鄧佩佩 馬 婧 張展羽 張文昊 宋瀟瀟 劉 杰 張香改 韓瑞鈺

河北省計劃生育科學技術研究院，國家衛(wèi)健委計劃生育與優(yōu)生重點實驗室(石家莊，050071)

有研究顯示近15%的不育男性為無精子癥患者，包括梗阻性無精子癥和非梗阻性無精子癥[1-2]。據(jù)估計，至少50%的無精子癥是由遺傳缺陷引起的，包括染色體數(shù)目畸變、囊性纖維化跨膜轉導因子(CFTR)基因突變和Yq11染色體上的無精子因子(AZF)區(qū)域的微缺失。但是仍有很大一部分無精子癥患者未找到明確致病原因。男性不育是一個復雜的病理變化，涉及很多基因，目前已知的人類睪丸富集基因有2300個[3]，這些基因中任何一種的基因的變異都會影響到男性生育，且這些突變在人群中都將始終保持非常低的頻率。隨著測序技術的發(fā)展，對大量基因進行篩選已成為可能，目前已有研究利用全外顯子測序篩選新的變異基因[4-5]。本文針對無精子癥患者進行全外顯子測序，目的是篩選精子發(fā)生障礙相關基因，豐富男性不育基因庫。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取20例在本中心就診的男性無精子癥患者，排除標準： 由化療或放療、創(chuàng)傷性或感染性睪丸炎、精索靜脈曲張、雙側隱睪等原因導致的無精子癥; 由勃起功能障礙/性欲喪失/無性高潮、逆行射精/無射精、先天性輸精管缺失、輸精管切除術、外傷或感染引起的機械性梗阻等原因導致的；染色體及AZF結果異常；梗阻性無精子癥。

1.2 激素檢測

空腹8～12h，抽取清晨靜脈血置促凝管，室溫靜置1h后離心取血清備用。采用化學發(fā)光免疫分析方法測定血清促卵泡生成素(FSH) 、促黃體生成素(LH) 、睪酮(T) 、雌二醇(E2) 、泌乳素(PRL)。

1.3 全外顯子測序及位點驗證

提取研究對象外周血DNA，經片段化、連接接頭、擴增純化后，使用雜交捕獲方法構建DNA文庫，采用高通量測序技術檢測人類全外顯子組中20099個基因的外顯子區(qū)及旁側內含子區(qū)(20bp)，將測序數(shù)據(jù)與人類基因組hg19參考序列進行比對，并對目標區(qū)域的覆蓋度及測序質量進行評估。對變異位點進行篩選，篩選與精子生成障礙相關的基因，運用PolyPhen2、SIFT、Mutation_Taster軟件預測蛋白功能。根據(jù)ACMG指南對變異位點進行評估。篩選出來的變異位點，通過PCR技術擴增相關基因外顯子及旁側內含子區(qū)域，進行Sanger測序驗證。

2 結果

2.1 一般資料

20例無精子癥患者，年齡25～45歲，經染色體核型分析和Y染色體微缺失檢測(AZF)未發(fā)現(xiàn)異常，激素檢測結果除1例(13號)患者外，其余均激素水平異常。詳細信息見表1。

表1 20例無精子癥患者相關信息

2.2 基因變異位點篩選

通過篩選共計選出26個基因43個變異位點，排除15個常染色體隱性遺傳的單個變異位點及13個與精子運動相關的變異位點，剩余11個基因的15個變異位點可能與精子發(fā)生障礙相關。對這15個變異位點均進行Sanger測序驗證，其中包括FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP等5個基因在睪丸組織高表達，SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6個基因可能與精子發(fā)生障礙相關，見表2及圖1(封三)。

表2 11個基因變異位點信息

3 討論

男性不育發(fā)病較復雜，涉及基因很多，與其他單基因疾病不同，該疾病發(fā)病基因突變均較罕見，需要大量標本大量基因篩選候選基因。目前隨著測序技術的發(fā)展，檢測費用的降低，已有很多基因被證明可能與男性不育相關，本文對20例無精子癥患者進行全外顯子測序篩選，檢測到可能會影響男性精子生成或發(fā)生障礙的26個基因43個位點變異。排除其中15個常染色體隱性遺傳的單個變異位點；13個與精子運動相關的變異位點(對象為無精癥患者)， 剩余15個變異位點可能與精子發(fā)生障礙相關。15個變異位點涉及11個基因，其中包括5個基因(8個變異位點)數(shù)據(jù)庫中顯示在睪丸組織中高表達，6個基因(7個變異位點)可能與精子生成障礙相關。

FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP這5個基因數(shù)據(jù)庫信息顯示其在睪丸組織表達較高。

FAM71B基因編碼的蛋白可能參與RNA生物反應，該基因在睪丸中表達較高，在其他組織中表達均很低，但其具體作用未查到相關報道研究。本研究中12號患者該基因發(fā)現(xiàn)2個變異位點c.1339C>T，c.197G>A，生物信息學軟件PolyPhen2、SIFT、Mutation_Taster預測有害，但Mutation_Taster對c.197G>A預測為良性，2個變異位點在人群中的頻率均較低，但是這2個位點變異未見報道，因此其臨床意義未明。

STARD9基因編碼有絲分裂過程中的紡錘體極組裝所需的微管依賴性的馬達蛋白，影響紡錘體極組裝，該基因在睪丸中表達較高但不是特異性表達，但是目前研究認為該基因是癌癥治療的重要的靶點[6-7]。本研究在11號患者中發(fā)現(xiàn)該基因2個變異c.1346A>C和c.12764G>A，在人群中頻率較低，也未見相關報道，其在無精子癥中的作用有待進一步研究。

CLTCL1基因編碼小網(wǎng)格蛋白重鏈(CHC22)在肌肉-骨骼中表達最高，其次是睪丸。Vassilopoulos等[8]發(fā)現(xiàn)CHC22在人類肌肉和脂肪細胞中形成胰島素反應性GLUT4區(qū)隔的過程中發(fā)揮了作用,認為chc22依賴的膜轉運在人類肌肉和脂肪中構成了一種物種限制的通路，對2型糖尿病具有潛在的影響。Nahorski等[9]研究認為CLTCL1在神經嵴發(fā)育以及痛覺和觸覺感覺神經元的形成過程中起著重要的作用。對于該基因對精子生成的影響尚未見報道。在本研究中發(fā)現(xiàn)17號患者該基因發(fā)生c.3545G>A、c.1331G>A雜合變異，在正常人群中頻率較低。生物信息學軟件PolyPhen2、 SIFT、 Mutation_Taster預測有害，但PolyPhen2對c.3545G>A預測為良性。因此，CLTCL1基因對男性不育的影響有待進一步驗證研究。

PCBP3基因編碼的蛋白是KH結構域蛋白亞家族成員，在轉錄后活性中起重要作用，在睪丸中表達較高。15號患者中檢出的c.1079+2T>C雜合變異未見報道，在正常人群中未檢出，臨床意義未明，目前對該基因研究報道較少。

S100PBP編碼的功能目前尚不清楚，其是通過與S100鈣結合蛋白P的相互作用而鑒定出來的蛋白質，在睪丸中表達豐度很高。16號患者發(fā)現(xiàn)c.1221_1222delCA雜合變異，在正常人群中未找到，臨床意義未明。

SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6個基因的變異可能與精子生成障礙相關。

SYCE3基因屬于聯(lián)會復合體中心元件蛋白，可能作為重要元件啟動同源染色體形成聯(lián)會復合體的過程，該基因可能與細胞分裂、同源染色體重組、精子生成等密切相關，在睪丸中表達很高，在其他組織中表達很低。 Schramm等[10]克隆了小鼠Syce3， RT-PCR分析12個小鼠組織，僅在睪丸和胚胎卵巢中檢測到Syce3。本研究發(fā)現(xiàn)1號患者c.181_184delCGGC純合變異，在正常人群中未檢出，該變異會導致氨基酸編碼異常，終止密碼子丟失，蛋白多肽鏈翻譯延長，對蛋白功能影響未知。但是該變異未有臨床報道，Schramm等[10]發(fā)現(xiàn)敲除小鼠SYCE3基因可導致小鼠不育。因此SYCE3基因很可能會影響男性的生育能力，導致不育，由于患者不愿意繼續(xù)檢測，其臨床意義未確定，有待進一步研究。

