鄧佩佩 馬 婧 張展羽 張文昊 宋瀟瀟 劉 杰 張香改 韓瑞鈺

河北省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，國家衛(wèi)健委計劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(石家莊，050071)

有研究顯示近15%的不育男性為無精子癥患者，包括梗阻性無精子癥和非梗阻性無精子癥[1-2]。據(jù)估計，至少50%的無精子癥是由遺傳缺陷引起的，包括染色體數(shù)目畸變、囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(CFTR)基因突變和Yq11染色體上的無精子因子(AZF)區(qū)域的微缺失。但是仍有很大一部分無精子癥患者未找到明確致病原因。男性不育是一個復(fù)雜的病理變化，涉及很多基因，目前已知的人類睪丸富集基因有2300個[3]，這些基因中任何一種的基因的變異都會影響到男性生育，且這些突變在人群中都將始終保持非常低的頻率。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，對大量基因進(jìn)行篩選已成為可能，目前已有研究利用全外顯子測序篩選新的變異基因[4-5]。本文針對無精子癥患者進(jìn)行全外顯子測序，目的是篩選精子發(fā)生障礙相關(guān)基因，豐富男性不育基因庫。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取20例在本中心就診的男性無精子癥患者，排除標(biāo)準(zhǔn)： 由化療或放療、創(chuàng)傷性或感染性睪丸炎、精索靜脈曲張、雙側(cè)隱睪等原因?qū)е碌臒o精子癥; 由勃起功能障礙/性欲喪失/無性高潮、逆行射精/無射精、先天性輸精管缺失、輸精管切除術(shù)、外傷或感染引起的機(jī)械性梗阻等原因?qū)е碌?；染色體及AZF結(jié)果異常；梗阻性無精子癥。

1.2 激素檢測

空腹8～12h，抽取清晨靜脈血置促凝管，室溫靜置1h后離心取血清備用。采用化學(xué)發(fā)光免疫分析方法測定血清促卵泡生成素(FSH) 、促黃體生成素(LH) 、睪酮(T) 、雌二醇(E2) 、泌乳素(PRL)。

1.3 全外顯子測序及位點(diǎn)驗(yàn)證

提取研究對象外周血DNA，經(jīng)片段化、連接接頭、擴(kuò)增純化后，使用雜交捕獲方法構(gòu)建DNA文庫，采用高通量測序技術(shù)檢測人類全外顯子組中20099個基因的外顯子區(qū)及旁側(cè)內(nèi)含子區(qū)(20bp)，將測序數(shù)據(jù)與人類基因組hg19參考序列進(jìn)行比對，并對目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度及測序質(zhì)量進(jìn)行評估。對變異位點(diǎn)進(jìn)行篩選，篩選與精子生成障礙相關(guān)的基因，運(yùn)用PolyPhen2、SIFT、Mutation_Taster軟件預(yù)測蛋白功能。根據(jù)ACMG指南對變異位點(diǎn)進(jìn)行評估。篩選出來的變異位點(diǎn)，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增相關(guān)基因外顯子及旁側(cè)內(nèi)含子區(qū)域，進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

20例無精子癥患者，年齡25～45歲，經(jīng)染色體核型分析和Y染色體微缺失檢測(AZF)未發(fā)現(xiàn)異常，激素檢測結(jié)果除1例(13號)患者外，其余均激素水平異常。詳細(xì)信息見表1。

表1 20例無精子癥患者相關(guān)信息

2.2 基因變異位點(diǎn)篩選

通過篩選共計選出26個基因43個變異位點(diǎn)，排除15個常染色體隱性遺傳的單個變異位點(diǎn)及13個與精子運(yùn)動相關(guān)的變異位點(diǎn)，剩余11個基因的15個變異位點(diǎn)可能與精子發(fā)生障礙相關(guān)。對這15個變異位點(diǎn)均進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證，其中包括FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP等5個基因在睪丸組織高表達(dá)，SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6個基因可能與精子發(fā)生障礙相關(guān)，見表2及圖1(封三)。

表2 11個基因變異位點(diǎn)信息

3 討論

男性不育發(fā)病較復(fù)雜，涉及基因很多，與其他單基因疾病不同，該疾病發(fā)病基因突變均較罕見，需要大量標(biāo)本大量基因篩選候選基因。目前隨著測序技術(shù)的發(fā)展，檢測費(fèi)用的降低，已有很多基因被證明可能與男性不育相關(guān)，本文對20例無精子癥患者進(jìn)行全外顯子測序篩選，檢測到可能會影響男性精子生成或發(fā)生障礙的26個基因43個位點(diǎn)變異。排除其中15個常染色體隱性遺傳的單個變異位點(diǎn)；13個與精子運(yùn)動相關(guān)的變異位點(diǎn)(對象為無精癥患者)， 剩余15個變異位點(diǎn)可能與精子發(fā)生障礙相關(guān)。15個變異位點(diǎn)涉及11個基因，其中包括5個基因(8個變異位點(diǎn))數(shù)據(jù)庫中顯示在睪丸組織中高表達(dá)，6個基因(7個變異位點(diǎn))可能與精子生成障礙相關(guān)。

FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP這5個基因數(shù)據(jù)庫信息顯示其在睪丸組織表達(dá)較高。

FAM71B基因編碼的蛋白可能參與RNA生物反應(yīng)，該基因在睪丸中表達(dá)較高，在其他組織中表達(dá)均很低，但其具體作用未查到相關(guān)報道研究。本研究中12號患者該基因發(fā)現(xiàn)2個變異位點(diǎn)c.1339C>T，c.197G>A，生物信息學(xué)軟件PolyPhen2、SIFT、Mutation_Taster預(yù)測有害，但Mutation_Taster對c.197G>A預(yù)測為良性，2個變異位點(diǎn)在人群中的頻率均較低，但是這2個位點(diǎn)變異未見報道，因此其臨床意義未明。

STARD9基因編碼有絲分裂過程中的紡錘體極組裝所需的微管依賴性的馬達(dá)蛋白，影響紡錘體極組裝，該基因在睪丸中表達(dá)較高但不是特異性表達(dá)，但是目前研究認(rèn)為該基因是癌癥治療的重要的靶點(diǎn)[6-7]。本研究在11號患者中發(fā)現(xiàn)該基因2個變異c.1346A>C和c.12764G>A，在人群中頻率較低，也未見相關(guān)報道，其在無精子癥中的作用有待進(jìn)一步研究。

CLTCL1基因編碼小網(wǎng)格蛋白重鏈(CHC22)在肌肉-骨骼中表達(dá)最高，其次是睪丸。Vassilopoulos等[8]發(fā)現(xiàn)CHC22在人類肌肉和脂肪細(xì)胞中形成胰島素反應(yīng)性GLUT4區(qū)隔的過程中發(fā)揮了作用,認(rèn)為chc22依賴的膜轉(zhuǎn)運(yùn)在人類肌肉和脂肪中構(gòu)成了一種物種限制的通路，對2型糖尿病具有潛在的影響。Nahorski等[9]研究認(rèn)為CLTCL1在神經(jīng)嵴發(fā)育以及痛覺和觸覺感覺神經(jīng)元的形成過程中起著重要的作用。對于該基因?qū)由傻挠绊懮形匆妶蟮?。在本研究中發(fā)現(xiàn)17號患者該基因發(fā)生c.3545G>A、c.1331G>A雜合變異，在正常人群中頻率較低。生物信息學(xué)軟件PolyPhen2、 SIFT、 Mutation_Taster預(yù)測有害，但PolyPhen2對c.3545G>A預(yù)測為良性。因此，CLTCL1基因?qū)δ行圆挥挠绊懹写M(jìn)一步驗(yàn)證研究。

PCBP3基因編碼的蛋白是KH結(jié)構(gòu)域蛋白亞家族成員，在轉(zhuǎn)錄后活性中起重要作用，在睪丸中表達(dá)較高。15號患者中檢出的c.1079+2T>C雜合變異未見報道，在正常人群中未檢出，臨床意義未明，目前對該基因研究報道較少。

S100PBP編碼的功能目前尚不清楚，其是通過與S100鈣結(jié)合蛋白P的相互作用而鑒定出來的蛋白質(zhì)，在睪丸中表達(dá)豐度很高。16號患者發(fā)現(xiàn)c.1221_1222delCA雜合變異，在正常人群中未找到，臨床意義未明。

SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6個基因的變異可能與精子生成障礙相關(guān)。

SYCE3基因?qū)儆诼?lián)會復(fù)合體中心元件蛋白，可能作為重要元件啟動同源染色體形成聯(lián)會復(fù)合體的過程，該基因可能與細(xì)胞分裂、同源染色體重組、精子生成等密切相關(guān)，在睪丸中表達(dá)很高，在其他組織中表達(dá)很低。 Schramm等[10]克隆了小鼠Syce3， RT-PCR分析12個小鼠組織，僅在睪丸和胚胎卵巢中檢測到Syce3。本研究發(fā)現(xiàn)1號患者c.181_184delCGGC純合變異，在正常人群中未檢出，該變異會導(dǎo)致氨基酸編碼異常，終止密碼子丟失，蛋白多肽鏈翻譯延長，對蛋白功能影響未知。但是該變異未有臨床報道，Schramm等[10]發(fā)現(xiàn)敲除小鼠SYCE3基因可導(dǎo)致小鼠不育。因此SYCE3基因很可能會影響男性的生育能力，導(dǎo)致不育，由于患者不愿意繼續(xù)檢測，其臨床意義未確定，有待進(jìn)一步研究。

