傅 鵬 許雅棋 鄧金花*

1.廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司 廣東韶關(guān) 512029 2.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司 廣東廣州 510663

生肉是人類腸道致病菌包括沙門氏菌(Salmonella)、彎曲桿菌(Campylobacter)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、產(chǎn)毒性大腸桿菌(Escherichia coli)O157:H7以及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)等的重要載體[1]，其他一些食源性致病菌，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)也存在于一些生肉制品中。這些微生物不僅在我國(guó)市售產(chǎn)品的抽檢中被發(fā)現(xiàn)[2]，也在進(jìn)口產(chǎn)品的微生物污染調(diào)查中被檢出[3]，它們主要是在屠宰、分割、加工、運(yùn)輸和零售過(guò)程中污染的，如果在隨后的儲(chǔ)存、解凍、加工或烹飪等處理過(guò)程中處置不當(dāng)，則會(huì)引起食源性疾病而威脅身體健康；在國(guó)內(nèi)國(guó)際貿(mào)易中，也會(huì)由此導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。

二氧化氯是一種廣譜高效的強(qiáng)氧化型殺菌劑，被廣泛用于食品加工業(yè)的環(huán)境、器具等的消毒，觀察二氧化氯對(duì)這些食源性致病菌的殺滅效果具有現(xiàn)實(shí)意義，可對(duì)屠宰廠或肉制品加工廠的消毒提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

采用廣東省微生物研究所從全國(guó)市場(chǎng)采樣分離得到并經(jīng)過(guò)鑒定、保存的菌株。具體為：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(FSCC 234150；凍雞翅)、沙門氏菌(FSCC 21501418；雞肉)、金黃色葡萄球菌(FSCC 22301357；雞肉)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(FSCC 17802589；凍雞翅)、蠟樣芽孢桿菌(FSCC 11502697；豬肉)。

試驗(yàn)菌株制備成相應(yīng)的菌懸液或芽孢懸液備用。

1.2 消毒劑

試驗(yàn)采用二氧化氯消毒液(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn))，按產(chǎn)品說(shuō)明書活化后，用無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋成試驗(yàn)濃度的1.25倍濃度，采用二氧化氯比色計(jì)(S-307，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)測(cè)定濃度(濃度范圍控制在±1mg/L)。

1.3 試劑

1.3.1 有機(jī)干擾物

牛血清白蛋白(上海源葉生物)3%；溶解后用微孔濾膜，孔徑為0.45μm，過(guò)濾除菌，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)硬水(硬度342mg/L)

氯化鈣(CaCl2)0.034g，氯化鎂(MgCl2·6H2O)0.139g，蒸餾水加至1 000mL。分裝后用高壓滅菌鍋(HIRAYAMA，日本)121℃，15min滅菌備用。

1.3.3 稀釋液(胰蛋白胨生理鹽水溶液，TPS)

胰蛋白胨(廣東環(huán)凱)1.0g，氯化鈉8.5g；蒸餾水加至1 000mL，分裝后121℃，15min高壓滅菌備用。

1.3.4 中和劑

硫代硫酸鈉0.2%，卵黃卵磷脂(廣東環(huán)凱)0.3%；吐溫80，1.0%的PBS溶液(無(wú)水磷酸氫二鈉2.83g、磷酸二氫鉀1.36g，蒸餾水加至1 000mL)。121℃，15min高壓滅菌備用。

其余未經(jīng)說(shuō)明的化學(xué)試劑均為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.4 中和劑鑒定

中和劑鑒定按照消毒技術(shù)規(guī)范[4](衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司，2002)中2.1.1.5的要求進(jìn)行，以確定所選的中和劑是否適用于擬進(jìn)行的懸液定量殺菌試驗(yàn)。

1.5 懸液定量殺菌試驗(yàn)

采用懸液定量殺菌試驗(yàn)評(píng)價(jià)二氧化氯對(duì)試驗(yàn)菌株的殺滅效果，方法按照消毒技術(shù)規(guī)范[4](衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司，2002)中2.1.1.7.4的要求進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 中和劑鑒定結(jié)果

