沈和平 官俏兵 楊毅 郭麗 盛泳佳 韓晨陽

研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥在絕大多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病（缺血性卒中、帕金森病、阿爾茨海默病、腦白質(zhì)病變等）中扮演著重要的角色[1-2]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦組織中常駐的免疫細(xì)胞，在炎癥發(fā)生過程中快速活化，通過其表型的變化發(fā)揮促炎和抗炎的作用[3-4]。正常生理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞可以清除死亡的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)；但是小膠質(zhì)細(xì)胞短期的過度活化將會(huì)引起神經(jīng)炎癥，從而損傷神經(jīng)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞活化后可分為M1型和M2型兩種[5-6]。M1型為經(jīng)典的活化型，它是由IFN-γ或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)產(chǎn)生的[7]，主要發(fā)揮促炎作用；而M2型正好相反，它是由IL-4和IL-13誘導(dǎo)產(chǎn)生的，主要發(fā)揮抗炎作用[8]。IL-1β是M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的主要炎癥因子[9]，但是其如何發(fā)揮促炎作用尚未闡明。IL-1β是一種具有多種生物活性的物質(zhì)，不僅可作用于周圍神經(jīng)細(xì)胞，也可作用于免疫細(xì)胞，目前尚未發(fā)現(xiàn)IL-1β對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞有何作用。因此，本研究主要探討IL-1β促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型活化的作用和機(jī)制，為神經(jīng)炎癥發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制探索提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2細(xì)胞系（武漢普諾賽生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：CL-0493）；LPS（美國 Sigma 公司分裝）；IL-6（批號(hào)：H007）、TNF-α（批號(hào)：H052）的ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒（比色法檢測(cè)，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A01301）；前列腺素G2（prostaglandin，PEG2）（美國 Abcam 公司，批號(hào)：133065）；CD86的免疫熒光抗體（美國Abcam公司，批號(hào)：209896）；免疫熒光染色試劑盒（美國Sangon Biotech公司，批號(hào)：670005）；M1型標(biāo)志蛋白單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）、趨化因子 8（chemokines-8，CXCL-8）的表達(dá)以及酪氨酸激酶（janus kinase 1，JAK1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白 1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）、磷酸化的JAK1（p-JAK1）、磷酸化的 STAT1（p-STAT1）的單克隆抗體（美國 CST 公司，批號(hào)：41987、10886、74129、9167、50996、14995）；JAK1抑制劑 IN-7（上海 MCE 公司，批號(hào)：126296）；重組人 IL-1β（美國 Sangon Biotech 公司，批號(hào)：600002）。

1.2 小膠質(zhì)細(xì)胞的處理及分組 BV2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，分為對(duì)照（Control）組、LPS 組、LPS+IL-1β 組。Control組常規(guī)培養(yǎng)；LPS組用終濃度為1 mg/L的LPS處理；LPS+IL-1β組先用15 μg/L的IL-1β預(yù)處理6 h，再用終濃度為1 mg/L的LPS處理。LPS的處理時(shí)間為24 h。IN-7處理實(shí)驗(yàn)中，將BV2細(xì)胞分為L(zhǎng)PS組、LPS+IL-1β 組、LPS+IL-1β+IN-7組，其中 LPS+IL-1β+IN-7組在IL-1β處理前6 h用0.5 μmol/L IN-7預(yù)處理，阻斷JAK1，其余處理同前。

1.3 培養(yǎng)基中IL-6、TNF-α、NO和 PEG2表達(dá)水平檢測(cè) 培養(yǎng)基中IL-6、TNF-α和PEG2表達(dá)水平檢測(cè)采用ELISA法，NO表達(dá)水平檢測(cè)采用比色法。LPS干預(yù)BV2 細(xì)胞后，在 3、6、12、18、24 h 取培養(yǎng)基，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度（A），以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)A帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程式，計(jì)算培養(yǎng)基中細(xì)胞因子水平，結(jié)果以ng/L表示。

1.4 BV2細(xì)胞中CD86熒光染色實(shí)驗(yàn) 采用細(xì)胞爬片法進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光染色。將蓋玻片置于6孔板中，接種BV2細(xì)胞后待細(xì)胞長(zhǎng)至70%，LPS處理后，用新鮮配置的4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。PBS洗3次后用0.2%的Triton X-100進(jìn)行透化處理10 min，2% BSA封閉30 min，單克隆抗體1∶300稀釋后進(jìn)行室溫孵育1 h，PBS洗3次后，加入IgG抗體進(jìn)行標(biāo)記孵育。最后用0.5 mg/L DAPI染色試劑進(jìn)行細(xì)胞核染色，PBS洗2次后加封片，熒光顯微鏡下觀察，以熒光強(qiáng)度表示。

