隆建萍 閆有圣 楊 濤 馬秀芬 毛紅巖 張慶華 獨(dú)曉燕 高華方*

1.甘肅省婦幼保健院(蘭州，730050)；2.國(guó)家衛(wèi)健委科學(xué)技術(shù)研究所

乳腺癌的發(fā)病率及死亡率在女性惡性腫瘤中均位居第一位[1-2]。三陰性乳腺癌(TNBC)是指缺乏雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人類表皮生長(zhǎng)因子-2(HER-2)表達(dá)的乳腺癌[3]，相對(duì)于其他分子分型乳腺癌其預(yù)后較差，且更早發(fā)生局部復(fù)發(fā)或者遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移[4-5]。BRCA1/2是最早發(fā)現(xiàn)的遺傳性乳腺癌易感基因[6-8]，在三陰性乳腺癌患者中BRCA1/2基因突變攜帶者率顯著增高[9]。目前研究表明，除了BRCA1/2以外，已發(fā)現(xiàn)了十余種與乳腺癌相關(guān)的易感基因[10-12]。然而，即使對(duì)所有已知的乳腺癌相關(guān)基因進(jìn)行綜合分析，也只能在20%～30%具有明顯遺傳性癌癥綜合征臨床特征的女性中找到明確的致病基因突變[13-14]。本研究應(yīng)用二代測(cè)序的方法對(duì)于32例TNBC患者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，通過全外顯子組分析完善中國(guó)人群中乳腺癌易感基因的突變譜，為乳腺癌的預(yù)防、相關(guān)遺傳咨詢及高危健康人群篩查提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

收集2018年1月-2019年12月在甘肅省婦幼保健院乳腺科確診的乳腺侵入性導(dǎo)管癌患者50例，其中三陰性32例為研究對(duì)象，均為女性。病例入組標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后石蠟病理證實(shí)為浸潤(rùn)性乳腺癌；免疫組化證實(shí)ER<1%，PR<1%，HER-20～1+或者熒光原位雜交(FISH)證實(shí)為陰性；病歷資料完整且有預(yù)后隨訪信息。所有入組患者均采集外周血5ml，EDTA抗凝，至于-80℃保存?zhèn)溆谩１狙芯揩@得甘肅省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，臨床資料收集和標(biāo)本采集均獲得患者知情同意。

1.2 全外顯子組測(cè)序分析

1.2.1基因組DNA提取采用外周血基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit )提取患者外周血基因組DNA，利用核酸分析儀Qubit 2.0(Invitrogen)進(jìn)行核酸定量，提取的基因組DNA在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2全外顯子組捕獲測(cè)序基因組DNA經(jīng)Covaris超聲破碎儀隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度為180-280bp的片段，采用Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒進(jìn)行建庫和外顯子組捕獲。全外顯子組建庫樣本在Novaseq6000測(cè)序儀(Illumina, San Diego, USA)上進(jìn)行雙端150bp測(cè)序分析。

1.2.3生物信息學(xué)分析測(cè)序片段通過BWA軟件(V 0.7.9a)與參考基因組(GRCh37/hg19)進(jìn)行比對(duì)[15]。采用Picard V.2.22.9(http://broadinstitute.github.io/picard/)軟件去除PCR重復(fù)序列，然后進(jìn)行下游的數(shù)據(jù)分析。變異檢測(cè)采用 GATK(v3.2)軟件進(jìn)行，包括采用堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)校正、InDels位置和質(zhì)量分?jǐn)?shù)校正、SNVs和InDels變異發(fā)現(xiàn)和分型[16]。變異采用變異功能預(yù)測(cè)軟件VEP(Ensembl 73)進(jìn)行變異注釋[17]。

