王宏鑫，馬鳴陽(yáng)，劉衍辰，朱雪梅，牟光慶，姜淑娟，吳曉萌，錢(qián) 方

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連116034）

乳制品中含有人體必需的氨基酸和豐富的鈣、磷，是人類(lèi)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)制品，尤其對(duì)于嬰幼兒來(lái)說(shuō)，牛乳是除母乳之外的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。乳制品是引起過(guò)敏的食物之一，乳蛋白是主要過(guò)敏原。乳制品過(guò)敏是指人攝入過(guò)敏原成分后，導(dǎo)致組織或器官的損傷，從而引起的一系列臨床癥狀的免疫反應(yīng)，可分為IgE 介導(dǎo)和非IgE 介導(dǎo)兩大類(lèi)。牛乳過(guò)敏存在著巨大的危險(xiǎn)性，牛奶蛋白過(guò)敏會(huì)導(dǎo)致兒童出現(xiàn)異常反應(yīng)，影響某些器官包括皮膚、胃、腸道、呼吸系統(tǒng)等，會(huì)造成蕁麻疹、哮喘、鼻炎和過(guò)敏性休克等嚴(yán)重反應(yīng)。流行病學(xué)的研究結(jié)果顯示，乳蛋白過(guò)敏在嬰幼兒中最為普遍，發(fā)生率約為2%～6%[1]，隨著人類(lèi)基因遺傳的提高，大約有20%的嬰兒在1 歲時(shí)食用乳制品后會(huì)發(fā)生乳蛋白過(guò)敏現(xiàn)象[2]，因此研究解決乳制品過(guò)敏問(wèn)題尤為重要?，F(xiàn)階段，降敏方法包括熱加工、高壓、物理加工（如高壓微射流、輻射等）、糖基化反應(yīng)，這些處理方式雖能部分降低乳蛋白的過(guò)敏原性，但都存在不可避免的缺陷，如破壞現(xiàn)有過(guò)敏表位并產(chǎn)生新的表位、蛋白變性，影響營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。比較而言，蛋白酶水解乳蛋白的降敏效果較好，可以突破其它降敏方法的局限性，然而會(huì)產(chǎn)生苦味肽，影響口感和風(fēng)味[3]。乳酸菌發(fā)酵技術(shù)既可以有效降敏，又可以保證營(yíng)養(yǎng)成分。乳制品是傳統(tǒng)的乳品加工儲(chǔ)存方法，發(fā)酵乳制品具有口感好，易吸收，調(diào)節(jié)免疫和安全可靠的優(yōu)勢(shì)，可能是降低乳蛋白致敏性的有效方式。本文系統(tǒng)闡述發(fā)酵對(duì)乳蛋白過(guò)敏研究現(xiàn)狀，為降低乳蛋白過(guò)敏性和低致敏乳蛋白產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 過(guò)敏反應(yīng)原理

人體攝入乳制品后引起身體不適的原因有2種：乳過(guò)敏反應(yīng)或乳糖不耐受癥。這2 種病理反應(yīng)有本質(zhì)區(qū)別，乳糖不耐受癥與人體的基因有關(guān)，乳糖酶的缺乏導(dǎo)致機(jī)體不能利用乳糖，從而導(dǎo)致不良反應(yīng)的產(chǎn)生[4]。乳過(guò)敏反應(yīng)可分為IgE 介導(dǎo)和非IgE 介導(dǎo)兩大類(lèi)。牛乳過(guò)敏反應(yīng)則是由免疫球蛋白（IgE） 介導(dǎo)的I 型超敏反應(yīng)，也稱(chēng)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，它是一種免疫性疾病，包括致敏和效應(yīng)2 個(gè)階段[5]。致敏階段和過(guò)敏階段過(guò)敏原被攝入后，機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生過(guò)敏原特異性IgE 抗體，IgE 抗體與肥大細(xì)胞膜、嗜堿性粒細(xì)胞膜表面的特定受體結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。隨后再次攝入同一過(guò)敏原后，過(guò)敏原與IgE 發(fā)生橋聯(lián)，誘導(dǎo)細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯、激肽和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等一系列炎癥介質(zhì)而觸發(fā)食物過(guò)敏癥。這些介質(zhì)引起過(guò)敏反應(yīng)，表現(xiàn)為身體各部位的不同發(fā)病癥狀，如蕁麻疹、哮喘、鼻炎和過(guò)敏性休克等[6]。由于嬰兒的先天性器官發(fā)育不成熟免疫系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，在攝入乳制品后，消化系統(tǒng)不能完全消化，免疫系統(tǒng)會(huì)發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，從而導(dǎo)致嬰兒過(guò)敏現(xiàn)象的發(fā)生。非IgE 介導(dǎo)的食物過(guò)敏臨床表現(xiàn)為胃腸道功能紊亂，包括食物蛋白刺激的結(jié)腸炎，過(guò)敏性胃腸炎、乳糜瀉等。在這類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)中，由于Th2 細(xì)胞因子的釋放，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞細(xì)胞因子的缺乏，從而導(dǎo)致食物過(guò)敏[7]。

