湯志鴻，蔣豐智，黎小秀，段高羊，廖 瓊

東莞市婦幼保健院兒科,廣東 東莞 523000

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于兒童胃微生態(tài)研究甚少，幽門螺桿菌（HP）是胃內(nèi)第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌，全球超過一半的人口感染幽門螺桿菌［1］，中國(guó)兒童幽門螺桿菌感染率為12.8%［2］，幽門螺桿菌感染后兒童會(huì)出現(xiàn)非特異性癥狀，如嘔吐，惡心，體重減輕，嘔血和食欲下降。慢性幽門螺桿菌感染可引起生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、缺鐵性貧血、免疫性血小板減少癥［3］。幽門螺桿菌菌株、宿主、內(nèi)環(huán)境等多方面因素決定了疾病的發(fā)生發(fā)展。目前兒童人群中缺乏關(guān)于胃細(xì)菌群落的存在和組成的研究，本研究對(duì)東莞市婦幼保健院門診及住院部有消化道臨床癥狀而接受胃鏡檢查的患兒，鉗取胃黏膜標(biāo)本用于快速尿素酶試驗(yàn)、組織病理學(xué)檢查、DNA提取，分析HP陽性組和HP陰性組兩組之間的社會(huì)人口資料學(xué)、體重指數(shù)、尿素呼氣試驗(yàn)、病理組織結(jié)果等臨床特征，通過16SrDNA檢測(cè)技術(shù)分析HP感染后兒童胃黏膜中的微生態(tài)菌群的變化，探索幽門螺桿菌感染對(duì)胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)組成的影響，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集東莞市婦幼保健院兒科門診及住院部有消化道臨床癥狀來就診的患兒，不同程度伴有腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、噯氣及食欲不振等不適癥狀；年齡＜14周歲，既往未進(jìn)行過抗HP治療。完善13 C尿素呼氣試驗(yàn)、糞便HP抗原檢測(cè)，完善胃鏡檢查、鉗取胃黏膜標(biāo)本用于快速尿素酶試驗(yàn)、組織病理學(xué)檢查、DNA提取。按幽門螺桿菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合下述四項(xiàng)之一者可判斷為HP現(xiàn)癥感染［4］：（1）組織病理學(xué)檢查和快速尿素酶試驗(yàn)均陽性；（2）尿素呼氣試驗(yàn)或糞便HP抗原檢測(cè)陽性，并且組織病理學(xué)檢查或快速尿素酶試驗(yàn)結(jié)果其中一項(xiàng)陽性；（3）有消化性潰瘍出血，病理組織學(xué)或尿素呼氣試驗(yàn)中任一項(xiàng)陽性。將患者分為HP陰性組14例和HP陽性組26例。

1.2 方法

（1）胃黏膜標(biāo)本采集，胃鏡下分別鉗取受試者胃竇黏膜活檢樣本，大小約1 mm×2 mm。取材后標(biāo)本置于無菌凍存管中并加入500 uL生理鹽水，立即于-80℃保存。（2）基因組DNA提取和16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序：將胃黏膜組織連同生理鹽水轉(zhuǎn)移至組織研磨器進(jìn)行組織勻漿，使用試劑盒QIAamp@DNA Mini Kit(QIAGEN，Germany)提取樣本總DNA，具體操作步驟見說明書。設(shè)計(jì)引物，對(duì)16S rDNA V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為：341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGG

—TATCTAAT)。PCR純化、純化PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，應(yīng)用Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)，分析測(cè)序結(jié)果，分析在門、屬分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSSl3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理分析，χ2檢驗(yàn)比較HP陽性組和HP陰性組體重指數(shù)、病理組織結(jié)果的差異。Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較HP陽性組和HP陰性組微生物群落的豐度和多樣性差異。統(tǒng)計(jì)各樣本在門、屬分類群的分布情況，并用柱狀圖進(jìn)行展示。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HP陽性組和HP陰性組臨床特征分析

兩組之間的社會(huì)人口資料學(xué)、體重指數(shù)、尿素呼氣試驗(yàn)、病理組織結(jié)果等臨床特征分析。HP陽性組26人，男性14例，女性12例，平均年齡（7.66±1.69）歲。陰性組14人，男性8例，女性6例，平均年齡（7.45±1.63）歲。對(duì)兩組患者的年齡、性別資料進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。HP陽性組體重過低（BMI＜18.5 kg/m2）的患兒比例為69.2%，非體重過低（BMI＞18.5 kg/m2）的患兒比例為30.3%（P=0.04），幽門螺桿菌感染組患兒體重過低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理組織結(jié)果顯示，HP陽性組活動(dòng)性淺表性胃炎、出血性胃炎、胃潰瘍的比例高于HP陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 HP陽性組和HP陰性組臨床特征分析 例(%)