1.2.4全外顯子基因變異篩選采用以下流程進(jìn)行變異篩選：①通過千人基因組數(shù)據(jù)庫、gnomAD、dbSNP數(shù)據(jù)庫篩選東亞人群中頻率<1%，并且本地正常人群數(shù)據(jù)庫中變異頻率<5%的稀有變異。其中功能性的編碼區(qū)和剪接位點(diǎn)的變異將進(jìn)入下一步分析，主要包括功能缺失型變異(獲得終止密碼子的變異，移碼變異和關(guān)鍵剪接位點(diǎn)變異)、錯(cuò)義變異、非移碼的缺失/插入。②采用ClinVar, HGMD和BRCA Exchange數(shù)據(jù)庫剔除已知的良性和可疑良性的變異。③通過HPO數(shù)據(jù)庫、Phenolyzer數(shù)據(jù)庫等篩選與乳腺腫瘤相關(guān)的基因變異。篩選獲得的意義不明的編碼區(qū)錯(cuò)義變異采用變異功能預(yù)測(cè)軟件：SIFT和PolyPhen-2軟件進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》對(duì)每個(gè)變異進(jìn)行分類。參照國(guó)際基因變異命題體制(http://www.hgvs.org/mutnomen)進(jìn)行變異的命名。

1.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

對(duì)生物信息學(xué)分析獲得的候選致病基因突變位點(diǎn)，在其周圍設(shè)計(jì)上下游擴(kuò)增引物，PCR反應(yīng)后獲得目標(biāo)區(qū)域產(chǎn)物，采用BigDye3.1(ABI)測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀法純化后在ABI3500測(cè)序儀上進(jìn)行序列分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用t檢驗(yàn)分析乳腺癌患者臨床病理數(shù)據(jù)與基因突變的相關(guān)性，F(xiàn)isher確切檢驗(yàn)比較易感基因突變與遺傳性乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)乳腺癌患者臨床特征之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者臨床特征分析

本研究納入32例乳腺癌患者，均經(jīng)病理確診為TNBC，確診年齡(50.3±12.1)歲，其中早發(fā)型(年齡≤45歲)13例。所有患者均無腫瘤家族史。

2.2 BRCA1/2基因突變分析

32例中14例檢測(cè)到BRCA1/2罕見變異，其中致病性(P)或可疑致病性(LP)變異6例，突變攜帶頻率為18.8%；意義未明性變異8例，突變攜帶頻率為25.0%，(表1)。BRCA1基因變異患者8例，BRCA2基因突變患者6例；突變類型中錯(cuò)義突變8例，為主要的突變類型。14例BRCA基因變異患者平均年齡為44.1±14.2歲，與非BRCA基因變異者(55.2±7.5)相比確診年齡存在顯著性差異(t=-2.859，P<0.01)。

6例BRCA1/2基因P/LP變異的患者中，gsfy_019和gsfy_041檢測(cè)到了BRCA1變異c.5468-1_5474del；gsfy_004和gsfy_034檢測(cè)到了c.4749_4750del；在gsfy_020患者中檢測(cè)到BRCA2已知致病變異c.51_52del，查閱dbBRCA Chinese V2.0數(shù)據(jù)庫[18]，在中國(guó)人中未見報(bào)道。

8例BRCA1/2基因變異根據(jù)ACMG指南分類為意義未明變異(VUS)，其中BRCA2基因變異c.6027A>C在數(shù)據(jù)庫已知變異中未查詢到，屬于新突變；3個(gè)變異BRCA2：c.3794G>T、c.7901T>A，BRCA1：c.4616T>C首次在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)。gsfy_044患者檢測(cè)到BRCA1基因變異NM_007294.3：c.5511G>C，p.(Trp1837Cys)，該變異在clinvar數(shù)據(jù)庫的致病性分類結(jié)果存在沖突(LP/P/VUS)；gsfy_035患者檢測(cè)到BRCA2基因變異NM_000059.3:c.7901T>A，p.(Met2634Lys)，致病性分類結(jié)果為VUS。

6例BRCA1/2已知致病性基因突變中5例為早發(fā)型乳腺癌，8例攜帶BRCA1/2基因意義未明變異中4例年齡<45歲，18例未攜帶BRCA1/2基因變異中4例為早發(fā)型，早發(fā)患者中BRCA1/2基因突變率顯著高于晚發(fā)的患者(Fisher=7.072，P=0.023)。

表1 32例TNBC患者BRCA1/2基因突變

2.3 其他乳腺癌易感基因突變分析

通過全外顯子組分析32個(gè)病例中檢測(cè)到83個(gè)乳腺腫瘤易感基因變異，每個(gè)患者約攜帶2.6個(gè)變異，其中2個(gè)以上患者攜帶的乳腺癌易感基因包括ALK、APC、CDH1、PTCH2、RB1CC1、RAD51D 、RAD54L、TSC1等。根據(jù)ACMG指南，9個(gè)變異為致病性和可疑致病性變異(表2)，74個(gè)變異為意義未明變異，致病和可疑致病突變檢出率為28.1%(9/32)。

