丁利 張嘉 惠文利

[摘 要] 生物化學實驗是“生物化學”教學中的重要組成部分，生化實驗內(nèi)容的選取既要與基礎理論課內(nèi)容相協(xié)調(diào)，也要不斷發(fā)展，將新的科研成果融入其中。目前生化實驗教學內(nèi)容大多涵蓋了蛋白質(zhì)、核酸、維生素等部分內(nèi)容，但是對于糖類知識模塊較少涉及。糖類不僅是組成生命的三大類物質(zhì)之一，對其生物活性的研究更是當前生命科學熱點前沿之一。因此，借著當前教學革新的契機，有必要合理地選取一些成熟的糖生物學研究成果，將其運用到生化實驗教學中去。通過探討將唾液中抗流感相關糖鏈的檢測應用到實驗教學中去的可行性，使教學內(nèi)容與生活實踐相結合，不僅能夠增強學生對糖鏈生物學功能的認識，更能使他們接觸到科學前沿，增強對科學研究的興趣。

[關鍵詞] 生物化學;糖生物學;實驗教學;教學革新

[基金項目] 2019年度西北大學教學成果獎培育項目“生物化學實驗教學提升研究及推廣”（XM05190475）

[作者簡介] 丁 利（1980—），女，河南洛陽人，博士，西北大學生命科學學院講師，主要從事糖生物學研究;張 嘉（1966—），女，四川樂山人，學士，西北大學生命科學學院高級工程師，主要從事食品與制藥工程研究;惠文利（1976—），女，陜西三原人，博士，西北大學生命科學學院副教授（通信作者），主要從事納米生物醫(yī)學研究。

[中圖分類號] G642.4? ?[文獻標識碼] A? ? [文章編號] 1674-9324（2021）07-0005-04? ?[收稿日期] 2020-12-13

“生物化學”是面向生物學相關專業(yè)學生開設的一門重要基礎課程，也是高校本科生進入大二以后接觸到的第一門專業(yè)課。由于生物化學是一門實踐性很強的學科，理論課中講到的專業(yè)知識大多來源于一線的科學研究，因此與之配套的實驗課成為生化教學中的重要組成部分?！吧锘瘜W”理論課上介紹了參與生命活動的各種生物大分子，主要包括糖類、氨基酸及蛋白質(zhì)、核酸這三大類物質(zhì)，然而目前的實驗教學主要側重蛋白及核酸相關內(nèi)容，糖類相關教學內(nèi)容相對比較缺乏。尤其當前在科學前沿關于糖鏈的研究正蓬勃展開，人們已經(jīng)認識到糖類除了作為能量物質(zhì)外，還具有非常重要的生物學功能，糖鏈的研究已被公認為是繼蛋白質(zhì)和核酸的研究后探索生命奧秘的第三個里程碑。因此本文主要探討如何將當前糖生物學研究的前沿成果有機地融入本科生化實驗教學中來。

一、設置糖生物學內(nèi)容的重要性

20世紀60年代左右，科學家們發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)的信息流從DNA到最終翻譯為蛋白質(zhì)后并沒有終止，而是存在著從蛋白質(zhì)到糖類的延續(xù)，糖基化對于蛋白質(zhì)及整體生物學高級功能的體現(xiàn)至關重要。糖鏈是繼蛋白質(zhì)、核酸之后，被人們發(fā)現(xiàn)的參與生物機體重要生命活動的三類生物大分子之一[1]。糖鏈因具有不同的糖苷鍵、立體構型及分支結構，從而含有比蛋白質(zhì)及核酸結構更為豐富的生物學信息。

糖類最早僅作為生物體的能量和結構物質(zhì)而被人們所熟知，由于其結構的復雜多樣性，以及分析方法的相對局限，阻礙了對其生物學作用的進一步認識。近些年來，隨著細胞生物學及分子生物學的快速發(fā)展，以及現(xiàn)代分離、分析技術的進步，糖類更為重要的生物學功能不斷被發(fā)掘。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物細胞表面70%的蛋白均具有糖基化修飾，這些糖鏈可以通過與受體蛋白之間的相互作用介導細胞的專一性識別作用，進而參與生命的調(diào)控過程。近年來的研究結果已證實，糖鏈幾乎參與了真核生物所有的生理和病理過程，無論在正常的精卵識別、生長發(fā)育及生命穩(wěn)態(tài)的維持，還是在病原體感染、炎癥、自身免疫調(diào)節(jié)、癌細胞增殖轉移等過程中均發(fā)揮著重要作用[2]。