2 過(guò)敏反應(yīng)表位

食物過(guò)敏屬于免疫學(xué)中的一種變態(tài)反應(yīng)，其反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)之一就是抗原表位，因此，食物的過(guò)敏原性與抗原表位關(guān)系密切。表位（原決定因素）是免疫分子（主要是蛋白質(zhì)）的一部分，它可以與抗體互補(bǔ)的位點(diǎn)結(jié)合。蛋白結(jié)構(gòu)中的表位決定了蛋白的抗原性或者過(guò)敏原性[2]。根據(jù)過(guò)敏原表位與細(xì)胞結(jié)合的方式，可分為B 細(xì)胞表位和T 細(xì)胞表位，根據(jù)表位結(jié)構(gòu)的不同可分為連續(xù)性過(guò)敏原表位（線性表位）和不連續(xù)性過(guò)敏原表位（構(gòu)象型表位）[8]。連續(xù)表位或線性表位是由蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)中連續(xù)氨基酸殘基序列組成，不連續(xù)的表位或構(gòu)象表位由不連續(xù)的氨基酸殘基序列構(gòu)成，由于蛋白質(zhì)本身的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)折疊、聚集在一起[9]，其中一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中幾個(gè)點(diǎn)上可能包含不同的或相似的抗原表位，而只有少數(shù)具有免疫性易被免疫系統(tǒng)識(shí)別[10]，抗原表位的結(jié)構(gòu)及組成抗原表位氨基酸的理化性質(zhì)決定了它的抗原特異性[9]。過(guò)敏原被IgE 抗體識(shí)別并與之結(jié)合，引起特異性個(gè)體反應(yīng)，即過(guò)敏原性。而抗原與IgG 抗體結(jié)合產(chǎn)生抗原性[11]，許多牛乳蛋白能產(chǎn)生免疫反應(yīng)，它們或是抗原或是過(guò)敏原，或者兩者都是。

3 乳制品的過(guò)敏原及其分子特征

每100 mL 牛奶中含有約3 g 蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)至少含有25 種類(lèi)型，所有這些蛋白質(zhì)都可能作為抗原。牛奶蛋白在pH 4.6 和20 ℃下溶解后被分離成兩大類(lèi)，其中沉淀的蛋白質(zhì)組為酪蛋白，包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，第2 種蛋白質(zhì)組稱(chēng)為乳清蛋白，包括β-乳球蛋白[β-LG]、α-乳清蛋白[α-LA]、牛乳鐵蛋白、牛血清白蛋白[BSA]和牛免疫球蛋白。目前，能夠引起嬰幼兒主要的過(guò)敏現(xiàn)象的蛋白是酪蛋白（α-酪蛋白[α-CN]、β-酪蛋白[β-CN]）、β-乳球蛋白（β-LG）、α-乳清蛋白（α-LA）。表1中介紹了主要蛋白的基本信息。

表1 生牛乳蛋白主要成分及功能特征[12]Table 1 Main components and functional characteristics of milk proteins[12]

3.1 酪蛋白

酪蛋白（Casein）是哺乳動(dòng)物包括母牛、羊和人奶中的主要蛋白質(zhì)，約占牛奶總蛋白的80%，又稱(chēng)干酪素、酪朊、乳酪素。α-酪蛋白是哺乳動(dòng)物的主要蛋白，人乳常以β-酪蛋白為主要酪蛋白形式。酪蛋白不僅是嬰幼兒氨基酸的重要來(lái)源，也是鈣和磷的來(lái)源，然而酪蛋白在胃中形成凝乳消化較慢。酪蛋白為非結(jié)晶、非吸潮性物質(zhì)，常溫下在水中可溶解0.8%～1.2%，微溶于25 ℃的水和有機(jī)溶劑，溶于稀堿和濃酸中，能吸收水分，浸入水中迅速膨脹，而分子不結(jié)合，酪蛋白由位于同一染色體上的不同基因編碼，被細(xì)分為不同的家族α-酪蛋白（α-CN）（αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白）、β-酪蛋白（β-CN）和κ-酪蛋白，其中的主要過(guò)敏原是α-酪蛋白、β-酪蛋白。