EFCAB6該基因編碼是一種直接結合癌基因DJ-1和雄激素受體的蛋白，在細胞中形成三元復合體。這種結合蛋白招募組織去乙?；笍秃衔铮砸种菩奂に厥荏w的轉錄活性，也可能在精子形成和受精過程中發(fā)揮作用，在睪丸中特異表達很高，其他組織中表達較低。9號患者發(fā)現(xiàn)c.1576C>T、c.677C>A兩個雜合變異，在正常人群中頻率較低。臨床意義未明，目前對該基因研究報道很少。

DDX4基因編碼的蛋白是一種推測的RNA解旋酶，它們參與了許多涉及RNA二級結構改變的細胞過程，如翻譯起始、核和線粒體剪接、核糖體和剪接體組裝。該基因在生殖細胞譜系中具有特異性表達，在生殖細胞發(fā)育過程中起著重要作用。 Chu等[11]采用蛋白質組學、細胞學和功能分析相結合的方法對秀麗隱桿線蟲進行分析研究尋找生殖相關蛋白，在與線蟲蛋白相對應的小鼠基因敲除中，37%導致雄性不育，其中就包括了DDX4基因。本研究中13號患者發(fā)現(xiàn)在該基因存在c.204_205delAG的缺失突變，在正常人群中未見收錄。該變異導致氨基酸框移突變，導致蛋白合成提前終止，因此其對男性不育的影響有待進一步研究。

KDM5D基因編碼的蛋白是賴氨酸特異性去甲基化酶5D。該蛋白是一種組蛋白去甲基化酶，可以特異性的使組蛋白H3的“Lys-4”去甲極化，可能與精子發(fā)生有關，但是未見相關報道研究。15號患者發(fā)生c.3035G>C的半合子突變，在正常人群中未見收錄，臨床意義未明。

RGS22基因編碼的蛋白是G蛋白信號調節(jié)因子22，可通過增加G蛋白α亞基的GTP酶活性抑制信號轉導。 Hu等[12]研究顯示無精子癥患者睪丸中RGS22表達明顯降低，RGS22在梗阻性無精子癥中表達正常。患者16號檢測到c.2966_2967delTA雜合變異，正常人群中未檢出,該變異可導致蛋白合成提前終止，因此該基因對男性生育的影響值得進一步研究。

MTL5基因金屬硫蛋白是一種高度保守的低分子量半胱氨酸蛋白，可能在細胞生長和分化的調控中發(fā)揮核心作用，并參與精子的形成。該基因編碼一種金屬硫蛋白樣蛋白，在小鼠睪丸和卵巢中表達不同。Sugihara等[13]通過對小鼠組織mRNA進行隨機RT-PCR，分離出睪丸特異性轉錄本，稱之為TF1。通過以TF1為探針篩選人類睪丸cDNA文庫， 克隆了一種新的稱之為睪丸特異性金屬硫蛋白樣蛋白(tesmin) 的cDNA ，Tesmin編碼一種預測的富含半胱氨酸、295個氨基酸的蛋白質，與小鼠Tesmin同源性為76.3%，序列分析顯示存在2種金屬硫蛋白(MT)樣基序。MT在睪丸中的表達高于肝臟組織[14]，在小鼠雄性生殖細胞中以發(fā)育調控的方式活躍表達。8號患者發(fā)生c.197C>G純合變異，正常人群中頻率較低，未見報道。

生殖激素異常是男性不育的一個重要因素，多數(shù)研究都顯示無精子患者生殖激素出現(xiàn)異常，且與染色體變異有很大關系[15-16]。本研究為探討激素水平是否與基因突變存在關聯(lián)，對患者進行了激素檢測，除1例患者激素水平正常外其余均表現(xiàn)為生殖激素水平的異常，因本研究納入病例較少，因此生殖激素異常與基因變異之間關系有待探討。

綜上所述，在本研究中檢測到的FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP等5個基因發(fā)現(xiàn)在睪丸中表達較高，但是無動物實驗證明及相關臨床報道，這5個基因對于男性生育的影響需要進一步研究。本研究中檢測的SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6個基因的變異可能與精子生成障礙相關，其中SYCE3、DDX4、RGS22 基因均有研究表明在生殖中發(fā)揮重要作用，影響精子的生成，但這些基因的變異目前未見臨床報道。本研究篩選到11個可能影響男性生育的基因，為男性不育基因診斷研究提供參考，但是都未能得到進一步證實，本研究會繼續(xù)深入研究這些基因對男性不育的影響，為男性不育的基因診斷提供有力證據(jù)，豐富男性不育的基因庫。