2.2 多樣性分析

通過對(duì)測(cè)序所得的細(xì)菌物種數(shù)量的稀釋曲線來表示物種豐度和多樣性，見圖1。HP陰性組的物種豐度和物種多樣性高于HP陽性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），表明幽門螺桿菌感染會(huì)顯著降低胃黏膜細(xì)菌群落的多樣性。

圖1 HP陽性組和HP陰性組的稀釋性曲線圖

2.3 組間物種差異分析

在門水平，HP陽性組和HP陰性組的優(yōu)勢(shì)物種的種類相同，但所占的比例有所不同，圖2柱狀圖展示兩組的門水平的物種分布。其中HP陽性組為： Proteobacteria變形菌門（64%）、Firmicutes厚壁菌門（13%）、Bacteroidetes擬桿菌門（8%）、Actinobacteria放線菌門（6%）、Fusobacteria梭桿菌門（5%）。而HP陰性組為Proteobacteria變形菌門（46%）、Firmicutes厚壁菌門（23%）、Bacteroidetes擬桿菌門（13%）、Actinobacteria放線菌門（6%）、Fusobacteria梭桿菌門（2%）。

在屬水平上，HP陽性組和HP陰性組兩組在屬水平的物種分布柱狀圖（圖3），HP陽性組Helicobacter螺桿菌屬比例高達(dá)62%，螺桿菌屬是變形菌門的一種，這也是引起HP陽性組變形菌門比例明顯升高的因素。除螺桿菌屬外，HP陽性組Prevotella普氏菌屬（7%VS 3%）、Fusobacterium梭桿菌屬(6%VS 3%)比例較HP陰性組高。

圖2 HP陽性組和HP陰性組兩組在門水平的物種分布柱狀圖

圖3 HP陽性組和HP陰性組兩組在屬水平的物種分布柱狀圖

3 討論

傳統(tǒng)上，胃微生物群落特征的方法主要依賴于胃黏膜或胃液的分離培養(yǎng)，但對(duì)苛養(yǎng)菌及生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌分離培養(yǎng)很棘手，80%的細(xì)菌是不可培養(yǎng)的［5］。因此傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法很難全面的認(rèn)識(shí)胃黏膜菌群分布特征。16 SrDNA編碼原核生物16S rRNA的基因，存在于所有細(xì)菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體和放線菌等原核生物的基因組中［6］，由多個(gè)保守區(qū)和與之相間的多個(gè)可變區(qū)組成。保守區(qū)為所有細(xì)菌共有，細(xì)菌之間無顯著差異；可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在一定程度的差異，具有細(xì)菌種屬特異性。PCR擴(kuò)增16S rDNA V3-V4區(qū)，可將標(biāo)本中的細(xì)菌鑒定到門、屬乃至菌株水平。16 SrDNA測(cè)序技術(shù)因此被視為細(xì)菌鑒定與分類的金標(biāo)準(zhǔn)，具有通量高、速度快、準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢(shì)［7］。Mera等［8］人的研究報(bào)道了幽門螺桿菌的感染對(duì)身高和體重有重大影響。Goodman等［9］研究了幽門螺桿菌感染的學(xué)齡期兒童，結(jié)果顯示幽門螺桿菌感染后體重生長(zhǎng)速度減慢。在我們的研究中，幽門螺桿菌感染組患兒體重過低（BMI＜18.5 kg/m2），幽門螺桿菌感染后生長(zhǎng)受限，可能是幽門螺桿菌感染致慢性胃炎，難治性鐵缺乏性貧血的結(jié)果，另一種可能的解釋可能是胃炎影響了控制食欲的激素。成人幽門螺桿菌感染者胃內(nèi)菌群特征的研究表明，幽門螺桿菌能顯著影響胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)［10］，兒童幽門螺桿菌感染也會(huì)影響胃內(nèi)菌群狀態(tài)［11］。本研究結(jié)果證實(shí)，兒童幽門螺桿菌感染后胃黏膜細(xì)菌群落數(shù)量顯著下降，物種相對(duì)豐度下降。幽門螺桿菌感染也影響胃內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)差異，幽門螺桿菌感染患兒Prevotella普氏菌屬、Fusobacterium梭桿菌屬相對(duì)豐度升高，炎癥反應(yīng)程度會(huì)加劇。本研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌感染后Prevotella普氏菌屬、Fusobacterium梭桿菌屬相對(duì)豐度增高，病理組織結(jié)果顯示HP陽性組活動(dòng)性淺表性胃炎、出血性胃炎、胃潰瘍的比例增高，幽門螺桿菌可能與這些細(xì)菌相互作用，共同導(dǎo)致胃內(nèi)一系列疾病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，幽門螺桿菌感染影響兒童體重、胃內(nèi)病理組織、胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，幽門螺桿菌可能與胃內(nèi)菌群共同促進(jìn)胃部疾病的發(fā)生、發(fā)展。從胃微生態(tài)的角度，重建胃內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，對(duì)幽門螺桿菌感染相關(guān)疾病的治療有良好的臨床意義和應(yīng)用前景。