3.1.1 αs1-酪蛋白 αs1-酪蛋白是牛乳蛋白中的主要成分，它是一種高度磷酸化蛋白，多數(shù)情況下每個(gè)αs1-酪蛋白上有8 個(gè)磷酸基團(tuán)存在，還有少數(shù)的含有9 個(gè)磷酸基團(tuán)。它的氨基酸序列已經(jīng)確定或者通過(guò)其它哺乳動(dòng)物的DNA 序列推斷出。所有的αs1-酪蛋白都有復(fù)雜的磷酸化作用位點(diǎn)，其中第100～110 位氨基酸殘基處是一個(gè)主要的磷酸化位點(diǎn)，磷酸化作用發(fā)生在蘇氨酸和絲氨酸殘基上，其氨基酸序列如圖1所示[13-14]。當(dāng)天冬氨酸或谷氨酸位于這一序列的第3 個(gè)位置時(shí)，這個(gè)位點(diǎn)是最主要的磷酸化位點(diǎn)。磷酸化的絲氨酸和蘇氨酸也可以成為其它絲氨酸磷酸化作用的決定因素，這些磷酸化位點(diǎn)又叫做次磷酸化位點(diǎn)，這些結(jié)構(gòu)的典型特征是6～8 個(gè)絲氨酸后連接2 個(gè)谷氨酸。牛奶中的αs1-酪蛋白存在2 個(gè)磷酸化形式，這2 種磷酸化形式中每個(gè)αs1-酪蛋白分別存在8個(gè)和9 個(gè)磷酸基團(tuán)。Cong 等[15]獲得了αs1-酪蛋白的3 個(gè)IgG 結(jié)合表位（AA21～35，AA56～70，AA161～175） 和4 個(gè)IgE 結(jié)合表位，分別為（AA126～140，AA6～20，AA171～185，AA11～25）。Ruiter 等[16]研究得到αs1-酪蛋白與T 細(xì)胞結(jié)合的表 位 （AA43～66，AA73～96，AA91～114，AA127～180）。

圖1 αs1-酪蛋白B 異構(gòu)體的氨基酸序列[17]Fig.1 Amino acid sequence of αs1-casein B isomer[17]

3.1.2 αs2-酪蛋白 αs2-酪蛋白是α-酪蛋白的重要組成成分。α-酪蛋白是由αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白以4∶1 的比例組成。與αs1-酪蛋白一樣，αs2-酪蛋白也是高度磷酸化的肽類(lèi)。牛奶中含有4 種磷酸化亞型，每個(gè)αs2-酪蛋白分別含有10，11，12，13 個(gè)磷酸化基團(tuán)。αs2-酪蛋白約占總酪蛋白的10%，在所有酪蛋白中親水性最強(qiáng)，其結(jié)構(gòu)中有3 簇帶負(fù)電的磷酸絲氨酸-谷氨酸殘基，位于8～12、56～63 和129～133 氨基酸區(qū)段，僅有C 序列的160～207 位和90～120 位2 個(gè)區(qū)域相對(duì)疏水。在αs2-酪蛋白表位研究中，Busse 等[18]定位到4 個(gè)主要IgE 結(jié)合表位 （AA83～100，AA143～158，AA15～172，AA165～188），其中（AA143～158）有1 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可以增強(qiáng)致敏性。

3.1.3 β-酪蛋白 β-酪蛋白由226 個(gè)氨基酸殘基組成，β-酪蛋白含有大量的谷氨酰胺，在N-末端附近形成了主要的磷酸化作用位點(diǎn)，β-酪蛋白磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量和磷酸化水平比α-酪蛋白少。雖然人乳中有大量β-酪蛋白，且與牛乳有較高的β-酪蛋白的相似序列，且β-酪蛋白誘導(dǎo)較強(qiáng)的IgE反應(yīng)，在牛乳β-酪蛋白中，一個(gè)完全磷酸化形式包含5 個(gè)磷酸基團(tuán)，而在其它物種的β-酪蛋白含有大量的磷酸化作用形式，如人、山羊等。在β-酪蛋白中脯氨?；≒roly-）有相當(dāng)高的頻率，因亞氨基酸形成肽鍵后，不能參與氫鍵的形成，加上其α-碳原子位于五元環(huán)上，兩側(cè)的鍵難于旋轉(zhuǎn)，不易形成α-螺旋，故脯氨酸是傾向于瓦解α-螺旋的。劉法輝[19]定位出β-酪蛋白的4 個(gè)構(gòu)象表位，如圖2所示，其中有構(gòu)象表位AA135～139 和構(gòu)象表位AA183～187。

