廖娟　石英子　馮丹妮　王鋼　喻世剛　楊子藝　梁梓

摘要：對(duì)腹瀉死亡的兔腸道中分離得到的1株疑似病原菌進(jìn)行鑒定及其耐藥基因檢測(cè)，并對(duì)分離菌進(jìn)行了革蘭氏染色、生化鑒定、16SrRNA基因序列分析，確定分離菌株為奇異變形桿菌，將其命名為T(mén)2019。將分離菌株與NCBI中10株已登錄的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行同源性比對(duì)，并用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，證明T2019與多種不同來(lái)源的奇異變形桿菌親源性較近。藥敏試驗(yàn)結(jié)果以及PCR體外擴(kuò)增技術(shù)對(duì)相關(guān)耐藥基因表型檢測(cè)結(jié)果表明，T2019除對(duì)米諾環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)為敏感，對(duì)四環(huán)素和多西四環(huán)素表現(xiàn)為中介以外，對(duì)其他所試抗生素均表現(xiàn)為耐藥。檢出耐藥基因tetB、ant（3″）-I、strA和sul2，其他所試耐藥基因未檢出。這為奇異變形桿菌引起兔疾病診斷及合理使用常規(guī)抗生素藥物提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：兔;奇異變形桿菌;分離;鑒定;耐藥基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.61文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）04-0125-05

作者簡(jiǎn)介：廖娟（1990—），女，四川樂(lè)山人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事家禽腸道微生物研究。E-mail：lsliaojuan@163.com。

通信作者：王鋼，碩士，教授，主要從事養(yǎng)殖業(yè)廢棄物處理與資源化利用研究。E-mail：1274898363@qq.com。

奇異變形桿菌（Proteusmirabilis）是一種無(wú)莢膜、無(wú)芽孢，性狀多為短桿菌的革蘭氏陰性菌，是一種常見(jiàn)的人畜共患病原菌[1-2]。該菌廣泛地分布于自然界中，可引起食物中毒、腹瀉、化膿性炎癥以及敗血癥等[3-4]。近年來(lái)，養(yǎng)殖業(yè)中被奇異變形桿菌感染的報(bào)道激增，如雞[5]、鵝[6]、孔雀[7]、牛[8]、水貂[9]、山羊[10]、狐貍[11]、豬[2]等動(dòng)物在感染該致病菌后會(huì)表現(xiàn)出很多發(fā)病癥狀，最明顯的有厭食、神情低落、畏寒、腹瀉、扎堆、流產(chǎn)，在短期內(nèi)急速死亡，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近些年來(lái)，養(yǎng)殖場(chǎng)抗生素類(lèi)藥物加劇使用以及不規(guī)范使用，甚至濫用，導(dǎo)致致病菌對(duì)抗生素類(lèi)藥物的耐藥性與日俱增，生物體內(nèi)致病菌通過(guò)異化而產(chǎn)生的耐藥基因也越來(lái)越多。添加抗生素類(lèi)藥物耐藥基因，就會(huì)加大致病菌對(duì)于不同抗生素的耐藥概率，給養(yǎng)殖業(yè)動(dòng)物的飼養(yǎng)及臨床治療造成了巨大的挑戰(zhàn)。

在2019年夏季，四川省峨眉山市某養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)大量幼兔發(fā)病，主要癥狀為精神萎靡、食欲不振、黃色瓢性稀便，在1周內(nèi)死亡。對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)病死兔進(jìn)行解剖，病死兔經(jīng)解剖多數(shù)可見(jiàn)肝臟及腎臟出血腫大、肺部有出血點(diǎn)。取病變組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、生化試驗(yàn)，再通過(guò)測(cè)定16SrRNA基因序列并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析同源性，確定分離出1株奇異變形桿菌，并對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè)，以期在分子水平上為奇異變形桿菌引起的兔病變死亡的診斷及治療提供案例分析和參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1被檢材料

本試驗(yàn)所用的病料來(lái)自峨眉山市某養(yǎng)殖兔場(chǎng)。

1.2主要試劑

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、細(xì)菌生化鑒定管、藥敏片等，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。PCR相關(guān)試劑、細(xì)菌DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒等，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3主要儀器

Motic光學(xué)顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）;超凈工作臺(tái)、立式電熱壓力滅菌鍋（青島海爾股份有限公司）;全溫空氣搖床、恒溫培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）;PCR儀、電泳儀[美國(guó)SelectBioProducts（SBP）公司];凝膠成像系統(tǒng)（德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司）。

