盧俊江 胡泳濤 李艷 方毅敏 韓江全△

(1.廣州市胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科，廣東 廣州 510000；2.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 珠海 519100；3.廣州市胸科醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，廣東 廣州 510000)

腦梗死是神經(jīng)系統(tǒng)常見病和多發(fā)病，其致殘率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，加重社會(huì)負(fù)擔(dān)。大約有三分之一的腦梗死患者發(fā)病時(shí)血糖水平升高[1]，近年來，我國糖尿病發(fā)病率一直增加，在高血糖的情況下，腦缺血發(fā)展更快更嚴(yán)重，但高血糖加重腦缺血組織損傷的機(jī)制仍不明確。細(xì)胞凋亡已被公認(rèn)其在高血糖加重腦缺血損傷過程中起重要作用[2]，既往對(duì)于細(xì)胞凋亡，主要聚焦于線粒體通路及死亡受體通路，新近研究則顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑同樣起著關(guān)鍵的作用。caspase-9、caspase-12是caspase家族的重要成員，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路導(dǎo)致凋亡的關(guān)鍵因子，在缺血缺氧、Ca2+平衡失調(diào)等各種刺激過長過強(qiáng)時(shí)，Caspase-12前體被大量激活，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞胞漿，依次激活凋亡啟動(dòng)因子Caspase-9引發(fā)caspase蛋白水解級(jí)聯(lián)效應(yīng)，發(fā)生細(xì)胞凋亡。而葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)在應(yīng)激情況下，則解除對(duì)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)通路蛋白的抑制，而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)。GRP78在應(yīng)激條件下，一方面對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，另一方面亦可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的敏感標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)通過研究高血糖對(duì)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及GPR78表達(dá)的影響進(jìn)一步探討高血糖加重腦缺血損傷的機(jī)制。報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD(SpragueDawley，SD)大鼠30只，8～9周齡，體質(zhì)量250～300 g，由遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)中心實(shí)驗(yàn)室提供。隨機(jī)分為3組：高血糖組、正常血糖組、假手術(shù)組，每組10只。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1高血糖大鼠模型的制備 大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由進(jìn)水。高血糖組于造模前30 min按體質(zhì)量4 g/kg經(jīng)尾靜脈注射25%(質(zhì)量濃度)葡萄糖，造成高血糖狀態(tài)。正常血糖組和假手術(shù)組注射等量18%(質(zhì)量濃度)D-甘露醇。于栓線前測(cè)定鼠尾血糖水平。

1.2.2局灶性腦缺血再灌注模型的制備 采用Longa線栓法[3 ]建立大腦中動(dòng)脈阻塞缺血再灌注模型，均阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈。假手術(shù)組不阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈，余操作與其他組相同。

1.2.3神經(jīng)功能評(píng)分 參照Zea-Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]，于缺血2 h再灌注24 h對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，2分或2分以上者為造模成功。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取材視交叉后2 mm處平面組織進(jìn)行切片，片厚5 um。TUNEL染色步驟按試劑盒說明書進(jìn)行(武漢博士德公司產(chǎn)品)。陽性標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下觀察細(xì)胞核呈棕黃色者為TUNEL染色陽性細(xì)胞。根據(jù)大鼠腦缺血半暗帶的定位方法，將大腦中動(dòng)脈阻塞的同側(cè)額頂葉皮質(zhì)上部界定為半暗帶的等值觀察區(qū)。高倍鏡下(400倍)隨機(jī)分別觀察頂葉皮質(zhì)缺血半暗區(qū)不重疊的5個(gè)視野，計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞平均數(shù)。

1.2.5免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān) caspase-12、caspase-9表達(dá) 組織切片經(jīng)60℃的恒溫箱烘120 min拷片后脫蠟；經(jīng)二甲苯脫蠟，至無水酒精至95%酒精至85%酒精至70%酒精至蒸餾水洗滌濕化；再經(jīng)3%H2O2室溫孵育后pH6.0的0.01M枸櫞酸鹽緩沖液中微波修復(fù)抗原，pH7.4的PBS洗滌；5%BSA室溫封閉，分別滴加兔抗caspase-12Rabbit mAb或caspase-9Rabbit mAb，4℃冰箱孵育過夜后，pH7.4的PBS洗滌；生物素化山羊抗兔IgG1 37℃孵育30 min后PBS洗滌；鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，37℃孵育及PBS洗滌；DAB顯色，室溫條件顯微鏡下顯色；蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化1～2 s后水洗返藍(lán)；酒精脫水，二甲苯透明，封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照；細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色為陽性結(jié)果。圖像選取及分析方法：MICRO-COSMOS MiVnT顯微生物圖像分析系統(tǒng)在統(tǒng)一光飽和度、亮度和色調(diào)條件下對(duì)所拍攝照片進(jìn)行圖像分析。取吸光度值計(jì)算平均數(shù)，用于各組間比較。