3.2 β-乳球蛋白

如圖3所示，β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是屬于糖酵解酶家族的一種單聚球狀鈣化金屬蛋白，已被確認(rèn)為牛奶中的主要過(guò)敏原。其一級(jí)結(jié)構(gòu)為123 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為142 ku，有3個(gè)遺傳變異體。該蛋白是β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)組分，負(fù)責(zé)乳糖合成酶復(fù)合物的合成。它還與脂膜（硬脂酸和棕櫚酸）相互作用，并與鈷、鎂和鋅等金屬結(jié)合。它有4 個(gè)二硫鍵和1 個(gè)高親和力的鈣結(jié)合位點(diǎn)，以穩(wěn)定其二級(jí)結(jié)構(gòu)。牛乳β-乳球蛋白由反芻動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞合成，其含量約占乳清蛋白總量的一半左右。82%的牛乳過(guò)敏人群對(duì)β-LG 過(guò)敏[20]，其屬于Lipocalin 家族[21]，在N-端有不易被破壞的相似序列，像家族其它蛋白質(zhì)一樣在第19 位是色氨酸。天然單體β-LG 的二級(jí)結(jié)構(gòu)由1 個(gè)α-螺旋、1 個(gè)β-轉(zhuǎn)角和8 個(gè)β-反平行片層組成[22]，中心處是疏水腔。LG 屬于水溶性球狀蛋白[23]，共含有162 個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)是5.3，有5 個(gè)半胱氨酸殘基并形成2 個(gè)二硫鍵。其中第66和160 位形成位于蛋白表面的1 個(gè)二硫鍵[24]；第106 和119 形成包埋于分子內(nèi)部的1 個(gè)二硫鍵；第121 位半胱氨酸殘基不形成二硫鍵，處于游離狀態(tài)。β-LG 分子天然狀態(tài)主要以二聚體形式存在，共有11 個(gè)遺傳變異體[20]，最主要是亞型A 和B[25]，亞型A 和B 差異較小僅僅在64 位（纈氨酸ValA-丙氨酸AlaB）和118 位（天門(mén)冬氨酸AspA-甘氨酸GlyB）的氨基酸有差異[26]。自然狀態(tài)下，β-乳球蛋白免疫反應(yīng)區(qū)域的主要過(guò)敏原表41～60、102～124 與149～162 位，可被90%～100%過(guò)敏患者的血清識(shí)別：在肽鏈1～8 位、25～40 位、92～100位的表位可被50%～65%過(guò)敏患者的血清IgE 識(shí)別[27]。Selo 等[28]進(jìn)一步研究確定了β 乳球蛋白的人血清IgE 表位為肽鏈1～8、25～40、41～60、102～124與149～162 位，同時(shí)這些表位也被致敏的大鼠所識(shí)別。

圖2 β-酪蛋白氨基酸序列表位[19]Fig.2 β-casein amino acid sequence epitope[19]

圖3 β-乳球蛋白的單體的飄帶圖（α-螺旋、β 折疊和連接環(huán)被標(biāo)識(shí)出來(lái)）[29]Fig.3 A ribbon diagram of a monomer of βlactoglobulin （an α-helix，a β-sheet，and a linker are identified）[29]

3.3 α-乳清蛋白

圖4 牛乳α-乳白蛋白的晶體結(jié)構(gòu)[30]Fig.4 Crystal structure of cow's milk α-lactalbumin[30]

如圖4所示，α-乳清蛋白 （α-lactalbumin，α-LA）是屬于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白超家族的視黃醇結(jié)合蛋白，也是牛奶中的主要過(guò)敏原。它與膽固醇、維生素D2、飽和或不飽和脂肪酸、Cu2+和Fe2+離子、疏水配體（如視黃醇）結(jié)合，具有抗氧化活性。它是具有2 個(gè)主要亞型的36 ku 二聚體，其在殘基64 和118 上僅有2 點(diǎn)突變而不同。每個(gè)亞基由162 個(gè)氨基酸組成，其具有1 個(gè)游離半胱氨酸和2 個(gè)二硫鍵，該二硫鍵負(fù)責(zé)分子的二聚作用。由氨基酸的組成比例可以看出，母乳與牛乳的α-乳球蛋白存在極大的相似性，大約為72%的相似序列，因此牛乳中的乳球蛋白可以作為重要營(yíng)養(yǎng)成分供嬰兒食用。α-乳球蛋白是一種單體，以鈣結(jié)合形式存在的球狀蛋白，因?yàn)閷?duì)鈣的親和性大，所以影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[31]。對(duì)α-乳球蛋白的過(guò)敏原性研究表明，α-LA 的4 個(gè)不同線性IgE 結(jié)合肽段和IgG結(jié)合區(qū)域相重合[32]，該蛋白在脂質(zhì)蛋白超家族中具有共同特征的三級(jí)結(jié)構(gòu)，在75 ℃以上的熱處理過(guò)程中，不同線性IgE 結(jié)合肽段和IgG 結(jié)合區(qū)域中硫酸氫基-二硫鍵相互作用。β-LG 具有對(duì)酸水解的相對(duì)耐受性，以及蛋白酶活性。這些特征能夠在消化后保持一定的結(jié)構(gòu)完整性，使其通過(guò)腸粘膜吸收，并進(jìn)一步向免疫感受態(tài)細(xì)胞呈遞，在80%的人群中估計(jì)與該蛋白相關(guān)的食物過(guò)敏。在研究線性表位的過(guò)程中，Meulenbroek 等[33]在研究α-乳白蛋白T 細(xì)胞表位的線性表征時(shí)，得出了（AA19～36，AA25～42，AA31～48，AA43～60）4 個(gè)肽段，其中作為T(mén) 細(xì)胞與IgE 擁有相同的（AA19～26）結(jié)合表位。Jarvinen 等[34]研究4個(gè)結(jié)合表位（AA1～16，AA13～26，AA47～58，AA93～102） 和 3個(gè)IgG（AA7～18，AA51～61，AA89～108）的結(jié)合表位，其中共有的結(jié)合表位是AA7～18 和AA51～58。