EFCAB6該基因編碼是一種直接結(jié)合癌基因DJ-1和雄激素受體的蛋白，在細(xì)胞中形成三元復(fù)合體。這種結(jié)合蛋白招募組織去乙?；笍?fù)合物，以抑制雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性，也可能在精子形成和受精過程中發(fā)揮作用，在睪丸中特異表達(dá)很高，其他組織中表達(dá)較低。9號患者發(fā)現(xiàn)c.1576C>T、c.677C>A兩個雜合變異，在正常人群中頻率較低。臨床意義未明，目前對該基因研究報道很少。

DDX4基因編碼的蛋白是一種推測的RNA解旋酶，它們參與了許多涉及RNA二級結(jié)構(gòu)改變的細(xì)胞過程，如翻譯起始、核和線粒體剪接、核糖體和剪接體組裝。該基因在生殖細(xì)胞譜系中具有特異性表達(dá)，在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中起著重要作用。 Chu等[11]采用蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞學(xué)和功能分析相結(jié)合的方法對秀麗隱桿線蟲進(jìn)行分析研究尋找生殖相關(guān)蛋白，在與線蟲蛋白相對應(yīng)的小鼠基因敲除中，37%導(dǎo)致雄性不育，其中就包括了DDX4基因。本研究中13號患者發(fā)現(xiàn)在該基因存在c.204_205delAG的缺失突變，在正常人群中未見收錄。該變異導(dǎo)致氨基酸框移突變，導(dǎo)致蛋白合成提前終止，因此其對男性不育的影響有待進(jìn)一步研究。

KDM5D基因編碼的蛋白是賴氨酸特異性去甲基化酶5D。該蛋白是一種組蛋白去甲基化酶，可以特異性的使組蛋白H3的“Lys-4”去甲極化，可能與精子發(fā)生有關(guān)，但是未見相關(guān)報道研究。15號患者發(fā)生c.3035G>C的半合子突變，在正常人群中未見收錄，臨床意義未明。

RGS22基因編碼的蛋白是G蛋白信號調(diào)節(jié)因子22，可通過增加G蛋白α亞基的GTP酶活性抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 Hu等[12]研究顯示無精子癥患者睪丸中RGS22表達(dá)明顯降低，RGS22在梗阻性無精子癥中表達(dá)正常?；颊?6號檢測到c.2966_2967delTA雜合變異，正常人群中未檢出,該變異可導(dǎo)致蛋白合成提前終止，因此該基因?qū)δ行陨挠绊懼档眠M(jìn)一步研究。

MTL5基因金屬硫蛋白是一種高度保守的低分子量半胱氨酸蛋白，可能在細(xì)胞生長和分化的調(diào)控中發(fā)揮核心作用，并參與精子的形成。該基因編碼一種金屬硫蛋白樣蛋白，在小鼠睪丸和卵巢中表達(dá)不同。Sugihara等[13]通過對小鼠組織mRNA進(jìn)行隨機(jī)RT-PCR，分離出睪丸特異性轉(zhuǎn)錄本，稱之為TF1。通過以TF1為探針篩選人類睪丸cDNA文庫， 克隆了一種新的稱之為睪丸特異性金屬硫蛋白樣蛋白(tesmin) 的cDNA ，Tesmin編碼一種預(yù)測的富含半胱氨酸、295個氨基酸的蛋白質(zhì)，與小鼠Tesmin同源性為76.3%，序列分析顯示存在2種金屬硫蛋白(MT)樣基序。MT在睪丸中的表達(dá)高于肝臟組織[14]，在小鼠雄性生殖細(xì)胞中以發(fā)育調(diào)控的方式活躍表達(dá)。8號患者發(fā)生c.197C>G純合變異，正常人群中頻率較低，未見報道。

生殖激素異常是男性不育的一個重要因素，多數(shù)研究都顯示無精子患者生殖激素出現(xiàn)異常，且與染色體變異有很大關(guān)系[15-16]。本研究為探討激素水平是否與基因突變存在關(guān)聯(lián)，對患者進(jìn)行了激素檢測，除1例患者激素水平正常外其余均表現(xiàn)為生殖激素水平的異常，因本研究納入病例較少，因此生殖激素異常與基因變異之間關(guān)系有待探討。

綜上所述，在本研究中檢測到的FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP等5個基因發(fā)現(xiàn)在睪丸中表達(dá)較高，但是無動物實(shí)驗(yàn)證明及相關(guān)臨床報道，這5個基因?qū)τ谀行陨挠绊懶枰M(jìn)一步研究。本研究中檢測的SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6個基因的變異可能與精子生成障礙相關(guān)，其中SYCE3、DDX4、RGS22 基因均有研究表明在生殖中發(fā)揮重要作用，影響精子的生成，但這些基因的變異目前未見臨床報道。本研究篩選到11個可能影響男性生育的基因，為男性不育基因診斷研究提供參考，但是都未能得到進(jìn)一步證實(shí)，本研究會繼續(xù)深入研究這些基因?qū)δ行圆挥挠绊?，為男性不育的基因診斷提供有力證據(jù)，豐富男性不育的基因庫。