孫葳

（遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧沈陽 110036）

克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.）原名阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）屬,為腸桿菌屬的一個(gè)種，革蘭氏陰性桿菌，細(xì)胞大小為（0.6～ 1.1）μm×（1.2～3.0）μm，無芽孢，兼性厭氧，通過周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。該菌屬細(xì)胞外有一層便于吸附于物體表面的生物膜，且具有一定的耐干燥和耐熱性，因此該菌分布較廣泛，是食品尤其是嬰幼兒食品中非常重要的條件致病菌之一[1]，其在特定條件下會(huì)引起人和動(dòng)物致病，在嬰幼兒米粉、面條等食品中均有檢出的記錄。我司作為協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)室之一參加此次食品檢驗(yàn)用克羅諾桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)（樣）品協(xié)作標(biāo)定工作，對(duì)含量水平進(jìn)行考察的同時(shí)也提高了實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，現(xiàn)結(jié)合多年食品微生物檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)分析此次協(xié)作標(biāo)定工作，以期為食品微生物定量檢驗(yàn)工作提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣品來源

中國食品藥品檢定研究院發(fā)放的編號(hào)分別為CODE 1 至CODE 10 的球狀西林瓶裝樣品（2018 年）。

1.2 設(shè)備和材料

冰箱：2℃～5℃；

恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，42℃±1℃；

振蕩器；

電子天平：感量0.1 g；

無菌培養(yǎng)皿；

無菌1.5 mL 的EP 管；

生化鑒定試劑盒；

微量移液器及吸頭。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司：TSA 瓊脂平板；

法國bioMeriewx.sa：氧化酶試劑、API 20E。

2 定量檢測(cè)方法

2.1 樣品的前處理

每件標(biāo)準(zhǔn)品中克羅諾桿菌屬菌的含量約在103CFU/球水平，為保證測(cè)試的效果第一稀釋度測(cè)定（原液）：將樣品加入到1.5 mL 的EP 管（內(nèi)含1 mL 無菌生理鹽水）中，使用渦旋振蕩器充分混勻（為保證振蕩的效果，至少渦旋6 次，每次渦旋后將1.5 mL 的EP 管倒過來，彈EP 管底部，將底部的溶液彈起，然后再振蕩）。

第二稀釋度測(cè)定（1：10）：取100 μL 原液，加入900 μL 無菌生理鹽水中，混勻制成1：10 稀釋液。

2.2 培養(yǎng)

分別取100 μL 上述稀釋液，加入到TSA 瓊脂平板上，（為保證吸收效果，需要對(duì)TSA 瓊脂進(jìn)行除濕，防止瓊脂表面有過多的水分影響計(jì)數(shù)效果）每個(gè)稀釋度需要平行做2 份，使用L棒涂布均勻至吸收，于36℃培養(yǎng)48 h。

表1 典型菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3 菌落計(jì)數(shù)

取出平板后，參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落計(jì)數(shù)檢驗(yàn)》選擇合適的稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)，菌落數(shù)在30 CFU～300 CFU 之間的平板。計(jì)數(shù)結(jié)果如表1 所示。

菌落形態(tài)：樣品CODE 1 至CODE 10 TSA 瓊脂平板上，菌落均為黃色、濕潤、中等偏大、圓形、形態(tài)均一。

氧化酶試驗(yàn)均為陰性。

2.4 確證試驗(yàn)（鑒定）

每件樣品，挑取一個(gè)典型的克羅諾桿菌的菌落進(jìn)行生化鑒定。通過API 20E 鑒定試劑盒對(duì)CODE 1 至CODE 10 的樣品的可疑菌落進(jìn)行鑒定，API 20E 生化鑒定結(jié)果如表2、表3 所示。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)果

CODE 1 計(jì)數(shù)結(jié)果為3600 CFU/ 球；CODE 2 計(jì)數(shù)結(jié)果為3600 CFU/ 球；CODE 3 計(jì)數(shù)結(jié)果為3700 CFU/ 球；CODE 4 計(jì)數(shù)結(jié)果為4000 CFU/ 球；CODE 5 計(jì)數(shù)結(jié)果為4200 CFU/球；CODE 6 計(jì)數(shù)結(jié)果為4000 CFU/球；CODE 7 計(jì)數(shù)結(jié)果為4400 CFU/ 球；CODE 8 計(jì)數(shù)結(jié)果為3900 CFU/球；CODE 9 計(jì)數(shù)結(jié)果為3900 CFU/球；CODE 10 計(jì)數(shù)結(jié)果為3900 CFU/球。

表2 CODE 2、CODE 3、CODE 7 的API 20E 生化鑒定結(jié)果

表3 CODE 1、CODE 4、CODE 5、CODE 6、CODE 8、CODE 9、CODE 10 的API 20E 生化鑒定結(jié)果

3.2 分析與討論

3.2.1 關(guān)鍵點(diǎn)

此次協(xié)作標(biāo)定為定量項(xiàng)目，西林瓶中的樣品是一個(gè)不可分割的整體［2］，應(yīng)全部用于檢測(cè)。關(guān)于稀釋度的選擇，因已知每件標(biāo)準(zhǔn)品中克羅諾桿菌屬菌的含量約在103CFU/球水平，故選擇第一稀釋度（原液）和第二稀釋度（1：10）即可。EP管渦旋要至少6 次以上，以確保充分混勻。在用渦旋振蕩器渦旋時(shí)要注意，每次渦旋后要將EP 管倒置，將底部液體彈起后再次進(jìn)行均質(zhì)。

由于此次協(xié)作標(biāo)定為克羅諾桿菌屬定量檢驗(yàn)，所用方法為平板涂布法，在涂布前應(yīng)避免TSA 平板表面有過多水分造成菌落蔓延，進(jìn)而影響后期菌落的計(jì)數(shù)。本次所選TSA 平板為商品化即用型平板，日常是保存在4℃冷藏冰箱,在使用前要注意提前從冰箱中取出，可放入培養(yǎng)箱中烘干表面水分后使用。

目標(biāo)菌在TSA瓊脂平板上菌落形態(tài)為黃色、濕潤、中等偏大、圓形、形態(tài)均一的菌落，選取菌落數(shù)在30 CFU～300 CFU 的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3.2.2 質(zhì)量控制[3]

檢驗(yàn)所使用的培養(yǎng)基、生化試劑等必須在有效期內(nèi)并經(jīng)質(zhì)控驗(yàn)證合格。某些進(jìn)口培養(yǎng)基和國產(chǎn)培養(yǎng)基在檢驗(yàn)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)不一致的現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)做好比對(duì)和分析。嚴(yán)格且正規(guī)的無菌操作在實(shí)驗(yàn)過程中是最基本的要求，否則有雜菌混入必然會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)束語

綜上所述，在進(jìn)行食品檢驗(yàn)用克羅諾桿菌屬定量檢驗(yàn)過程中，稀釋度的選擇、液體的均質(zhì)、涂布及培養(yǎng)基的選擇均可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，在檢測(cè)過程中應(yīng)重視。同時(shí)通過參加此次協(xié)作標(biāo)定，實(shí)驗(yàn)室對(duì)菌落的定量檢測(cè)能力得到了提高。