4 常用檢測(cè)乳制品過(guò)敏原手段

4.1 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)

酶聯(lián)免疫分析技術(shù)（ELISA）的原理是將抗原或抗體吸附于固相載體上，加入待檢測(cè)樣品和酶結(jié)合物反應(yīng)后，再利用酶催化其底物呈色的反應(yīng)，來(lái)檢測(cè)抗體或抗原的方法。通常ELISA 測(cè)定方法包括間接法、雙抗體夾心法和抗原競(jìng)爭(zhēng)法。

4.2 生物傳感器

生物傳感器被認(rèn)為是新出現(xiàn)的過(guò)敏原檢測(cè)工具，因?yàn)樗鼈兪强焖?、可重?fù)和高度敏感的方法，具有很大的自動(dòng)化潛力。簡(jiǎn)而言之，生物傳感器是基于直接識(shí)別受體（抗體或探針）與目標(biāo)分子（蛋白質(zhì)或DNA）之間的生物相互作用，通過(guò)傳感器產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)。

4.3 圓二色光譜

圓二色光譜（CD）能夠用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊以及無(wú)規(guī)卷曲，廣泛應(yīng)用于觀察過(guò)敏原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊情況[14]。此外，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的方法有熒光光譜和核磁共振2 種方法，是用于蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法[16]。

4.4 氨基酸分析

氨基酸分析（Amino acid analysis）是用酶解的方法將肽鏈打開(kāi)，形成單一的氨基酸殘基，用于鑒定純化的蛋白質(zhì)，檢測(cè)基本的初級(jí)結(jié)構(gòu)[35]。雖然氨基酸分析的功能和檢測(cè)效果具有極強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，但缺點(diǎn)是硬件配置復(fù)雜，用途狹窄，靈活性差，分析檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，破壞氨基酸的固有結(jié)構(gòu)，費(fèi)用高昂，不適合作為常規(guī)使用技術(shù)。

4.5 聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是特異性DNA 片段擴(kuò)增的一種檢測(cè)方法，有實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和普通PCR 兩種方法。普通PCR 主要用于模板DNA 的定性檢測(cè)，擴(kuò)增后需電泳驗(yàn)證結(jié)果，缺點(diǎn)是容易發(fā)生污染，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，用于目的DNA 的定量檢測(cè)，優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)過(guò)程自動(dòng)化程度高，無(wú)需電泳驗(yàn)證就可得到理想的試驗(yàn)結(jié)果，使用探針提高了擴(kuò)增特異性及靈敏性。

5 乳酸菌發(fā)酵乳制品致敏性的研究

乳酸菌不僅是發(fā)酵乳品中的主要微生物，且在新鮮人乳、牛乳、羊乳中天然存在，被報(bào)道具有多種功能。目前，已有大量報(bào)道乳酸菌發(fā)酵乳制品具有預(yù)防和緩解過(guò)敏癥狀的作用，乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中微生物產(chǎn)生蛋白酶，水解牛乳蛋白，破壞抗原表位而降低食品致敏性[36]。乳品經(jīng)發(fā)酵后，乳蛋白的消化率提高而進(jìn)一步降敏[37-38]，是同熱加工等常見(jiàn)加工等效甚至更有效的降敏手段。