以小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌為對(duì)象的中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果表明，中和劑、消毒劑和中和劑的中和產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)菌沒有抑菌作用，且中和劑能有效中和最高殺菌試驗(yàn)濃度，中和劑和中和產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)菌和培養(yǎng)基無(wú)影響。由此判定，0.2%硫酸硫酸鈉，0.3%卵黃卵磷脂和1.0%吐溫80的PBS溶液，可以作為本試驗(yàn)的中和劑使用。

2.2 對(duì)細(xì)菌繁殖體的懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果

二氧化氯對(duì)4種細(xì)菌繁殖體的殺滅效果如表1所示。濃度為8mg/L的二氧化氯作用1min對(duì)4種細(xì)菌繁殖體的作用效果均有限，懸液定量殺菌試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均<3。從試驗(yàn)的作用時(shí)間來(lái)看，在低濃度下，延長(zhǎng)時(shí)間并不能增加殺滅效果，殺滅對(duì)數(shù)值在同一水平線上。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌似乎表現(xiàn)出比其他3種細(xì)菌繁殖體更強(qiáng)的二氧化氯抵抗性。濃度為16mg/L的二氧化氯對(duì)其殺滅對(duì)數(shù)值仍<4，而對(duì)其他3種細(xì)菌繁殖體的殺滅對(duì)數(shù)值均>5。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌對(duì)消毒劑的耐受性較強(qiáng)[5,6]，它對(duì)季銨鹽類消毒劑的耐受性可能與其外排泵相關(guān)[7]，但對(duì)二氧化氯的耐受性機(jī)制尚未見有關(guān)報(bào)道。

濃度為24mg/L的二氧化氯對(duì)4種細(xì)菌繁殖體的殺滅對(duì)數(shù)值均>5(殺滅率100%)。

表1 二氧化氯對(duì)4種細(xì)菌繁殖體的懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3 對(duì)芽孢的懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果

二氧化氯對(duì)蠟樣芽孢桿菌芽孢懸液的殺滅效果如表2所示。從表2中可以看出，芽孢表現(xiàn)出對(duì)消毒劑更強(qiáng)的抵抗力，在沒有有機(jī)干擾物存在的情況下，所有實(shí)驗(yàn)濃度和作用時(shí)間條件下，殺滅對(duì)數(shù)值均<5。

隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，同一試驗(yàn)濃度對(duì)芽孢的殺滅對(duì)數(shù)值明顯變大(不同的數(shù)量級(jí))，這與表1在低濃度情況下的數(shù)據(jù)有所不同。這可能是由于添加有機(jī)干擾物后，二氧化氯優(yōu)先與干擾物反應(yīng)。

表2 二氧化氯對(duì)蠟樣芽孢桿菌芽孢懸液的懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，二氧化氯對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌等5種食源性致病菌，均具有較好的殺滅效果。對(duì)于肉制品屠宰、分割、加工等場(chǎng)所，在使用二氧化氯消毒前應(yīng)進(jìn)行徹底的清洗，以盡可能減少脂肪和蛋白質(zhì)等有機(jī)物降低消毒劑的消毒效果。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在本次試驗(yàn)中表現(xiàn)出不一樣的對(duì)二氧化氯的耐受性。它廣泛存在于自然界中，在4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。由于肉制品的李斯特氏菌污染而引起的食源性疾病時(shí)有暴發(fā)。本次試驗(yàn)揭示，如果在食品加工環(huán)境中檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，在使用二氧化氯消毒時(shí)，較其他目標(biāo)菌，需相應(yīng)提高消毒液濃度和延長(zhǎng)作用時(shí)間，以保證殺滅效果。尤其是李斯特氏菌適合在濕冷的環(huán)境生存，在這些環(huán)境中使用消毒劑更應(yīng)注意控制較高的濃度。另外，李斯特氏菌對(duì)二氧化氯耐受性的作用機(jī)理也值得深入研究。