劉建林，孫學(xué)穎，劉志鵬，趙麗華*，靳 燁，趙富元

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010020 2 內(nèi)蒙古蒙元寬食品有限公司 內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000）

發(fā)酵肉干是指將背最長(zhǎng)肌切成約5 cm×5 cm的肉條，在自然或人工控制條件下，經(jīng)自然或添加外源發(fā)酵劑，利用微生物或酶的發(fā)酵作用，發(fā)酵、干燥熟制而成的一類具有特殊風(fēng)味、色澤和質(zhì)地，且具有較長(zhǎng)保藏期的肉制品[1-2]。其在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)用生物工程中的微生物發(fā)酵工程，相比傳統(tǒng)肉制品其具有營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、保質(zhì)期長(zhǎng)三大主要特點(diǎn)。

肉制品在加工過(guò)程中常會(huì)添加硝酸鹽及亞硝酸鹽類，這類物質(zhì)不僅使肉制品在加工過(guò)程中形成特有風(fēng)味，還起到發(fā)色和防腐的作用[3]。然而，肉制品中亞硝胺的產(chǎn)生與添加的亞硝酸鹽密切相關(guān)，食物中的亞硝酸鹽和二級(jí)胺在弱酸性條件下（胃酸）反應(yīng)生成“N-亞硝胺”，該物質(zhì)為公認(rèn)的強(qiáng)致癌物[4-5]。Hustad 等[6]對(duì)添加的亞硝酸鈉和殘留的亞硝酸鈉與生成的亞硝胺的含量進(jìn)行研究，結(jié)果表明，隨著亞硝酸鈉添加量的增加，相對(duì)應(yīng)的亞硝胺生成量亦提高。

發(fā)酵肉制品的典型品質(zhì)及良好風(fēng)味組成源于發(fā)酵成熟期間的理化、生化及微生物的變化。蛋白和脂質(zhì)的氧化水解是發(fā)酵肉制品中營(yíng)養(yǎng)因子和重要風(fēng)味物質(zhì)的主要來(lái)源，在發(fā)酵成熟過(guò)程中，其被微生物酶及肉內(nèi)源酶分解為游離氨基酸和脂肪酸，既可提供人體所需氨基酸和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)因子，也易通過(guò)氧化、分解和Strecker 反應(yīng)及美拉德反應(yīng)生成決定香腸品質(zhì)的主要風(fēng)味物質(zhì)[7-8]。

劉蘭[9]探究不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵牛肉干品質(zhì)的影響結(jié)果表明，乳清+發(fā)酵劑可降低成品中亞硝酸鹽的含量，提高揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類；辛?xí)早萚10]研究戊糖片球菌37X-8 對(duì)發(fā)酵羊肉香腸中亞硝酸鹽和亞硝胺含量變化的影響，發(fā)現(xiàn)添加發(fā)酵劑對(duì)亞硝酸鹽和亞硝胺的抑制作用比未添加更為明顯；王德寶等[11]通過(guò)接種清酒乳桿菌與木糖葡萄球菌，探究不同發(fā)酵劑對(duì)羊肉發(fā)酵香腸中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)代謝與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響，發(fā)現(xiàn)添加復(fù)合發(fā)酵劑有助于改善香腸風(fēng)味感官品質(zhì)。

本文選擇天然乳清和復(fù)合菌株 （木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌比例為1∶1∶2∶1）為發(fā)酵劑，制作發(fā)酵羊肉干，探究不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵羊肉干中亞硝酸鹽、亞硝胺殘留量及風(fēng)味物質(zhì)形成的影響，以期為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器

原輔料：羊肉背最長(zhǎng)脊，巴盟察右中旗放牧羊；食鹽、醬油、蔥、姜、孜然、白砂糖、葡萄糖、亞硝酸鈉均為市售食品級(jí)。

發(fā)酵劑：乳清，內(nèi)蒙古蒙元寬食品有限公司；復(fù)合發(fā)酵劑（107CFU/g，木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌比例為1∶1∶2∶1），木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus），中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus），廣東省微生物菌種保藏中心；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，37X-3）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，37X-6），內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品微生物實(shí)驗(yàn)室。