83個(gè)變異涉及62個(gè)已知與乳腺腫瘤相關(guān)的易感基因，涉及到DNA同源重組修復(fù)的基因包括ATM、BARD1、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51D、RAD54L。其中RAD54L基因可疑致病變異NM_001142548.1:c.1093_1169+15dup，患者gsfy_031和gsfy_045被檢測(cè)到；gsfy_022檢測(cè)到了RAD51D基因NM_001142571.1:c.184C>T致病變異。4例患者同時(shí)檢測(cè)到STAT5A基因變異c.1226C>T，突變頻率為為0.0625(4/64)，gnomAD數(shù)據(jù)庫東亞人群頻率為0.002827，SIFT預(yù)測(cè)結(jié)果為有害[deleterious(0.01)]，PolyPhen預(yù)測(cè)結(jié)果[probably_damaging(0.964)]，依據(jù)ACMG指南分類為意義不明變異。

表2 32例TNBC患者非BRCA1/2基因突變分析結(jié)果(致病和可疑致病變異)

3 討論

BRCA1/2是TNBC患者中最常見的易感基因突變，在TNBC病例中，BRCA1/2致病性胚系突變的檢出率約為乳腺癌總體突變率的2倍[9，19]。在本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析32個(gè)TNBC患者全外顯子組，探討乳腺癌患者乳腺癌易感基因突變的分布情況。32例患者BRCA1/2致病性突變攜帶頻率為18.8%，高于既往文獻(xiàn)報(bào)道[9]。

有研究顯示在早發(fā)性乳腺癌患者中(年齡≤40歲)BRCA1/2基因突變頻率更高，一項(xiàng)遺傳咨詢隊(duì)列的研究顯示，在146例早發(fā)性TNBC患者中檢測(cè)到64例患者攜帶有BRCA1/2基因突變，突變率達(dá)到了43.8%[20]。本研究中6例BRCA已知致病性基因突變中5例為早發(fā)型乳腺癌，8例攜帶BRCA1/2基因意義未明變異患者中4例年齡<45歲，而在其他18例未攜帶BRCA基因變異的患者中只有4例為早發(fā)型。進(jìn)一步證實(shí)了BRCA1/2基因突變與早發(fā)型TNBC相關(guān)。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南也推薦在TNBC患者常規(guī)進(jìn)行BRCA基因突變篩查[21-22]。

在檢測(cè)到14個(gè)BRCA1/2基因突變中，BRCA1:c.5468-1_5474del突變?cè)?例患者中檢測(cè)到，該突變是中國(guó)人群中最常見的突變，提示可能存在建立者效應(yīng)[23-24]。BRCA1:c.4749_4750del突變也在2個(gè)患者中被檢測(cè)到，查閱了dbBRCA Chinese V2.0該突變?cè)谥袊?guó)人群中只有2例報(bào)道，這個(gè)變異是否屬于西北地區(qū)熱點(diǎn)突變需要進(jìn)一步研究去驗(yàn)證。 本研究在BRCA2基因檢測(cè)到一個(gè)新變異c.6027A>C，該變異在gnomAD數(shù)據(jù)庫中沒有頻率，在ClinVar, HGMD和BRCA Exchange數(shù)據(jù)庫中均未查詢到，致病性分類為意義未明變異，對(duì)于其致病性需要通過更大樣本量的研究去驗(yàn)證。8例患者檢測(cè)到BRCA1/2基因變異為錯(cuò)義變異，依據(jù)ACMG-指南分類為意義未明變異，這些變異是否致病或者良性仍然需要大量的數(shù)據(jù)去驗(yàn)證，可以作為臨床分析的參考。