表2列出不同乳桿菌發(fā)酵對(duì)乳制品過(guò)敏原影響的研究。Kalliom?ki 等[47]、Nakae 等[48]和Strachan等[49]對(duì)新生嬰兒乳蛋白過(guò)敏現(xiàn)象的研究發(fā)現(xiàn)，證實(shí)特應(yīng)性皮炎AD 呈現(xiàn)雙歧桿菌SDSL 桿菌菌數(shù)的變化，結(jié)果顯示，腸道菌群的變化隨著宿主變應(yīng)性疾病和疾病的活動(dòng)性變化而變化，呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)，并且受疾病程度和過(guò)程的影響。Wroblewska等[50]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌發(fā)酵乳蛋白可顯著降低乳清蛋白的免疫反應(yīng)性和致敏性。模擬發(fā)酵乳在消化過(guò)程的第3 階段進(jìn)一步降低了過(guò)敏原的免疫反應(yīng)性，證實(shí)了環(huán)丙烷-脂肪-?；字铣擅负汪然愤B接酶與人 IgE 抗體發(fā)生反應(yīng)。Jedrychowski[51]用復(fù)合菌株（噬溫乳酸菌、嗜熱乳酸菌）發(fā)酵牛乳，測(cè)定乳清蛋白抗原性，其中β-LG和α-LA 的抗原降低率在90%以上。Wroblewska等[50]研究中用乳酸菌發(fā)酵的乳制品，乳清蛋白中β-LG 和α-LA 致敏性均降低，這一結(jié)果與Jedrychowski[51]的研究成果保持一致。Kleber 等[52]分別用乳酸菌發(fā)酵脫脂乳和甜乳清24 h 左右，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵對(duì)降低β-乳球蛋白的抗原性有協(xié)同效果。Ehn 等[53]采用瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳，發(fā)現(xiàn)β-LG含量降低。

Wroblewska 等[50]研究表明乳酸菌發(fā)酵后的乳清蛋白、酪蛋白的免疫反應(yīng)能力明顯下降，而模擬消化后的乳清蛋白、酪蛋白的免疫反應(yīng)性甚至更高。雖然α-酪蛋白免疫反應(yīng)性降低了21%，但這種蛋白仍然是最具反應(yīng)性的，這是由于抗酶特異性血清IgE 的濃度高于抗α-LA 和抗β-LG，由于患者對(duì)酪蛋白和乳清蛋白敏感。

乳酸菌的種類(lèi)、發(fā)酵和貯藏條件也可以解釋過(guò)敏原性的變化。陳帥等[54]用干酪乳酸菌WPC09發(fā)酵乳制品，其β-LG 下降了70%左右。李艾梨等[55]采用小鼠實(shí)驗(yàn)說(shuō)明乳酸菌能有效降低β-LG 含量，從而降低過(guò)敏癥狀。李海紅[56]研究了5 種乳桿菌（植物乳桿菌LpYZU09、干酪乳桿菌LcYZU02、鼠李糖乳桿菌LrGG、發(fā)酵乳桿菌LfYZUl5 及戊糖片球菌PpYZU32），采用5 種乳桿菌表面蛋白的提取物對(duì)小鼠鼠腸上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞的粘附抑制作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，菌株LrGG 表面蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞粘附5 種菌體普遍顯示了較強(qiáng)的抑制作用，抑制率為38.7%～76.0%，證明乳酸菌表面蛋白對(duì)粘附腸上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞有重要作用。同菌株表面蛋白對(duì)腸上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖指數(shù)為0.05～0.35，巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)增殖指數(shù)為0.05～0.42，對(duì)脾細(xì)胞誘導(dǎo)增殖指數(shù)為0.02～0.40。結(jié)果顯示誘導(dǎo)效應(yīng)具有菌株和劑量依賴性，表明乳酸菌表面蛋白在激活腸上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用。Chatchatee 等[13]研究了24 名對(duì)乳制品過(guò)敏的兒童血清，對(duì)血清及重疊的肽鏈明確了酪蛋白的6 個(gè)主要的IgE 表位和5 個(gè)主要IgG 表位，在酪蛋白發(fā)生變性或者分解的情況下，過(guò)敏表位才能與抗體接觸，可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)。吳愛(ài)娟等[57]用高產(chǎn)蛋白乳桿菌RA3，酶活達(dá)38.87 U/mL 的菌株發(fā)酵酸奶后β-LG 抗原性降低了75.2%。

6 發(fā)酵乳品的降敏機(jī)理

6.1 益生菌降敏

益生菌有助于平衡腸道微生物菌群，是活的非致病性微生物，在適量范圍內(nèi)有助于人類(lèi)健康。益生菌的功效是通過(guò)表面分子蛋白用于特異性表達(dá)，形成各種組分并相互作用。不同菌種的益生菌作用不同，利用不同的作用機(jī)制，不同菌株使用劑量不同，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)不同。益生菌發(fā)揮最佳效果是腸道微生物存在于腸表面粘液層的時(shí)候，影響腸道免疫系統(tǒng)，對(duì)腸道病原體具有清除作用，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)提供抗氧化劑、抗誘變劑。益生菌的優(yōu)勢(shì)在于其表面含有多種微生物相關(guān)分子模式，可優(yōu)先與巨噬細(xì)胞的表面識(shí)別受體結(jié)合，通過(guò)接頭分子調(diào)節(jié)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而改善胃腸道生理機(jī)能，來(lái)預(yù)防或緩解過(guò)敏。