1.2.6Western-blotting檢測(cè)GPR78表達(dá) 大鼠迅速斷頭取腦，冰上分離缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)約100 mg，冰上研磨組織后加預(yù)冷的蛋白裂解液，繼續(xù)碾磨至液態(tài)，然后4℃，12 000 r/min離心30 min，留上清液，取40uL用BCA法進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，所剩上清液按4：1的比例加變性loading，100℃水浴10 min。取蛋白樣品(40μg)采用10%SDS。PAGE 100 V垂直電泳(Bio-Rad)垂直板式電泳槽儀，(USA)120 min進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(PVDF)上進(jìn)行免疫反應(yīng)(200V，120 min)。5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，然后依次加入兔抗GRP78抗體(北京博奧森生物制劑有限責(zé)任公司，1：500)，37℃孵育2 h，4℃過夜；偶聯(lián)辣根過氧化物(HRP)羊抗兔IgG(稀釋濃度1:2 000)室溫孵育2 h，LumiGLO(20×)發(fā)光劑中X一感光盒內(nèi)曝光。以上反應(yīng)均在塑料袋內(nèi)進(jìn)行，其間用PBS充分洗滌。為了檢測(cè)蛋白裂解/轉(zhuǎn)移的變化，所有的印跡均以麗春紅(抗體孵育前)和考馬斯亮藍(lán)(化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)后)染色。膠片進(jìn)行掃描和拍照，Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行蛋白量定量分析，以V值=GRP78蛋白定量/內(nèi)參(β-actin)蛋白定量為結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1腦缺血/再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分為0分，其余兩組在大鼠麻醉清醒后即出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注后的高血糖組與正常血糖組評(píng)分均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高血糖組功能評(píng)分較血糖正常組高。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組TUNEL陽性細(xì)胞及凋亡比較 光鏡下假手術(shù)組可見少量凋亡細(xì)胞(細(xì)胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒)，正常血糖組及高血糖組缺血側(cè)壞死灶周圍可見較多凋亡細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，正常血糖組和高血糖組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且高血糖組凋亡細(xì)胞較正常血糖組增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A:假手術(shù)組；B:正常血糖組24 h；C:高血糖組24 h；圖中棕黃色染色為凋亡細(xì)胞形態(tài)。圖1 腦缺血再灌注后TUNEL染色(TUNEL,10×40)

2.3各組大鼠caspase-9和caspase-12表達(dá) 假手術(shù)組可檢測(cè)到少量caspase-9，而caspase-12無表達(dá)。再灌注24 h后正常血糖組及高血糖組缺血側(cè)頂葉皮質(zhì)可見caspase-9和caspase-12表達(dá)明顯增強(qiáng)。與假手術(shù)組比較，正常血糖組和高血糖組的caspase-9和caspase-12免疫組化染色灰度值均顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且高血糖組的caspase-9和caspase-12免疫組化染色灰度值較正常血糖組明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖2、圖3。

表1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、凋亡細(xì)胞數(shù)及caspase-9、caspase-12表達(dá)水平比較

注：A:假手術(shù)組；B:正常血糖組24 h；C:高血糖組24 h；假手術(shù)組中未見表達(dá)，正常血糖組組可見明顯棕黃色細(xì)胞數(shù)目，而高血糖組表達(dá)明顯高于正常血糖組圖2 腦缺血/再灌注caspase-12免疫組化染色(IHC,20×40)

注：A:假手術(shù)組；B:正常血糖組24 h；C:高血糖組24 h；假手術(shù)組中少量表達(dá)，正常血糖組組可見明顯棕黃色細(xì)胞數(shù)目，而高血糖組表達(dá)明顯高于正常血糖組圖3 各組腦缺血/再灌注caspase-9免疫組織化學(xué)染色(IHC,20×40)

2.4鼠腦缺血/再灌注GRP78表達(dá)的變化 正常血糖組3 h表達(dá)升高，12 h時(shí)達(dá)到高峰，24 h 仍可見明顯表達(dá)，高血糖組低于同時(shí)間點(diǎn)正常血糖組(P<0.01)。見表2、圖4。