試劑：甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma 公司。

儀器：恒溫恒濕箱（ZXMP-A1430），上海智城分析儀器制造有限公司；UV-1800 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Trace ISQ），賽默飛世爾科技；高效液相色譜儀（Agilent 1260vwd），安捷倫有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵肉干的制作 羊背最長(zhǎng)肌1 kg、食鹽5 g/kg、葡萄糖1 g/kg、白砂糖5 g/kg、醬油5 g/kg、蔥5 g/kg、姜5 g/kg、孜然5 g/kg、亞硝酸鈉2 mg/kg、乳清2%、復(fù)合發(fā)酵劑2%。工藝條件如表1所示。

表1 發(fā)酵羊肉干工藝條件Table 1 Fermented mutton jerky processing conditions

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共分為4 組：對(duì)照組；復(fù)合發(fā)酵劑組（木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌）；乳清組；乳清+發(fā)酵劑組。然后取不同階段：0 d（腌制階段），2 d（發(fā)酵階段），4 d（干燥階段），5 d （烤制階段） 的樣品進(jìn)行亞硝酸鹽、亞硝胺指標(biāo)測(cè)定，取成品樣進(jìn)行風(fēng)味指標(biāo)測(cè)定。樣品于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 亞硝酸鹽的測(cè)定

參照《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.33-2016）[12]方法測(cè)定肉干亞硝酸鹽殘留量。

1.4 亞硝胺的測(cè)定

參照溫演慶等[13]的方法測(cè)定，并做適當(dāng)調(diào)整。稱取樣品2 g 置于150 mL 三角瓶中，加入甲醇30 mL，搖勻，確保試樣完全被浸濕，于40 ℃超聲水浴萃取20 min，用玻璃GI 砂芯漏斗過(guò)濾至100 mL圓底燒瓶中，再加入甲醇20 mL，于40 ℃超聲水浴萃取10 min，過(guò)濾后合并濾液，收集的濾液置于真空下濃縮至近干，準(zhǔn)確移取2 mL 甲醇加入濃縮至近干的圓底燒瓶中，混勻靜置，經(jīng)0.45 μm 的有機(jī)過(guò)濾膜過(guò)濾后，置于樣品瓶中，上機(jī)測(cè)定。

1.5 風(fēng)味測(cè)定

參照羅玉龍等[14]的方法稍作改動(dòng)。采用固相微萃取法處理樣品。取6 g 樣品置于20 mL 頂空瓶中壓蓋，將老化后的SPME 萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于60 ℃吸附50 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

氣相色譜條件：使用DB-5 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），以氦氣載氣流速1 mL/min，進(jìn)洋口與接口溫度為250 ℃，不分流方式為進(jìn)樣模式。

升溫程序：采用三段式升溫程序，第1 階段起始溫度40 ℃，以4 ℃/min 的速度升溫至150 ℃，持續(xù)3 min；第2 階段從150 ℃升溫至200 ℃，速度為5 ℃/min，保持1 min；第3 階段以20 ℃/min 的速度從200 ℃升溫到230 ℃，時(shí)間為5 min。

質(zhì)譜條件：采用EI 離子源為電離方式，電離電壓為70 eV，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，掃描質(zhì)量范圍30～400 m/z，溶劑延遲時(shí)間為1 min。

由表1可知，實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組群體任務(wù)凝聚力均值及各維度均值均較高于相應(yīng)的中間值，群體交往凝聚力均值及各維度均值均較低于相應(yīng)的中間值；實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的群體任務(wù)凝聚力和群體交往凝聚力經(jīng)t檢驗(yàn)均存在顯著性差異(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)組總體凝聚力只是單純的任務(wù)凝聚力，成員間不熟悉，交流不多，體現(xiàn)在成員只為完成學(xué)習(xí)任務(wù)的行為表現(xiàn)；對(duì)照組總體凝聚力體現(xiàn)在成員能夠積極地完成教學(xué)任務(wù)，但都專注于自己的事情，成員之間缺乏交流、溝通。此時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組凝聚力水平都很低。

