改善，而未治療的對照組腎功能沒有任何恢復(fù)。染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡非尼酮治療5 w后的腎臟組織學(xué)也顯示出纖維化病變的明顯減弱〔27〕。Rad等〔28〕在局部節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)的單獨模型中，吡非尼酮在給藥3個月后腎小球硬化程度明顯減輕。mTOR似乎在增加各種類型成纖維細(xì)胞的增殖中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)mTOR促進了瘢痕成纖維細(xì)胞(KF)的增殖。由于PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)是ATP誘導(dǎo)的外膜成纖維細(xì)胞增殖所必需的，證明mTOR對調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖至關(guān)重要。由于轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β的作用是纖維化過程的核心并與mTORC1和mTORC2都有關(guān)，因此合理的治療可能需要考慮mTOR和TGF-β的雙重抑制。mTOR抑制可改變病理性成纖維細(xì)胞中的PI3K信號傳導(dǎo)，而TGF-β受抑制可使Akt活化和EMT最小化，因此減少肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化〔29〕。

綜上，吡菲尼酮對終末期腎臟功能的調(diào)節(jié)作用，是通過影響PI3K/Akt/mTOR 信號通路表達實現(xiàn)的。