表2 大鼠再灌注后不同時(shí)間GRP78水平比較

圖4 各組腦缺血/再灌注Western-blot

3 討 論

高血糖是腦血管疾病發(fā)展和加重的重要危險(xiǎn)因素，其損傷機(jī)制目前仍未明確，現(xiàn)有研究表明[5-7]，可能與興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、自由基生成增加、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。其中，細(xì)胞凋亡在高血糖加重腦缺血再灌注損傷的眾多機(jī)制中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn):線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路等至少3條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了凋亡[8]。腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的多因素過程，既有促進(jìn)凋亡的caspase-9、caspase-12等因子的激活，也有抑制因子如GRP78等的變化[9]。本研究結(jié)果顯示，與正常血糖組比較，高血糖組神經(jīng)功能評(píng)分及凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多。

凋亡是機(jī)體的一種生理過程，正常情況下有利于維持自身穩(wěn)定，但異常增加則是某些損傷因素導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要形式。凋亡的機(jī)制在進(jìn)化中由Caspase家族蛋白酶執(zhí)行，caspase-9、caspase-12是caspase家族的重要成員，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路導(dǎo)致凋亡的關(guān)鍵因子，在缺血缺氧、Ca2+平衡失調(diào)等各種刺激過長過強(qiáng)時(shí)，Caspase-12前體被大量激活，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞胞漿，依次激活凋亡啟動(dòng)因子Caspase-9引發(fā)caspase蛋白水解級(jí)聯(lián)效應(yīng)，發(fā)生細(xì)胞凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，正常血糖組各時(shí)點(diǎn)的凋亡指數(shù)、Caspase-12及其下游的Caspase-9表達(dá)較假手術(shù)組均明顯增高，提示Caspase-9、Caspase-12在誘導(dǎo)腦缺血再灌注后的凋亡反應(yīng)中起著重要作用。

GRP78是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白，生理情況下，其在真核生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上與新生多肽短暫結(jié)合后分離，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊和裝配，故在生理狀態(tài)下有微弱表達(dá)。腦缺血再灌注損傷時(shí)，激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，發(fā)生UPR(unfolded protein response,未折疊蛋白反應(yīng))。在應(yīng)激早期，UPR誘導(dǎo) GRP78大量表達(dá)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白結(jié)合，以恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，使蛋白質(zhì)能夠在應(yīng)激狀態(tài)下繼續(xù)正確合成，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，適應(yīng)應(yīng)激[10]。

在腦缺血再灌注后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)長時(shí)間過強(qiáng)應(yīng)激則發(fā)生細(xì)胞凋亡，GRP78的表達(dá)呈下降趨勢(shì)[11,12]。Tajiri等認(rèn)為[13]，長時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失代償，細(xì)胞啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡程序的結(jié)果。GRP78后期表達(dá)下降，神經(jīng)細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，Vilatoba等在其實(shí)驗(yàn)中同樣得到驗(yàn)證[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，GRP78假手術(shù)組有少量表達(dá)，正常血糖組再灌注后3 h可見少量表達(dá)，高于假手術(shù)組，并在再灌注后12 h時(shí)達(dá)高峰，后期逐漸下降，與之前的實(shí)驗(yàn)相一致。

無論是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[15]，還是臨床資料[16]，都表明高血糖會(huì)加重缺血再灌注后的腦損傷。本實(shí)驗(yàn)中，高血糖組的神經(jīng)功能評(píng)分及凋亡指數(shù)均高于正常血糖同時(shí)點(diǎn)組，提示高血糖狀態(tài)下，凋亡更為嚴(yán)重，亦證實(shí)了細(xì)胞凋亡在高血糖加重腦缺血再灌注損傷中的作用。在腦缺血再灌注后，正常血糖組GRP78的表達(dá)水平均明顯高于同時(shí)點(diǎn)高血糖組，提示在高血糖狀態(tài)下GRP78的保護(hù)作用被明顯抑制，而且可能在應(yīng)激的早期這種抑制就已形成，說明高血糖在腦缺血再灌注后一方面抑制細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制，另一方面促進(jìn)應(yīng)激反應(yīng)向凋亡轉(zhuǎn)化。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，與正常血糖組大鼠相比，高血糖組大鼠腦組織，大鼠神經(jīng)功能缺損更嚴(yán)重，神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增多，高血糖組caspase-9、caspase-12表達(dá)比正常血糖同時(shí)點(diǎn)組均有明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且與凋亡情況變化一致，提示上調(diào)caspase-9、caspase-12表達(dá)，可能是高血糖加重腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。但GPR78的表達(dá)減少，提示高血糖可增加缺血再灌注后腦細(xì)胞凋亡，GRP78可能參與了高血糖加重腦缺血再灌注損傷過程，下調(diào)GRP78表達(dá)可能是高血糖加重腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。