定性與定量分析：將總離子流色譜圖中的每個(gè)峰與NIST、WILEY 和MENALIB 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索定性，以匹配度大于800 為鑒定依據(jù)。根據(jù)峰面積歸一法計(jì)算每種風(fēng)味化合物的相對(duì)百分含量，單位為AU/g。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)每個(gè)數(shù)據(jù)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。圖表繪制采用Origin Pro 2018，數(shù)據(jù)顯著性分析選用SPSS 8.0 軟件完成。所有數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，平均值采用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵羊肉干亞硝酸鹽（NIT）殘留的影響

發(fā)酵肉制品中亞硝酸鹽的主要來(lái)源是微生物的代謝產(chǎn)生以及外源添加[15]。由圖1可知，4 組發(fā)酵羊肉干的亞硝酸鹽含量均呈先下降后升高的趨勢(shì)。在腌制階段，乳清組顯著低于發(fā)酵劑組和乳清+發(fā)酵劑組（P＜0.05），乳清+發(fā)酵劑組顯著高于對(duì)照組和乳清組（P＜0.05），這可能是由于在腌制過(guò)程中，原材料攪拌不均勻?qū)е孪隳c中亞硝酸鈉殘留量不同[16]。發(fā)酵階段結(jié)束后各組的亞硝酸鹽殘留量達(dá)到最低，其中乳清組（0.85 mg/kg）顯著低于其它3 組（P＜0.05），一方面可能是由于乳清組中含有大量的乳酸菌，并且乳酸菌菌株多樣，在此階段其pH 值剛好達(dá)到亞硝酸鹽還原酶的最適pH值范圍，從而發(fā)揮了較好的酶降解作用；另一方面可能是由于亞硝酸鈉產(chǎn)生的游離亞硝酸分解生成NO 與肌紅蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的亞硝基肌紅蛋白（呈玫瑰紅色），從而使得乳清組的亞硝酸鹽含量達(dá)到最低[16-17]；也有可能由于在發(fā)酵肉干中添加了食鹽，使原料肉中的鹽離子濃度升高，高濃度食鹽、氨基酸和肌紅蛋白與酸性環(huán)境等因素結(jié)合，使亞硝酸鹽的含量降低[12]。在烤制結(jié)束后，試驗(yàn)組亞硝酸鹽含量均顯著降低（P＜0.05），乳清組（1.86 g/kg）顯著低于其它3 組（P＜0.05）。各組肉干的亞硝酸鹽含量均小于國(guó)家規(guī)定的30 mg/kg。

2.2 不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵羊肉干亞硝胺殘留的影響

由圖2可知，羊肉干在發(fā)酵結(jié)束后，各組亞硝胺含量顯著升高，試驗(yàn)乳清組的亞硝胺含量為35.14 μg/kg，顯著低于其它3 組（P＜0.05），可能是由于在發(fā)酵過(guò)程中乳清組存在大量乳酸菌使得pH 值降低，促進(jìn)了亞硝酸鹽的還原作用，使得亞硝酸鹽分解，大大降低了它的殘留量，從而進(jìn)一步減少了亞硝胺的含量[18]；另一方面可能是由于肉干中的蛋白質(zhì)沒(méi)有被降解為亞硝胺的前體物質(zhì)氨基酸和胺，從而減少了亞硝胺的合成。在干燥結(jié)束后，乳清+復(fù)合發(fā)酵劑組的亞硝胺含量為14.35 μg/kg，顯著低于其它3 組（P＜0.05）。而在烤制結(jié)束后，4 組羊肉干中的亞硝胺含量大幅增加，可能是由于羊肉干中的脂肪在高溫條件下烤制，加快了亞硝基化反應(yīng)進(jìn)行的速率，并在高溫下導(dǎo)致菌失活進(jìn)而造成烤制結(jié)束后亞硝胺含量明顯上升[19]。成品中乳清組的亞硝胺含量（110.61 μg/kg）顯著低于其它3 組（P＜0.05），從而使得亞硝基化反應(yīng)進(jìn)行的速率降低。

圖1 不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵羊肉干中亞硝酸鹽含量變化的影響Fig.1 The effects of different fermentation agents on the change of nitrite content in fermented mutton jerky

圖2 不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵羊肉干中亞硝胺含量變化的影響Fig.2 The effects of different fermentation agents on the change of nitrosamine in fermented mutton jerky