1.5 MCP-1、CXCL-8及JAK1-STAT1信號(hào)蛋白JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。收集細(xì)胞用PBS洗2次后加入預(yù)冷的1.0 ml RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，10 000 g轉(zhuǎn)速下離心15 min，BCA試劑盒蛋白定量，用5×loading buffer煮沸8 min后進(jìn)行電泳，PVDF膜使用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST稀釋單克隆抗體一抗，孵育后PVDF膜用TBST洗2次后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育。孵育完成后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，采用Image Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行光密度的分析，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白光密度值的比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組培養(yǎng)基中IL-6、TNF-α、NO和PEG2表達(dá)水平比較 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Control組培養(yǎng)基中 IL-6、TNF-α、NO和PEG2表達(dá)水平并無顯著變化，且處于低水平。LPS組和LPS+IL-1β組培養(yǎng)基中IL-6、TNF-α、NO和PEG2表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均上調(diào)（均P＜0.05）；與Control組比較，LPS組和LPS+IL-1β組培養(yǎng)基在 3、6、12、18、24 h 時(shí) IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2表達(dá)水平均上調(diào)（均 P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+IL-1β 組培養(yǎng)基在 3、6、12、18、24 h 時(shí) IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0.05），見圖1。

圖1 各組培養(yǎng)基中IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PEG2）表達(dá)水平比較[與Control組比較，*P＜0.05；與脂多糖（LPS）組比較，△P＜0.05]

2.2 各組細(xì)胞中CD86熒光強(qiáng)度比較 與Control組比較，LPS組和LPS+IL-1β組細(xì)胞中CD86熒光強(qiáng)度均上調(diào)（均P＜0.05）。與LPS組比較，LPS+IL-1β組細(xì)胞中CD86熒光強(qiáng)度上調(diào)（P＜0.05），見圖 2（插頁）。

圖2 各組細(xì)胞中CD86熒光強(qiáng)度比較（LPS為脂多糖）

2.3 各組細(xì)胞中MCP-1、CXCL-8及JAK1-STAT1信號(hào)蛋白表達(dá)水平比較 與Control組比較，LPS組和LPS+IL-1β 組細(xì)胞中 MCP-1、CXCL-8、JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+IL-1β 組細(xì)胞中 MCP-1、CXCL-8、JAK1、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0.05），見圖3。

圖3 各組細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、趨化因子8（CXCL-8）及酪氨酸激酶（JAK1）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1（STAT1）表達(dá)水平比較[p-JAK1為磷酸化的JAK1；p-STAT1為磷酸化的STAT1；與Control組比較，*P＜0.05；與脂多糖（LPS）組比較，△P＜0.05]

2.4 抑制JAK1后，各組培養(yǎng)基中IL-6、TNF-α、NO和PEG2表達(dá)水平比較 IN-7預(yù)處理后，與LPS組和LPS+IL-1β 組比較，LPS+IL-1β+IN-7 組培養(yǎng)基在 3、6、12、18、24 h 時(shí) IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2表達(dá)水平均下調(diào)（均 P＜0.05），見圖 4。

圖4 抑制酪氨酸激酶（JAK1）后，各組培養(yǎng)基中IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PEG2）表達(dá)水平比較[與脂多糖（LPS）組比較，*P＜0.05；與 LPS+IL-1β 組比較，△P＜0.05]

2.5 抑制JAK1后，各組細(xì)胞中CD86熒光強(qiáng)度比較IN-7預(yù)處理后，與LPS組和LPS+IL-1β組比較，LPS+IL-1β+IN-7組細(xì)胞中CD86熒光強(qiáng)度下調(diào)（均P＜0.05），見圖 5（插頁）。

圖5 抑制酪氨酸激酶（JAK1）后，各組細(xì)胞中CD86熒光強(qiáng)度比較（LPS為脂多糖）

2.6 抑制JAK1后，各組細(xì)胞中MCP-1、CXCL-8及JAK1-STAT1信號(hào)蛋白表達(dá)水平比較 IN-7預(yù)處理后，與LPS組和LPS+IL-1β組比較，LPS+IL-1β+IN-7組細(xì)胞中 MCP-1、CXCL-8、JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達(dá)水平均下調(diào)（均P＜0.05），見圖6。

圖6 抑制酪氨酸激酶（JAK1）后，各組細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、趨化因子8（CXCL-8）及JAK1-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（STAT1）表達(dá)水平比較[p-JAK1為磷酸化的JAK1；p-STAT1為磷酸化的STAT1；與脂多糖（LPS）+IL-1β組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，△P＜0.05]