由于糖生物學研究的巨大意義，世界各科技強國都對其給予了高度重視，投入了大量人力財力，例如美國在佐治亞大學、加州大學圣地亞哥分校分別建立了糖復合物研究中心、糖生物學研究及培訓中心，并于2001年資助成立了美國國立衛(wèi)生研究院下屬的功能糖組學聯(lián)盟，英國1992年在牛津大學成立了糖生物學研究所，歐盟制定了“歐洲糖類研究開發(fā)網(wǎng)絡計劃”等，日本政府1991年開始投資數(shù)百億日元實施計劃15年完成的“糖工程前沿計劃”……我國則分別于1994年、2007年、2011年在復旦大學、山東大學、江南大學成立了衛(wèi)生部糖復合物重點實驗室、國家糖生物技術研究中心及教育部糖化學與生物技術重點實驗室，并通過“863計劃”“973計劃”和重大科技專項等項目不斷加大對糖生物學研究的支持力度[3]。關于糖鏈的研究已成為當前生物學領域新的熱點之一，進而促進和形成了一門新興交叉學科——糖生物學。目前糖生物學理論課程已經(jīng)在北京大學、清華大學、復旦大學、廈門大學、山東大學、江南大學、西北大學等諸多高校本科生課程中開設，然而相關的實驗教學內(nèi)容則很少見到。21世紀生命科學亟待解決的問題是對生物體高層次生命現(xiàn)象的解釋，因此，圍繞糖類這一重要的參與細胞識別、調(diào)控的信息分子的研究是必不可少的，也會成為大多數(shù)生物學專業(yè)學生在未來科研課題中要接觸或涉及的內(nèi)容，所以非常有必要在本科階段進行糖生物學相關實驗技能的培訓[4]。此外，目前糖生物學已向生物醫(yī)學領域的其他學科廣泛滲透和融合，形成了糖免疫學、糖病理學、糖神經(jīng)生物學等學科分支，這些相關學科及研究方向也需要學生具備一定的糖生物學實驗基礎[5，6]。

二、糖生物學實驗教學內(nèi)容的選取——以人類唾液中抗禽流感相關糖鏈的檢測為例

在各國科學家的重視下，糖鏈的生物學功能及其在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機理開始不斷被認識和揭示，其中尤其是對于糖鏈在流感病毒入侵宿主過程中的機制研究最為深入和成熟。

科學家們發(fā)現(xiàn)流感病毒表面的血凝素可以通過與宿主細胞表面的糖鏈受體進行識別結合，進而開啟侵染宿主的過程[7]。不同的流感病毒識別結合的糖鏈受體結構有所差異，人流感病毒主要識別結合α2，6連接的唾液酸糖鏈結構，這種唾液酸受體主要分布在人上呼吸道中;禽流感病毒主要識別α2，3連接的唾液酸結構，其主要分布在人下呼吸道和支氣管中。目前大多數(shù)抗流感藥物的設計如達菲等均是這種唾液酸結構的類似物，通過競爭性地與流感病毒結合，進而減少其與宿主細胞表面唾液酸糖鏈受體的結合。

在正常的生理狀態(tài)下，唾液作為人體免疫的第一道防線，可以通過分泌相關的含有唾液酸糖鏈的糖蛋白來中和或封閉流感病毒對機體細胞的結合與侵染，如黏蛋白、分泌型IgA（SIgA）等，這些蛋白上唾液酸糖鏈的表達水平與其中和流感病毒的能力密切相關。西北大學糖生物學團隊李錚教授在該領域的研究取得了較大進展，該課題組詳細地研究了健康兒童、成人和老年人唾液中糖蛋白的表達差異，發(fā)現(xiàn)老年人唾液中α2-3唾液酸糖鏈表達水平較高，能更有效地與H9N2等禽流感病毒結合，因而具有較強的禽流感病毒抵御能力。但具有糖尿病、慢性病等老年人唾液中α2-3唾液酸糖鏈水平顯著低于正常對照組，是禽流感病毒較易感人群[8，9]。此外，國外相關研究也同樣指出可以通過唾液中相關唾液酸糖鏈結構表達水平來判斷個體感染禽流感的風險[ 10 ]。