2.3 不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵羊肉干成品風(fēng)味物質(zhì)形成的影響

發(fā)酵肉制品中的風(fēng)味物質(zhì)主要源于蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的氧化分解，如氨基酸Strecker 降解、脂質(zhì)氧化及美拉德反應(yīng)構(gòu)成風(fēng)味物質(zhì)生成主要途徑[8]。由表2可知，發(fā)酵羊肉干成品中共檢測(cè)出主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)29 種，對(duì)照組21 種；發(fā)酵劑組和乳清+發(fā)酵劑組22 種；乳清組23 種揮發(fā)性成分，其中醛、醇、酮類物質(zhì)各3 種，酸類5 種，烴類4 種，其它為5 種。通過(guò)不同組之間比較發(fā)現(xiàn)，復(fù)合發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵羊肉干的風(fēng)味影響較小，天然乳清卻可促進(jìn)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)分解，產(chǎn)生風(fēng)味相關(guān)前體物質(zhì)，提高肉干中特征風(fēng)味物質(zhì)含量[11]。

表2 不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵羊肉干中風(fēng)味組成的影響Table 2 Effects of different starter cultures on flavor composition in fermented mutton jerky

醇類化合物的風(fēng)味主要由肌肉中的共軛亞油酸被脂肪氧合酶和氫過(guò)氧化酶降解產(chǎn)生[27]，其閾值高于醛，故其對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)可能小于醛。對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的醇類主要是1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇和苯甲醇。1-辛烯-3-醇和1-戊烯-3-醇又稱為蘑菇醇，其閾值較低，具有蘑菇香味，主要來(lái)源于花生四烯酸和亞油酸的脂質(zhì)氧化[28-29]，如表2所示，1-辛烯-3-醇只在對(duì)照組和乳清+發(fā)酵劑組中檢出，其中乳清+發(fā)酵劑組含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；苯甲醇是重要芳香醇之一，常以酯類形式呈現(xiàn)并存在于玫瑰花油及肉制品中[13]。特征香味醇類物質(zhì)主要源自原料肉，故成品中含量可能偏低或消失[11]。一般直鏈伯醇風(fēng)味相對(duì)較弱，然而隨著碳鏈增長(zhǎng)，其風(fēng)味也增強(qiáng)，表現(xiàn)為青香、木香和脂肪香特征；正丁醇在對(duì)照組中未檢出，且乳清組的正丁醇含量顯著高于其它2 組（P＜0.05）。而且有部分醇類可能是在微生物的參與下形成，部分醇類（如1-辛烯-3-醇、沉香醇）是添加亞硝酸鹽后產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)[26]；各組沉香醇的含量依次為對(duì)照組>發(fā)酵劑組>乳清+發(fā)酵劑>乳清組，這與成品中亞硝酸鹽的含量有關(guān)。

酮類化合物由氨基酸Strecker 降解、脂肪酸氧化熱降解及微生物分解代謝產(chǎn)生，其風(fēng)味獨(dú)特，閾值低，大多具有奶油香或水果香味，隨著碳鏈增加，風(fēng)味愈加濃郁，對(duì)肉品風(fēng)味有積極作用[30-31]。飽和酮是動(dòng)物特征味和植物油脂味的來(lái)源，比如3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二酮和戊二酮具有強(qiáng)烈的奶油香味；3-羥基-2-丁酮由肉制品中檸檬酸代謝產(chǎn)生二乙酸轉(zhuǎn)化而來(lái)[32]。發(fā)酵劑組的3-羥基-2-丁酮含量顯著高于其它3 組，而乳清組的3-羥基-2-丁酮含量顯著低于其它3 組，說(shuō)明成熟過(guò)程中乳清可能會(huì)抑制代謝檸檬酸生成二乙酸最終轉(zhuǎn)化為3-羥基-2-丁酮，而單一復(fù)合發(fā)酵劑組有助于代謝檸檬酸生成二乙酸最終轉(zhuǎn)化為3-羥基-2-丁酮，與王德寶等[11]研究結(jié)果一致。據(jù)研究表明，亞硝酸鹽對(duì)酮類風(fēng)味物質(zhì)的影響并不明顯[33]。

