胡又丹 靳健美 陳麗融 劉常燕

四川省達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(635000)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，全球每年約有50萬名婦女被診斷出宮頸癌，死亡率在50%以上[1]。高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)的HPV病毒種類高達(dá)100多種，其中在宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)有30種[3]。P16是一種抑癌基因[4]。有研究表明，P16蛋白表達(dá)與子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)及宮頸癌的發(fā)生關(guān)系密切，檢測P16水平可用于宮頸疾病的診斷及治療預(yù)后[5]。本研究通過對不同HPV分型宮頸病變患者p16表達(dá)分析，探討其及與HR-HPV感染關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集本院2017年6月-2019年6月收治的宮頸疾病患者104例臨床資料，年齡(38.7±17.3)歲(19～73歲)，其中HR-HPV陽性高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變(HSIL)60例(CINⅡ級36例、CINⅢ級24例)，HR-HPV陽性宮頸炎15例，HR-HPV陰性宮頸炎15例，HR-HPV陽性宮頸癌(CC)14例。收集患者宮頸活檢病理組織檢測HPV感染情況及P16蛋白表達(dá)水平。納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診宮頸疾病；②患者及家屬知曉本研究內(nèi)容并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者有放化療史；②既往接受過激素治療；③資料不全。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批。

1.2 試劑

HPV分型檢測試劑盒及宮頸脫落細(xì)胞保存液購自廣東凱普生物科技股份有限公司，P16蛋白免疫組化試劑盒購自invitrgen公司。

1.3 檢測方法

1.3.1樣本收集宮頸刷收集患者子宮頸脫落細(xì)胞，保存于細(xì)胞保存液；收集患者陰道鏡檢查中獲取的宮頸活檢組織，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片4μm。

1.3.2 HPV分型按照試劑盒說明書進(jìn)行HPV基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及核酸分子雜交檢測等操作，對收集的患者宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行分型檢測，其中低危型有5種亞型：6、11、42、43、44；高危型有13種：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68；亞洲亞型3種：53、66、cp8304。

1.3.3 P16蛋白表達(dá)將制備好的切片烤片后順序漂洗脫蠟至水，于磷酸緩沖液(PBS)漂洗3次，加入H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再PBS緩漂洗3次，滴加特異性一抗，37℃孵育2h， PBS漂洗3次，于EnVision復(fù)合物孵育30min， PBS漂洗3次，水洗、復(fù)染、封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.4判讀標(biāo)準(zhǔn)HPV分型檢測：以肉眼觀察，通過芯片上HPV分型分布特異性點的陽性反應(yīng)來判斷HPV亞型，藍(lán)色圓點為陽性位點，多位藍(lán)紫色圓點則為混合感染。每張芯片設(shè)置PCR反應(yīng)質(zhì)控點和雜交顯色質(zhì)控點。P16蛋白表達(dá)：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性(-)，5%～24%為弱陽性(+)，25%～50%之間為陽性(++)，>50%為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)數(shù)據(jù)用(%)表示，組間比較行χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同HR-HPV病理分型與P16表達(dá)關(guān)系

13種高危型HPV分型中，p16蛋白表達(dá)陽性率均≥50%，其中陽性率≥80%有7種，p16蛋白表達(dá)總陽性率為84.3%。見表1。

表1 不同HR-HPV分型P16表達(dá)分布情況(例)

2.2 P16表達(dá)水平與HPV感染

P16蛋白表達(dá)(-)28例，感染20例(71.4%)；(+)18例，感染16例(88.9%)；(++)25例，感染23例(92.0%)；(+++)33例，感染32例(97.0%)。P16蛋白表達(dá)水平越高HPV感染率越高(χ2=9.813，P=0.02)。

2.3 不同宮頸病變者P16表達(dá)

免疫組化分析，不同宮頸病變者p16蛋白表達(dá)陽性率存在差異，且CIN病變患者中CINⅢ級患者p16陽性率高于CINⅡ級患者(均P<0.05)。見表2。

表2 不同宮頸病變者p16蛋白表達(dá)比較[例(%)]

3 討論

HPV感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因， 90%的宮頸癌患者伴有HR-HPV感染。宮頸癌的發(fā)生與HPV感染有明確相關(guān)性，HPV持續(xù)感染會導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變并逐漸發(fā)展為浸潤性宮頸癌[6]。宮頸疾病從CINⅠ～CINⅢ是一個連續(xù)漸進(jìn)過程，一般從輕度病變發(fā)展為宮頸癌大約需要10年的時間[7]。因此早期宮頸疾病檢查和治療十分重要。

HPV感染的一般癥狀為尋常疣、生殖器疣等[8]。目前已分離出的HPV有130多種，不同型別HPV引起的臨床表現(xiàn)各不相同。HPV抵抗力較強(qiáng)，傳播途徑一般為直接或間接接觸、母嬰傳播、性傳播[9]。P16基因表達(dá)蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞分裂周期中起重要作用[10]。是CDK4的抑制因子，參與細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)，p16通過與Cyclin D競爭性結(jié)合CDK4級CDK6，對Cyclin D活性起到抑制作用，使其底物高度去磷酸化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子E2F持續(xù)抑制，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制細(xì)胞增殖[11]。已有研究表明，HPV感染會導(dǎo)致E7蛋白高表達(dá)，從而抑制Rb與E2F結(jié)合，導(dǎo)致Rb失活，促使p16過表達(dá)，并破壞p16-Rb反饋系統(tǒng)，使p16失去正常功能，引起細(xì)胞增殖腫瘤發(fā)生，宮頸組織中p16蛋白的高表達(dá)水平可間接提示HR-HPV感染[12]。在以往研究中，p16蛋白常被作為判斷宮頸細(xì)胞發(fā)育的生物標(biāo)志物[13]；最近有研究提出宮頸組織中p16蛋白表達(dá)量增加與宮頸上皮內(nèi)瘤變程度呈正相關(guān)[14]。

本研究檢測結(jié)果顯示，感染13種高危型HPV分型患者的p16蛋白表達(dá)陽性率均在50%以上，其中有7種分型陽性率在80%以上，p16蛋白表達(dá)總陽性率為84.3%。表明在感染高危型HPV患者中，p16蛋白表達(dá)水平均較高；且P16蛋白表達(dá)水平越高HPV感染率越高，表明p16蛋白表達(dá)水平與高危型HPV感染有關(guān)。對不同宮頸病變程度患者p16蛋白表達(dá)水平檢測發(fā)現(xiàn)存在差異，病變程度越高p16蛋白表達(dá)陽性率越高，CINⅢ級患者p16陽性率高于CINⅡ級患者。提示，檢測p16蛋白表達(dá)水平對宮頸疾病程度及高危型HPV感染程度判斷均有一定參考價值，可能作為HR-HPV患者預(yù)后的參考指標(biāo)。

綜上所述，宮頸病變患者p16表達(dá)水平與宮頸病變程度及高危HPV感染有關(guān)，p16表達(dá)水平越高HPV感染率越高，宮頸病變程度越高p16表達(dá)陽性率越高。提示臨床，檢測p16表達(dá)可能有助于宮頸疾病的診斷。