由于唾液中具有可以封閉流感病毒表面受體的唾液酸糖鏈結構，其含量多少能夠影響不同個體對于流感病毒的抵抗能力，因此可以用來判斷不同人群對于流感病毒的易感性。唾液中的唾液酸糖鏈阻止流感病毒侵染宿主細胞的機理相對比較清楚，檢測方法相對比較簡單，并且與學生的日常生活密切相關，學生具有較高的興趣和接受度，因此將這一內(nèi)容融入實驗教學的條件較為成熟和可行。

三、教學內(nèi)容的可行性分析

目前對于唾液酸糖鏈結構的檢測可以通過相對較為專一的凝集素進行。凝集素（Lectin）是一類能夠與糖蛋白糖鏈結構發(fā)生特異性結合的非酶蛋白，具有高度保守的糖識別域，能夠專一性地識別不同的糖鏈結構，在實驗中可以作為特定的糖鏈檢測工具。由于馬鞍樹凝集素-II（Maackia Amurensis Lectin II，MAL-II）識別結合的α2-3唾液酸糖鏈結構與禽流感病毒血凝素相似，因此常用來模擬預測宿主感染禽流感的情況。在本實驗中可以通過直接購買Cy5熒光標記的MAL-II對唾液中的α2-3唾液酸糖鏈進行專一性檢測。

本實驗可以安排在聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）實驗之后，也可在SDS-PAGE實驗中直接利用學生自己的唾液樣本進行凝膠電泳;然后將電泳后的凝膠進行PVDF轉膜實驗，從而保證整個實驗過程在3～4學時內(nèi)完成。

實驗所需器材有：唾液收集器、離心機、半干轉膜儀、聚丙烯酰胺凝膠（可直接購買預制膠）、PVDF醋酸纖維素薄膜、轉膜緩沖液、Carbon-free無糖封閉液、熒光染料Cy5標記的MAL-II凝集素（Cy5-MAL-II）、垂直電泳儀、熒光掃描儀。實驗所用到的均為常規(guī)儀器，預制膠、Carbon-free封閉液及Cy5-MAL-II用量不大，均可從生物公司直接購買，轉膜緩沖液中所用到的甲醇可以用乙醇取代，安全無害且不影響實驗結果。

四、教學內(nèi)容的設計及操作過程

本教學實驗主要可分為以下幾個步驟：

1.采樣（約20min）：實驗開始前，每位同學先用生理鹽水漱口以去除口腔中的食物殘渣，然后低頭靜坐，用唾液收集器收集自然分泌的唾液約1mL，采集時間約為5min。然后將采集到的唾液轉入2mL無菌離心管中低溫12000rpm離心10min，取上清后用濾膜過濾掉唾液中小分子水及無機鹽類，將蛋白濃縮至200μL，備用。本實驗所用的唾液樣本來自學生本人，采集過程安全無創(chuàng)，能夠極大地提高學生的興趣及參與度，該步驟操作也較為簡單，對本科生無難度。

2.SDS-PAGE（約60min）：吸取處理后的蛋白樣品20μL，加入5×上樣緩沖液5μL，沸水浴中加熱5min，然后用上樣移液槍將其加入預制膠膠孔中，120V/40mA進行電泳，約45min后溴酚藍到達預制膠下沿時停止。胎球蛋白中含有α2-3唾液酸糖鏈，可以作為參照物，同體積上樣20μL（500g/ml），隨樣本同步進行操作。每位同學均可使用自己所采集處理好的唾液樣本進行該步驟操作。

3.轉膜及孵育（約100min）：裁剪好的醋酸纖維素薄膜浸泡于轉膜緩沖液中（面積7×6cm大小，實驗前老師準備好），用半干轉膜儀，將電泳后的凝膠轉移到醋酸纖維素薄膜上，在400mA恒流條件下轉膜50min，用Carbon-free封閉液封閉10min，然后在其中加入Cy5熒光標記的MAL-II（終濃度1mM）孵育40min，將膜取出放入TBST緩沖液中等待掃描。該部分內(nèi)容類似于Western blot，是生物學專業(yè)經(jīng)常用到的實驗技能。