6.2 蛋白酶降敏

源來(lái)獻(xiàn)[37][37][39][40][41][41][42][43][44][45][45][45][46]文究研的響影原敏過(guò)品制奶對(duì)酵發(fā)行進(jìn)菌桿乳同不用采2表Study on the effect of different Lactobacillus fermentation on the allergens of dairy products Table 2 性原抗性敏致法方定測(cè)/件條熟后和酵發(fā)原敏過(guò)種菌酵發(fā)著顯長(zhǎng)延的間時(shí)隨性原抗，α-LA升上度濃酸基，氨3.72到降下6.5從值pH，0～36 h 37 ℃、、β-CN、α-LA β-LG H9菌桿乳酪干副大后，隨值大最到達(dá)4 h酵發(fā)在性原抗，β-LG加增微輕有會(huì)后24 h，在低降α-CN低降會(huì)、α-CN，β-CN值低最到達(dá)并低降度幅抗，α-LA動(dòng)波量含酸基，氨3.70到降下3.96從值pH中，0～21 d中程過(guò)藏冷，-20 ℃0～21 d后酵發(fā)，值高最到達(dá)性原，抗后14 d藏冷），β-CN 24.60%到（達(dá)升上性動(dòng)波呈性原，56.43%，42.92%19.7%降下別分性原抗、β-LG、α-CN。β-CN降下期后小變度強(qiáng)解水后，隨解酵生發(fā)3 h前的后酵發(fā)株菌在β-LG液效高相反和Tricine SDS-PAGE β-LG和種亞菌桿乳氏德測(cè)檢法方RP-HPLC譜色相桿乳亞利加保CRL656菌，37.02%，67.69%，59.88%68.07%為別分率原還的、α-CN、β-CN、α-LA β-LG法附吸疫免聯(lián)酶爭(zhēng)競(jìng)接間、、β-CN、α-LA β-LG 1134菌桿乳酪干α-CN低降性原抗件條，按性敏致的白蛋有所低降0.5 d藏，冷12 h酵發(fā)、、β-CN、β-LG ALA GG菌桿乳糖李鼠α-CN性原應(yīng)變的質(zhì)白蛋有所低降、、β-CN、α-LA β-LG菌桿乳酪干α-CN低降性原應(yīng)變?chǔ)?CN、α-CN 的導(dǎo)誘酶白A75 蛋阿菌桿乳士瑞法附吸疫免聯(lián)酶A75 β-CN、α-CN阿菌桿乳士瑞低降性原抗的、β-LG ALA 0.5 d藏，冷6 h酵發(fā)、β-LG ALA熱嗜和菌桿乳士瑞菌球鏈留殘?jiān)?1.68%，α-LA 抗至降99.85%下由量留殘?jiān)?，?LG 抗12 h 后酵發(fā)在37 ℃，0～50 h β-LG、α-LA菌桿乳亞利加保72.78%至降96.35%下由量到低降量留殘?jiān)?，?LA 59.64%到低降量留殘?jiān)梗?LG后12 h酵發(fā)在，0～50 h 37 ℃、α-LA β-LG熱嗜和菌桿乳士瑞66.95%菌球鏈上量少了現(xiàn)50%，12～50 h 出到降下度幅大量留殘0～12 h，β-LG 的β-LG 在37 ℃，0～50 h β-LG、α-LA菌桿乳士瑞期穩(wěn)平現(xiàn)75%，12～50 h 出到降下量留殘0～12 h 內(nèi)；α-LA 在升，β-5%降下性原抗α-LA后，7 d降下慢緩性原抗長(zhǎng)延的間時(shí)藏冷隨α-LA藏冷-4 ℃、α-CN A75 β-CN阿菌桿乳士瑞化變顯明無(wú)并LG到達(dá)低降性原，抗后24 h酵，發(fā)快最低降性原抗中6～16 h在性原抗的β-LG 37 ℃，24 h β-LG菌桿乳酪干之，pH 6.0～6.5 35 ℃度溫佳最的性原抗的β-LG低降在株菌；WPC09 74.1%WPC 09值pH適最性原抗的白蛋球乳β-LG低降，其71.8%到低降性原抗，β-LG間，pH 4.0～10.0，0～36 h；37 ℃6.5為

