楊煒婷 溫 芯 胡洪梅 黃 勇

四川省涼山州第一人民醫(yī)院( 615000)

原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)是婦產(chǎn)科常見妊娠并發(fā)癥[1-2]。發(fā)生涉及到多種因素機(jī)制尚不明確。有研究表明，絨毛血管增生、滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲對(duì)妊娠建立和維持非常重要，其異?？赡軐?dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在妊娠早期胎盤絨毛組織的血管形成、發(fā)育過(guò)程中起重要作用[4-5]。細(xì)胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA(ANRIL)屬長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)，與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移過(guò)程密切相關(guān)[6]。妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為與腫瘤細(xì)胞相似，但lncRNA ANRIL、VEGF在URSA中的關(guān)系研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)lncRNA ANRIL、VEGF在URSA患者絨毛中表達(dá)，探討在URSA發(fā)病中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月-2019年6月在本院就診的URSA患者62例(觀察組)，同期要求行人工流產(chǎn)術(shù)正常早孕者62例(對(duì)照組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①單胎妊娠。②觀察組有腹痛、陰道流血等先兆流產(chǎn)癥狀，經(jīng)B超檢測(cè)證實(shí)無(wú)胚胎心臟跳動(dòng)；對(duì)照組無(wú)腹痛、陰道流血等先兆流產(chǎn)癥狀，B超檢查提示為正常宮內(nèi)妊娠且胚胎發(fā)育正常。③妊娠≤12周，觀察組連續(xù)自然流產(chǎn)≥3次。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有生殖系統(tǒng)異常、慢性高血壓、糖尿病、腎臟疾病、心血管疾病、甲狀腺疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、妊娠并發(fā)癥。②有家族復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病史、外科手術(shù)和醫(yī)療并發(fā)癥史。③有染色體、解剖、內(nèi)分泌、感染、免疫方面原因。④服用過(guò)藥物或男方精液檢查不正常。⑤臨床資料保存不完整者。⑥服用藥物。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象及家屬簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

TRIzol試劑購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。qRT-PCR儀(Prism 7500)購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；紫外分光光度計(jì)(UV-1800PC)購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司。lncRNA ANRIL、VEGF、GAPDH引物均由華大基因科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.3 絨毛組織采集與保存

觀察組行清宮手術(shù)、對(duì)照組行人工流產(chǎn)術(shù)時(shí)采集新鮮胎盤絨毛組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗，分成兩份，置液氮中速凍，-80℃保存。

1.4 lncRNA ANRIL、VEGF mRNA檢測(cè)

使用TRIzol試劑提取絨毛組織總RNA，紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量、完整性，合格后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢驗(yàn)cDNA質(zhì)量，合格后采用qRT-PCR法檢測(cè)lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達(dá)水平。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH基因。10 μl反應(yīng)體系：Green Mix 5 μl，50 ng/μl cDNA 1 μl，10 μM上下游引物各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反應(yīng)條件：95℃ 90 s；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)終止。lncRNA ANRIL上游引物：5'-TACCATACAACAGACCAGAA-3'，下游引物：5'-TTGTTTTTCCAACATCCAT-3'；VEGF上游引物：5'-TGGATCCATGAACTTTCTGCTGTC-3'，下游引物：5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACA-3'；GAPDH上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'。lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達(dá)水平以2-ΔΔCt法表示，Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到臨界閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、體質(zhì)指數(shù)、孕周、孕囊大小、先前流產(chǎn)次數(shù)比較無(wú)差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達(dá)水平

絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達(dá)水平觀察組均低于對(duì)照組(P<0.05)。見圖1、表2。

2.3 觀察組絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL與VEGF mRNA表達(dá)相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，觀察組絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL與VEGF mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.484，P<0.05)。見圖2。

表2 兩組絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達(dá)水平比較

圖1 兩組絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達(dá)電泳圖

圖2 URSA患者絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL與VEGF mRNA表達(dá)相關(guān)性

2.4 影響URSA發(fā)生的多因素分析

將URSA發(fā)生作為因變量，以URSA患者絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL和VEGF mRNA表達(dá)水平為自變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析。結(jié)果顯示，絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達(dá)水平均為影響URSA發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響URSA發(fā)生的多因素分析