4.結果掃描及數(shù)據(jù)讀取（約20min）：將PVDF膜放入熒光掃描儀中635nm處進行掃描，并獲取每個條帶的熒光信號值。

本實驗共計用時200min，可以保證在四個學時內(nèi)完成，可作為一次實驗課進行，也可以分兩次進行，在第二步SDS-PAGE電泳結束后可以先將凝膠放入轉膜緩沖液中存放，后續(xù)步驟可以繼續(xù)在第二次實驗課完成。

五、討論

生化實驗課不僅要有助于學生對于專業(yè)理論知識的理解，更要著重培養(yǎng)學生的科研素養(yǎng)及探索精神，近年來高校不斷鼓勵教學科研人員將一線研究成果融入教學實踐中來，以使教學內(nèi)容緊扣科研前沿，與生產(chǎn)生活相聯(lián)系，激發(fā)學生的學習興趣。

蛋白質(zhì)、核酸和糖類是構成生命的三類大分子，隨著蛋白質(zhì)和核酸中的奧秘被知曉，糖類的重要性也浮出水面，成為生命科學研究中的新熱點。目前關于糖類的研究前沿已經(jīng)從基本的結構和能量物質(zhì)轉移到生物學活性方面，各院校關于糖生物學的理論課教學正在逐步開展。然而筆者翻閱大部分院校的生化實驗教學大綱后發(fā)現(xiàn)，目前關于糖生物學知識模塊的實驗教學內(nèi)容開展得非常少，生化實驗指導用書中涉及的糖類實驗內(nèi)容大多是針對傳統(tǒng)的濃度測定，例如蒽酮比色定糖法、總糖及還原糖的測定等，而針對糖鏈生物學功能的教學設計基本沒有見到。

流感病毒是大家在日常生活中較為熟悉的一種致病微生物，圍繞其致病機理的研究能夠引起學生對該實驗的極大興趣。本實驗的設計將糖生物學的內(nèi)容融入其中，能夠啟發(fā)學生對于糖鏈生物活性的認知，激發(fā)他們在該領域的求知欲，引導他們接觸到更多的糖生物學一線研究。在教學內(nèi)容銜接上，該部分能夠與目前常規(guī)開設的SDS-PAGE實驗融為一體，使學生在掌握實驗基本技能之外，能夠進一步增強對于課堂理論課的理解，提升科研素質(zhì)。

六、結語

糖生物學作為一門新興交叉學科，涉及生物化學、微生物、分子免疫學等方面的知識，對其實驗教學內(nèi)容的選取既要結合這些方面的主要研究技術，又要圍繞當前糖生物學研究的主要內(nèi)容。本文主要以人類唾液中抗禽流感相關糖鏈的檢測為例進行了教學內(nèi)容設計及可行性分析，本實驗中所用到的方法能夠與常規(guī)的生物實驗技術相融合，實驗內(nèi)容上也選取了相對簡單及成熟的糖生物研究案例，并計劃將其進一步應用到實際的教學實驗中去。相信隨著糖生物學研究成果的不斷成熟，會有越來越多的實驗內(nèi)容可供選擇，使同學們能夠在本科階段更加充分地接觸到糖生物學這一研究前沿。

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On the Introduction of the Related Glycobiology Content into the Experiment Teaching of Biochemistry

DING Li， ZHANG Jia， HUI Wen-li

（Biochemistry Teaching and Research Group， College of Life Sciences， Northwest University，

Xian， Shaanxi 710069， China）

Abstract：The teaching of biochemistry experiment is an important part for the course of Biochemistry. The teaching contents of biochemistry experiment should be coordinated with the basic theory courses and integrated with the new scientific research results. At present， the teaching contents of biochemistry experiments mainly cover protein， nucleic acid， vitamin and so on， but the knowledge about carbohydrate is rarely included. As one of the most important three constituents of life， the research about carbohydrate， especially its bioactivity— glycobiology has been a hot frontier of life science. In the current teaching innovation， it is necessary to select some mature research results of glycobiology and apply them into the biochemistry experiment teaching. In this paper， we take the saliva anti-influenza virus glycan detection as an example， analyze its application feasibility in biochemistry experiment teaching， so that the teaching content can be combined with life practice. This kind of teaching content will improve the glycobiology knowledge of student， expose them to the forefront of life science， and increase their interest in scientific research.

Key words： Biochemistry; glycobiology; experiment teaching; teaching innovation