1.4細(xì)菌分離與革蘭氏染色

用接種環(huán)無(wú)菌挑取病變組織，接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑取疑似菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，再挑取優(yōu)勢(shì)單個(gè)菌落分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上，觀(guān)察記錄疑似菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。挑取純培養(yǎng)物涂片后，進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)菌的形態(tài)。

1.5生化試驗(yàn)

將普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物分別接種于細(xì)菌微量生化管中，37℃培養(yǎng)24h后，觀(guān)察記錄結(jié)果。

1.6藥敏試驗(yàn)

將分離得到的菌株，采用國(guó)際通用的K-B紙片法[12]，對(duì)每一種所試抗菌藥物進(jìn)行體外敏感藥物篩選試驗(yàn)。結(jié)果參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，簡(jiǎn)稱(chēng)CLSI）制定的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.716SrRNA基因擴(kuò)增及序列測(cè)定

挑取已純化的菌落，接種于普通肉湯液體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，直至肉眼可見(jiàn)試管中菌液渾濁即增菌完成，收集菌液進(jìn)行離心。使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA。PCR擴(kuò)增參考通用引物序列：rmtc-F，5′-[JP9]AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;rmtc-R，5′-[JP9]AAGGAGGTGAGCCAGCCGCA-3′。

PCR反應(yīng)體系為25μL體系：2×TaqMix12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O9.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min;94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min，4℃保存。

取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNAmarker作為參照。電泳成功后將膠體放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀(guān)察，切下目的條帶做膠回收試驗(yàn)，參照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，膠回收完成后將回收的目的條帶送往北京擎科生物科技有限公司成都分公司測(cè)序。

1.816SrRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將分離菌測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接編輯，再與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的10種不同來(lái)源的變形桿菌（表1）進(jìn)行BLAST（basiclocalalignmentsearchtool）比對(duì)，用DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析，應(yīng)用Mega7.0軟件構(gòu)建16SrRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，確定分離菌株的種屬。

1.9耐藥基因檢測(cè)

1.9.1引物設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)[13-17]，并自行依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則（引物長(zhǎng)度為15～30bp/18～27bp，不得超過(guò)38bp，且GC含量為45%～55%最好）分別設(shè)計(jì)合成3種常見(jiàn)的廣譜抗生素類(lèi)藥物引物，所有耐藥基因的引物序列、體外擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度及退火溫度見(jiàn)表2。

1.9.2耐藥基因PCR檢測(cè)

以分離菌的基因組DNA為模板，用不同耐藥基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其反應(yīng)體系和反應(yīng)循環(huán)條件參照“1.6”節(jié)（不同的引物具有不同的退火溫度見(jiàn)表2）。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察記錄結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌分離與革蘭氏染色

從病變組織中分離出了1株具有共性且具有鑒定意義的菌株，將該分離菌株命名為T(mén)2019。它在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、灰白色，有腐敗臭味，中間稍微突起，有透明的單個(gè)菌落;在麥康凱培養(yǎng)基上呈圓形、扁平、半透明、表面光滑的菌落;在血瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無(wú)色菌落，無(wú)溶血現(xiàn)象。革蘭氏染色鏡檢可見(jiàn)分離菌株多數(shù)為中等大小，以短桿狀為主，大多單個(gè)存在，兩端鈍圓的革蘭氏陰性細(xì)菌。結(jié)合菌落和菌體特征，初步判定分離菌T2019疑似為奇異變形桿菌。

2.2生化試驗(yàn)

生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，根據(jù)《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，分離菌T2019的生化鑒定結(jié)果與奇異變形桿菌基本一致。

2.3藥敏試驗(yàn)

由表4可知，分離菌T2019除對(duì)米諾環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)為敏感，對(duì)四環(huán)素和多西四環(huán)素表現(xiàn)為中介以外，對(duì)其他所試抗生素均表現(xiàn)為耐藥。

2.416SrRNA基因PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，得到1條清晰的、大小約為1500bp的條帶，與可查證的奇異變形桿菌的特異性條帶大小接近，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.516SrRNA同源性比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析

結(jié)果（表5、圖2）顯示，分離菌株T2019與發(fā)表的菌株NCTC11938（GenBank登錄號(hào)為MN326692.1）同源性最接近，高達(dá)100%，NCTC11938菌株是從印度的動(dòng)物懶熊糞便中分離得來(lái)，鑒定為奇異變形桿菌，由此從分子水平上可將分離株T2019確定為奇異變形桿菌。