短鏈脂肪酸中的直鏈羧酸主要來(lái)自不飽和脂肪酸的水解，帶有支鏈的羧酸大多由相應(yīng)的醛衍生而成[20]。短鏈脂肪酸在羊肉中的含量較低，然而被認(rèn)為對(duì)羊肉特征風(fēng)味（膻味）的影響較大[33]。試驗(yàn)中共檢測(cè)出5 種酸類物質(zhì)（丙酸、乙酸、異丁酸、丁酸和異戊酸），其中對(duì)照組只檢測(cè)出丁酸和異戊酸；發(fā)酵劑組未檢出異戊酸；乳清組和乳清+發(fā)酵劑組均檢測(cè)出5 種酸類物質(zhì)。說(shuō)明丙酸、乙酸、異丁酸是加入發(fā)酵劑才會(huì)生成的風(fēng)味物質(zhì)。乙酸主要是賦予發(fā)酵肉制品酸醋味，丁酸賦予發(fā)酵肉制品奶香風(fēng)味[11]。表2所示，乳清+發(fā)酵劑組的乙酸含量顯著高于其它組（P＜0.05）；而復(fù)合發(fā)酵劑組的丁酸含量顯著高于其它組，對(duì)照組則顯著低于其它組（P＜0.05）。

烴類物質(zhì)是由脂肪酸的烷氧基均裂形成，具有較高閾值，被認(rèn)為對(duì)肉品風(fēng)味的直接作用較小，然而對(duì)整體風(fēng)味有修飾作用[34]，試驗(yàn)中僅檢出十甲基環(huán)五硅氧烷、八甲基環(huán)四硅氧烷、間異丙基甲苯和鄰異丙基甲苯，對(duì)發(fā)酵羊肉干的整體風(fēng)味影響較小。

發(fā)酵羊肉干中還檢測(cè)出2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、茴香腦、異丙基乙烯基醚、萜品烯和β-蒎烯3；其中吡嗪具有堅(jiān)果味、烘烤味、青香、泥土香、類似土豆香等，其可以由不同的途徑生成，如還原糖和氨基酸反應(yīng)，美拉德反應(yīng)中Amadori 重排化合物的熱降解，α-氨基酸的熱降解，或α-二羰基化物和醛這2 種物質(zhì)與氨的反應(yīng)，是肉加熱過(guò)程中糖和氨基酸美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物[26]。如表2所示，對(duì)照組中并未檢測(cè)出2，3，5，6-四甲基吡嗪和β-蒎烯3；復(fù)合發(fā)酵劑組的茴香腦和萜品烯的含量均顯著高于其它3 組 （P＜0.05），乳清組的茴香腦和萜品烯的含量均顯著低于其它3 組（P＜0.05）；乳清組同時(shí)檢測(cè)出了2，3，5，6-四甲基吡嗪和2，6-二甲基吡嗪，而其它3 組都只檢測(cè)出其中1 種。

3 結(jié)論

探究了天然乳清與復(fù)合發(fā)酵劑（木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌的比例為1∶1∶2∶1） 對(duì)發(fā)酵羊肉干鹽硝酸鹽和亞硝胺殘留量以及風(fēng)味物質(zhì)形成的影響。試驗(yàn)組的亞硝酸鹽、亞硝胺含量顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明發(fā)酵劑有助于降低亞硝酸鹽、亞硝胺在羊肉干中的殘留量，其中乳清組顯著低于其它3 組（P＜0.05），使其低于國(guó)家食品安全規(guī)定的肉制品中亞硝酸鹽最高殘留標(biāo)準(zhǔn)（30 mg/kg），提高了肉干的安全性。由于蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化分解使得發(fā)酵羊肉干具有了獨(dú)特的風(fēng)味，天然乳清組可提高發(fā)酵羊肉干中風(fēng)味物質(zhì)的種類，然而復(fù)合發(fā)酵劑組和乳清+發(fā)酵劑組可提高發(fā)酵羊肉干中風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量；亞硝酸鹽的存在會(huì)產(chǎn)生部分醇類（如1-辛烯-3-醇、沉香醇），然而其會(huì)抑制醛類物質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)酮類及其它物質(zhì)影響較小?？傊?，乳清可提高肉干的風(fēng)味感官品質(zhì)和安全性。