3 討論

神經(jīng)炎癥是神經(jīng)系統(tǒng)接收外界信號(hào)產(chǎn)生的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)，是機(jī)體防御系統(tǒng)啟動(dòng)的標(biāo)志[10]。在神經(jīng)炎癥中，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放過度的炎癥因子，在疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[11]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的一類，也是發(fā)揮神經(jīng)炎癥的主要細(xì)胞之一。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞是一種巨噬細(xì)胞，可以分為M0、M1、M2型[12]。M0是小膠質(zhì)細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)，而M1和M2是激活態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞。M1細(xì)胞主要發(fā)揮識(shí)別、趨化和吞噬的功能，然而小膠質(zhì)細(xì)胞過度的激活可以大量釋放TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。其機(jī)制和IL受體等信號(hào)激活有關(guān)，所以M1型巨噬細(xì)胞也是促炎細(xì)胞。其中IL-1β是巨噬細(xì)胞主要釋放的促炎因子之一，有著多種病理生理功能[13]。而M2型細(xì)胞正好相反，主要起到抗炎的作用[14]，在神經(jīng)炎癥的發(fā)生、發(fā)展中M1/M2的平衡和轉(zhuǎn)化是至關(guān)重要的。

既往研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β是最重要的炎癥因子，它可以誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和黏附因子，進(jìn)一步增強(qiáng)慢性炎癥的進(jìn)展[15]。IL-1β對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞具有自分泌的作用，能上調(diào)IL-6和TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的增生[15-16]，也可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡。因此，可以說IL-1β是通過小膠質(zhì)細(xì)胞自分泌后影響神經(jīng)細(xì)胞及周圍細(xì)胞。但是在神經(jīng)炎癥中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化是級(jí)聯(lián)放大的，所以分泌的IL-1β是否通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化發(fā)揮作用也尚未可知。為了探明IL-1β對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用，本實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型活化，LPS是M1型激活的經(jīng)典激活劑，可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型激活，其中M1型標(biāo)志物IL-6、TNF-α、NO和PEG2的表達(dá)水平上調(diào)，而未經(jīng)過LPS刺激的對(duì)照組細(xì)胞IL-6、TNF-α、NO和PEG2的表達(dá)未見明顯變化。值得注意的是，當(dāng)用IL-1β 預(yù)處理 BV2細(xì)胞后，IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2等表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)，同時(shí)免疫熒光的結(jié)果也顯示CD86的表達(dá)上調(diào)，明顯高于單一LPS誘導(dǎo)。CD86是M1型細(xì)胞膜表面標(biāo)志物，它的表達(dá)水平增高，說明了BV2向M1進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。因此，從表型轉(zhuǎn)化的角度來看，IL-1β可以輔助LPS促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的M1型活化。

小膠質(zhì)細(xì)胞的活化受到多條信號(hào)通路的調(diào)控，其中JAK1-STAT1是主要的調(diào)控信號(hào)。IFN-γ和LPS是誘導(dǎo)M1型活化的重要內(nèi)源性物質(zhì)，在JAK1信號(hào)中，STAT1的激活是M1活化的關(guān)鍵信號(hào)[17-19]。LPS和IFN-γ通過激活p-JAK1激活了p-STAT1，從而誘導(dǎo)信號(hào)的傳遞。而在本研究中也發(fā)現(xiàn)IL-1β可以進(jìn)一步激活JAK1-STAT1的激活，表現(xiàn)為p-JAK1和p-STAT1的表達(dá)上調(diào)，且明顯高于單一的LPS誘導(dǎo)。為了明確IL-1β是否通過該信號(hào)，本實(shí)驗(yàn)采用IN-7進(jìn)行JAK1的阻斷，結(jié)果顯示，當(dāng)JAK1阻斷后，IL-1β的作用受到了抑制，M1型標(biāo)志分泌因子IL-6、TNF-α、NO和PEG2的表達(dá)水平下調(diào)，甚至低于單一LPS組，這是因?yàn)長(zhǎng)PS通過促進(jìn)JAK1信號(hào)激活發(fā)揮作用，當(dāng)JAK1信號(hào)受到抑制后，LPS自然無法發(fā)揮作用。同時(shí)免疫熒光染色結(jié)果也顯示CD86的表達(dá)水平下調(diào)。其標(biāo)志物MCP-1和CXCL-8的表達(dá)下調(diào)[20]，JAK1信號(hào)中關(guān)鍵因子p-STAT1的表達(dá)下調(diào)。所以該實(shí)驗(yàn)證明IL-1β促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1活化是激活了JAK1-STAT1信號(hào)發(fā)揮作用的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β可以輔助小膠質(zhì)細(xì)胞的M1型活化，其作用機(jī)制是通過JAK1-STAT1信號(hào)發(fā)生的。這是神經(jīng)炎癥中IL-1β發(fā)揮作用的新機(jī)制，為神經(jīng)炎癥的研究提供了新的思路和參考。