利用生物蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行特異位點(diǎn)切割，通過(guò)斷裂蛋白肽鍵，將過(guò)敏蛋白質(zhì)水解成小分子肽段，降低分子質(zhì)量，或是通過(guò)改變過(guò)敏原表位的三級(jí)結(jié)構(gòu)，切除過(guò)敏原蛋白表面的一些表位作用，從而達(dá)到降低致敏性的效果。乳清蛋白包括β-乳球蛋白和α-乳白蛋白2 種主要過(guò)敏原蛋白。沈小琴等[58]研究了7 種生物酶水解乳清蛋白，結(jié)果顯示由于堿性蛋白酶的酶切位點(diǎn)在疏水性氨基酸的羧基上，而乳清中有大量的疏水性氨基酸，從而堿性蛋白酶能夠大量破壞上述結(jié)合表位，因此堿性蛋白酶對(duì)降低抗原性有最大作用。Kim 等[59]發(fā)現(xiàn)經(jīng)100 ℃熱處理后的乳清用胃蛋白酶和胰蛋白消化，可以降低乳清蛋白的抗原性，這是因?yàn)檫@2種酶存在乳蛋白的酶切位點(diǎn)。

7 低致敏性的發(fā)酵乳制品

近年來(lái)，有關(guān)低致敏發(fā)酵乳制品的相關(guān)研究表明，發(fā)酵乳制品可減輕一些遺傳性過(guò)敏的癥狀，延緩其病癥的發(fā)展。利用乳酸菌生產(chǎn)不同類(lèi)型發(fā)酵乳制品，如利用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌生產(chǎn)酸奶，利用嗜熱鏈球菌生產(chǎn)奶酪，利用副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌生產(chǎn)暢意酸乳，都可作為乳過(guò)敏患者食用的乳制品。郭鸰等[60]采用1 株瑞士乳桿菌為發(fā)酵劑，在10%的脫脂乳中添加瑞士乳桿菌發(fā)酵制備低致敏乳蛋白，結(jié)果表明發(fā)酵生產(chǎn)低致敏乳源蛋白可以降低乳蛋白致敏性。Majamaa 等[61]研究牛奶過(guò)敏的嬰兒食用乳酸菌發(fā)酵的乳清蛋白后，嬰兒的疾病腸道炎癥能得到有效緩解。目前，國(guó)內(nèi)企業(yè)及相關(guān)研究機(jī)構(gòu)可通過(guò)菌種發(fā)酵生產(chǎn)高脫敏率的發(fā)酵型產(chǎn)品，以提高乳制品的附加值。

8 結(jié)論與展望

本文概述了生牛乳過(guò)敏蛋白 （αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-乳球蛋白[β-LG]、α-乳清蛋白[α-LA]）的蛋白結(jié)構(gòu)以及過(guò)敏機(jī)理，并指出引起人過(guò)敏的主要蛋白為α-乳清蛋白、β-乳球蛋白，過(guò)敏是由于機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生過(guò)敏原特異性IgE 抗體，IgE 抗體與肥大細(xì)胞膜、嗜堿性粒細(xì)胞膜表面的特定受體結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。隨后再次攝入同一過(guò)敏原后，過(guò)敏原與IgE 發(fā)生橋聯(lián)，誘導(dǎo)細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯、激肽和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等一系列炎癥介質(zhì)而觸發(fā)食物過(guò)敏癥。由于牛乳蛋白過(guò)敏受影響最大的人群是嬰幼兒，消除和緩解嬰幼兒的牛乳過(guò)敏問(wèn)題對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。通過(guò)適當(dāng)?shù)氖称芳庸ぜ夹g(shù)降低牛奶蛋白的致敏性成為研究熱點(diǎn)。發(fā)酵生牛乳是有效降低嬰幼兒乳制品過(guò)敏問(wèn)題的常用手段，一方面乳酸菌本身就具有預(yù)防和降低致敏的作用，日常膳食中使用發(fā)酵食品可有效預(yù)防過(guò)敏，減輕過(guò)敏癥狀；另一方面在微生物發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌會(huì)產(chǎn)生導(dǎo)致乳蛋白降解的蛋白酶水解乳蛋白過(guò)敏原表位而降低致敏性。

研究發(fā)現(xiàn)降低致敏性的菌種包括副干酪乳桿菌H9、德氏乳桿菌亞種、保加利亞乳桿菌CRL656、干酪乳桿菌1134、鼠李糖乳桿菌GG、瑞士乳桿菌阿A75、干酪乳桿菌WPC 09 等，在37℃，24 h 條件下發(fā)酵和4 ℃，24 h 的后熟條件下，產(chǎn)生蛋白酶對(duì)牛奶蛋白適當(dāng)酶解，顯著降低不同類(lèi)型乳蛋白的致敏性。乳桿菌發(fā)酵結(jié)合其它加工手段可以降低致敏性，發(fā)酵前熱處理樣品或酶水解樣品可以使發(fā)酵效果更好，得到的產(chǎn)品致敏性更低，并且可以通過(guò)發(fā)酵解決熱處理產(chǎn)生蒸煮味等問(wèn)題。