患者gsfy_044檢測(cè)到BRCA1基因變異NM_007294.3：c.5511G>C(p.(Trp1837Cys))，該變異在BRCA1基因cDNA水平5511位鳥嘌呤被胞嘧啶替換，導(dǎo)致蛋白序列第1837位色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?。功能研究顯示，與野生型相比，這種突變體導(dǎo)致BRCA1蛋白結(jié)合活性、特異性、轉(zhuǎn)錄因子活性均受損，并導(dǎo)致嚴(yán)重的蛋白折疊缺陷[25]。Trp1837Cys位于物種間保守區(qū)域BRCT2，該區(qū)域已知與多個(gè)蛋白發(fā)生相互作用[26]。生物信息學(xué)分析顯示該突變可能會(huì)破壞蛋白的結(jié)構(gòu)和功能(SFT：deleterious(0.02)；PolyPhen：probably_damaging(0.999))。盡管以上的證據(jù)顯示BRCA1：c.5511G>C有致病的可能性，但是目前的證據(jù)還不足以將其確定為致病致病性變異，所以仍然將該變異列為意義不明變異。

患者gsfy_035 檢測(cè)到BRCA2基因變異NM_000059.3:c.7901T>A，p.(Met2634Lys)，該變異在BRCA2基因cDNA水平7901胸腺嘧啶替換為腺嘌呤，導(dǎo)致263位蛋氨酸被賴氨酸替換。生物信息預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能受損(SFT：deleterious(0.02)；PolyPhen：probably_damaging(0.999))在gnomAD數(shù)據(jù)庫中8842例檢測(cè)個(gè)體發(fā)現(xiàn)1例攜帶該變異。BRCA Exchange 數(shù)據(jù)庫將該變異分類為意義未明變異。

除BRCA1/2基因突變外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)與腫瘤相關(guān)的基因可能導(dǎo)致遺傳性/家族性乳腺癌的發(fā)生，包括ATM、BRIPI、CHEK2、NBN、PALB2、RAD51C和RAD51D，但是現(xiàn)有的研究顯示只有BRCA1、BRCA2、PALB2和FANCM與TNBC有密切的相關(guān)性[12]。本研究對(duì)于32個(gè)TNBC進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序，分析與腫瘤相關(guān)的基因突變，發(fā)現(xiàn)了83個(gè)乳腺腫瘤易感基因變異，其中9個(gè)變異為致病性和可疑致病性變異，檢出率為28.1%。Couch等[15]采用靶向測(cè)序方法在TNBC患者中分析除了BRCA1/2的15個(gè)腫瘤易感基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TNBC患者中只能檢測(cè)到3.7%的致病性變異。本研究中采用的全外顯子測(cè)序技術(shù)，致病性變異檢出率遠(yuǎn)高于靶向測(cè)序分析，主要是全外顯子測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)更多的腫瘤易感基因。

本研中檢測(cè)到的83個(gè)變異涉及62個(gè)已知與乳腺腫瘤相關(guān)的易感基因，主要涉及到DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因，如ATM、BARD1、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51D、RAD54L。 但是本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)易感基因的熱點(diǎn)突變，大部分突變均為新發(fā)現(xiàn)的變異，致病性尚不明確，所以對(duì)于TNBC易感基因的研究仍然需要大量的研究去發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。

在32例TNBC患者中有4例檢測(cè)到STAT5A基因變異c.1226C>T(rs143067673)，突變頻率為0.0625(4/64)，遠(yuǎn)高于gnomAD數(shù)據(jù)庫東亞人群頻率0.002827(58/251320)。STAT5A基因編碼的蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)錄因子STAT家族的成員[27]。在對(duì)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的反應(yīng)中，STAT家族成員被受體相關(guān)激酶磷酸化，然后形成同源或異質(zhì)二聚體，并移位到細(xì)胞核中作為轉(zhuǎn)錄激活因子[28]。該蛋白被激活，并介導(dǎo)許多細(xì)胞配體的反應(yīng)，如白介素2(IL2)、白介素3(IL3)、 白介素7(IL7)、 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、生長(zhǎng)激素[29]。該蛋白在骨髓瘤和淋巴瘤中與TEL/JAK2基因融合相關(guān)的激活不依賴于細(xì)胞刺激，已被證明是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵[30-31]。NPM1/ALK可誘導(dǎo)STAT5A基因表觀遺傳沉默，STAT5A蛋白可通過抑制NPM1/ALK表達(dá)而起到抑癌作用[32]。ATAT5A可能與TNBC的表型具有一定的相關(guān)性，該結(jié)果需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示，BRCA1/2是TNBC患者最重要的易感基因，其他與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因突變可能與TNBC患者的表型有一定的相關(guān)性，這些初步的研究結(jié)果將對(duì)患者的治療也預(yù)后評(píng)估產(chǎn)生一定的積極作用。