2.6耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

耐藥基因經(jīng)PCR檢測(cè)后，ant（3″）-I、strA、sul2和tetB基因電泳檢測(cè)結(jié)果片段大小與預(yù)期片段大小一致;除此之外，其他所試耐藥基因均未檢出（圖3至圖5）。

3討論與結(jié)論

奇異變形桿菌病是近些年在動(dòng)物中多發(fā)的急性細(xì)菌性傳染病，發(fā)病率主要集中在豬、雞、羊等家禽中，兔感染奇異變形桿菌的報(bào)道較為少見(jiàn)。本研究從腹瀉死亡的幼兔腸道中分離得到1株疑似病原菌進(jìn)行鑒定，對(duì)分離菌進(jìn)行了革蘭氏染色、生化鑒定、16SrRNA基因序列分析，最終確定分離菌株為奇異變形桿菌。奇異變形桿菌為多種動(dòng)物易感的致病菌，對(duì)于不同種群和不同習(xí)性的動(dòng)物感染后的臨床表現(xiàn)有所差異，在哺乳動(dòng)物中常見(jiàn)腹瀉、肺炎等癥狀。近年有新研究發(fā)現(xiàn)，感染奇異變形桿菌可導(dǎo)致動(dòng)物流產(chǎn)，但目前僅見(jiàn)于少數(shù)動(dòng)物，如狐貍[18]。

奇異變形桿菌的主要毒力因子包括鞭毛、菌毛、尿素酶等，該菌的鞭毛有利于其在普通細(xì)胞中定植，在感染動(dòng)物機(jī)體時(shí)，首先附著于機(jī)體防御較弱的部位以及傷口處進(jìn)行大量繁殖，通過(guò)分泌特定蛋白來(lái)破壞細(xì)胞表面，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，開(kāi)始分泌大量致病因子，毒力因子與受染細(xì)胞結(jié)合使細(xì)胞正常功能改變，最終侵害動(dòng)物機(jī)體[1]。

近年來(lái)，由于抗生素的大量濫用，大量致病菌都表現(xiàn)出對(duì)相應(yīng)藥物的耐藥性，奇異變形桿菌也不例外，其對(duì)多種抗生素表現(xiàn)出高度耐藥性。在養(yǎng)殖業(yè)中，商戶(hù)大都偏愛(ài)在飼料中添加抗生素，但抗生素的不規(guī)范添加會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)菌變異產(chǎn)生耐藥基因，各類(lèi)飼料添加劑也會(huì)對(duì)致病菌的耐藥性產(chǎn)生影響。在獸醫(yī)臨床中，抗生素的濫用導(dǎo)致原始劑量已無(wú)法達(dá)到治療效果，必須加大劑量投入才能顯示藥效，這對(duì)養(yǎng)殖業(yè)大為不利，不僅增加了飼養(yǎng)成本，也將動(dòng)物病程延長(zhǎng)，影響動(dòng)物生產(chǎn)性能，且使用大量的抗生素容易在動(dòng)物體內(nèi)積累，當(dāng)動(dòng)物排便或死亡后，抗生素重新堆積于土壤和污水中，對(duì)環(huán)境造成污染，且可能會(huì)有耐藥基因二次傳遞的危險(xiǎn)[19]。所以要想避免感染奇異變形桿菌對(duì)自身養(yǎng)殖業(yè)造成損失，最重要的方法在于如何防止細(xì)菌感染和傳播，首先要確保養(yǎng)殖場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生，及時(shí)清理動(dòng)物糞便，不要過(guò)度密集地養(yǎng)殖，保持通風(fēng)，每周進(jìn)行3～4次的全方位清潔并消毒，將動(dòng)物放出棚外進(jìn)行戶(hù)外運(yùn)動(dòng)，保持身心愉悅;其次，注意飼料中抗生素的添加，按照相關(guān)說(shuō)明規(guī)范合理地添加抗生素，切勿秉持多種類(lèi)多數(shù)量的觀(guān)念;最后，若養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)患病動(dòng)物，及時(shí)將其隔離，進(jìn)行全面消毒，無(wú)害化處理患病動(dòng)物的排泄物，防止對(duì)環(huán)境造成污染，制造疾病傳播源。

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