3 討論

URSA易導(dǎo)致早期流產(chǎn)發(fā)生，再發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)隨流產(chǎn)次數(shù)的增加而增加，長(zhǎng)此以往可導(dǎo)致不孕不育[7]。既往研究表明，妊娠過(guò)程中胚胎著床、植入、發(fā)育需要達(dá)到母體、胚胎間的免疫平衡，故免疫治療成為了URSA的主要研究方向，但臨床治療中仍有30%～40% URSA患者無(wú)效。有研究表明，URSA的發(fā)生機(jī)制與絨毛中血管形成障礙、胚胎缺血缺氧有關(guān)[8]。妊娠早期絨毛中血管形成是胚胎成功種植及正常發(fā)育的重要前提，有助于滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜，并在妊娠全過(guò)程中保障胚胎發(fā)育。當(dāng)絨毛中血管形成障礙時(shí)，會(huì)引起絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲障礙及胚胎植入發(fā)育異常，最終導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生[9]。

Ferretti等[10]研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移、侵襲特性與腫瘤細(xì)胞極其相似。lncRNA在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，通過(guò)影響細(xì)胞周期、改變腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)及干擾miRNA功能等途徑，參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)過(guò)程[11]；秦妮娜等[6]研究表明，使用丙泊酚抑制lncRNA ANRIL表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖與遷移；吳浩等[11]研究表明，抑制肝癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ANRIL表達(dá)可顯著降低肝癌細(xì)胞的增殖能力；賀小云等[12]研究表明，lncRNA在胚胎形成、妊娠建立、激素調(diào)節(jié)、早期胚胎發(fā)育等階段均發(fā)揮重要作用，但研究多集中在動(dòng)物繁殖方向。崔進(jìn)等[13]研究表明，lncRNA在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和正常妊娠人工流產(chǎn)者間存在差異。本研究結(jié)果顯示，URSA患者絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL表達(dá)水平較正常妊娠者低，提示絨毛組織lncRNA ANRIL參與URSA發(fā)病過(guò)程，可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、侵襲過(guò)程有關(guān)。

VEGF可促進(jìn)絨毛新生血管形成及滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移[14]。其表達(dá)水平下降會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖發(fā)生障礙，血管通透性下降，絨毛、蛻膜血管生成產(chǎn)生缺陷，最終導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育并流產(chǎn)[15-16]。尹太郎等[3]研究表明，mRNA通過(guò)靶向調(diào)控VEGF表達(dá)，調(diào)控絨毛血管發(fā)育，參與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病過(guò)程。吳成平等[7]研究亦表明，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胎盤絨毛組織中VEGF表達(dá)異常下調(diào)可能是引起復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的重要原因。高玉霞等[17]研究表明，URSA患者絨毛組織中VEGF mRNA表達(dá)水平較人工流產(chǎn)者低，且隨著URSA患者流產(chǎn)次數(shù)的升高而降低。本研究結(jié)果顯示，URSA患者絨毛組織中VEGF mRNA表達(dá)水平較正常妊娠者低，提示絨毛組織VEGF低表達(dá)可能是導(dǎo)致URSA發(fā)生的一個(gè)重要因素。

陳日紅等[18]研究表明，LncRNA ANRIL可能通過(guò)調(diào)控VEGF表達(dá)參與增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變過(guò)程。Zhang等[19]研究表明，在大鼠模型中，lncRNA ANRIL過(guò)表達(dá)后通過(guò)上調(diào)VEGF表達(dá)，促進(jìn)糖尿病合并腦梗死大鼠血管生成。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，URSA患者絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL與VEGF mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示lncRNA ANRIL可能通過(guò)調(diào)控VEGF表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致URSA患者絨毛新生血管形成、滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過(guò)程發(fā)生障礙。多因素分析顯示，絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA水平均為影響URSA發(fā)生的保護(hù)因素，提示lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達(dá)水平異常下降可能是導(dǎo)致URSA發(fā)病的重要因素。

綜上所述，URSA患者絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達(dá)水平異常下調(diào)，可能二者共同作用影響URSA發(fā)生，但其具體作用機(jī)制還待進(jìn)一步研究。