越安琪，羅卉卉，黃衛(wèi)平，陳登權(quán)，金素鈺，黃 林，鄭玉才

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041；2.四川省涼山州畜牧獸醫(yī)研究所，四川 西昌615400）

乳是新生后代最主要的營養(yǎng)源，對后代早期生長發(fā)育至關(guān)重要。有關(guān)乳的研究在牛乳和人乳上的報(bào)道很多，并涉及營養(yǎng)學(xué)、免疫學(xué)等廣泛的研究內(nèi)容［1，2］。國內(nèi)對豬乳的研究報(bào)道相對較少。李衛(wèi)真等［3］采用電泳方法對二花臉豬乳蛋白組分進(jìn)行了分析；豬乳中常規(guī)營養(yǎng)成分和激素含量分析也有一些報(bào)道［4，5］；秦宜德等［6，7］、Qin等［8］對豬乳中一組高分子量蛋白進(jìn)行了較深入的研究，涉及這組蛋白質(zhì)的多態(tài)性、與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)、純化和鑒定等，但通過分離純化和部分測序等方法，仍無法確定該蛋白的種類；張水斌等［9］還對豬乳中上皮黏蛋白的多態(tài)性進(jìn)行了分析；國外對豬乳的研究較多［10-12］。

凝膠電泳上顯示的豬乳蛋白質(zhì)組成與牛乳有明顯差異［3］，很多蛋白質(zhì)難以通過圖譜比較進(jìn)行定性，影響了對豬乳的功能研究?？紤]到豬乳研究對中國養(yǎng)豬業(yè)的實(shí)際意義，以及質(zhì)譜方法在蛋白質(zhì)研究中的重要技術(shù)支持［13］，本研究采用電泳技術(shù)分離豬乳中的蛋白質(zhì)，并利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）的方法對豬乳中幾種蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，為更好地認(rèn)識豬乳的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 豬乳的采集與處理

于夏季在四川省西昌市某豬場選取健康的大白豬（Sus scrofa）8頭，試驗(yàn)豬處于泌乳中期。在每頭豬的頸部肌肉注射20 IU催產(chǎn)素，約10 min后分別手工擠乳于大離心管中，冰凍后用冰瓶帶回實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱保存。

將冰凍的豬乳解凍后混勻，以3 000 g于4℃離心15 min去除乳脂，取中間的脫脂乳分裝于EP管中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 脫脂乳中蛋白質(zhì)含量測定

豬脫脂乳用去離子水適當(dāng)稀釋后，用Bradford染料結(jié)合分析法測定脫脂乳中蛋白質(zhì)含量［14］，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3 脫脂乳蛋白電泳

電 泳 參 照Laemmli［15］的 方 法，用MP3電 泳 槽（Bio-Rad，USA）采用12.5%的分離膠SDS-PAGE，在變性條件下分離豬脫脂乳蛋白，每孔上樣4μg乳蛋白。電泳凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）拍照。

1.4 脫脂乳中3種蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

將凝膠上分子質(zhì)量在14.4 kD～20.0 kD的3條電泳條帶用干凈的手術(shù)刀片切下置于EP管中，由武漢金凱瑞生物工程有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。首先對凝膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行烷基化和酶解，即加入終濃度10 mmol/L的二硫蘇糖醇還原蛋白質(zhì)，再加入55 mmol/L碘乙酸銨烷基化，最后加入1μg胰蛋白酶過夜酶解；酶解產(chǎn)物用C18柱脫鹽，真空干燥后用15μL上樣緩沖液（0.1%甲酸，3%乙腈）溶解多肽；多肽混合物再用LC-MS/MS（eskperTMnanoLC，AB SCIEX Triple TOF 5600-plus）分離和鑒定；串聯(lián)質(zhì)譜獲得的數(shù)據(jù)用質(zhì)譜儀中的Proteinpilot軟件進(jìn)行分析，檢索數(shù)據(jù)庫為uniprot-taxonomy_Sus scrofa_190507_fas?ta和uniprot-taxonomy_Bos taurus_190507_fasta，設(shè)置的可信度≥95%，unique peptides≥1。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬乳蛋白的電泳

豬脫脂乳蛋白在12.5%的SDS-PAGE上獲得較好的分離（圖1）。由圖1可知，不同個(gè)體蛋白質(zhì)組成接近，能顯示15種左右的蛋白質(zhì)，并在很寬的分子質(zhì)量范圍內(nèi)分布。凝膠上可見豬乳中特有的1種高分子量蛋白（HMWP），酪蛋白比例較低，各種蛋白質(zhì)組分的相對含量存在個(gè)體差異。

2.2 豬脫脂乳中3種蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

對圖1中分子量在14.4 kD～20.0 kD的3條蛋白質(zhì)區(qū)帶進(jìn)行二級質(zhì)譜鑒定，均獲得了多種可能的蛋白質(zhì)，相關(guān)鑒定信息見表1。根據(jù)比對得分并結(jié)合分子量等信息，2種蛋白質(zhì)分別為β-乳球蛋白（β-LG）和乳清酸蛋白（WAP），但有1種蛋白質(zhì)（樣品號為B）未獲得可信的鑒定結(jié)果，相關(guān)信息見表2。

圖1 大白豬脫脂乳蛋白的SDS-PAGE

表1 二級質(zhì)譜鑒定信息統(tǒng)計(jì)

表2 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定相關(guān)信息

3 討論

豬乳中的蛋白質(zhì)是影響其營養(yǎng)價(jià)值的主要組分之一。本研究表明，在SDS-PAGE凝膠上，顯示的豬乳蛋白質(zhì)組成明顯不同于牛乳，其中酪蛋白比例相對較低。李衛(wèi)真等［3］報(bào)道，二花臉豬初乳中酪蛋白占總蛋白的比重約為48%，牛乳中酪蛋白一般占80%左右。大白豬乳蛋白電泳凝膠上也顯示出豬乳中特有的高分子量蛋白，盡管其種類還未得到鑒定［8］。

本試驗(yàn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性分析了豬乳中3種低分子蛋白質(zhì)，有2種蛋白質(zhì)被鑒定（β-乳球蛋白和乳清酸蛋白），這對今后深入研究豬乳中蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能有重要意義。未鑒定的蛋白質(zhì)在豬乳中有穩(wěn)定的表達(dá)，值得今后繼續(xù)研究。電泳圖譜中這些蛋白質(zhì)的分子量與其理論分子量存在一些差異，可能與其修飾有關(guān)。β-乳球蛋白是牛乳中主要的乳清蛋白；乳清酸蛋白僅存在于嚙齒動(dòng)物、駱駝、兔、豬等動(dòng)物的乳中，但反芻動(dòng)物和靈長動(dòng)物乳中未發(fā)現(xiàn)該蛋白［16］。乳清酸蛋白被認(rèn)為與乳腺上皮細(xì)胞增殖的調(diào)控［17］及小鼠乳的抑菌活性［18］等有關(guān)。推測豬乳中的乳清酸蛋白對其乳腺的功能及哺乳仔豬有重要作用。