柳芬芳，李迎秋

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 食品科學與工程學院，濟南 250353)

常見的天然防腐劑有大豆堿性多肽、殼聚糖、納他霉素、ε-聚賴氨酸等[1-2]。ε-聚賴氨酸(ε-PL)作為一種新型的天然抑菌劑已經(jīng)被廣泛應用于食品保藏。ε-PL，又稱25～30個賴氨酸殘基的陽離子均聚物，分子量約為5000 kDa，由鏈霉菌好氧發(fā)酵產(chǎn)生[3]。ε-PL為淡黃色粉末，是一種食品添加劑，具有水溶性、食用性、對人體無毒、高溫穩(wěn)定、生物降解性好等特點，可以承受一般食品加工中的熱處理[4]，被FDA批準為公認的安全(GRAS)劑[5-6]。早在2003年，ε-PL就被FDA批準應用于食品保藏，并逐漸在美國、韓國和日本得到廣泛的應用。我國也于2014年將ε-PL納入食品添加劑使用范疇，具有廣泛的應用前景[7]。ε-PL可分解為賴氨酸，對人體無任何副作用，是一種賴氨酸來源且應用廣泛。

ε-PL對大多數(shù)革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌、真菌和病毒具有廣譜抗菌活性。據(jù)報道，極少量(100 mg/mL)的ε-聚賴氨酸足以達到對許多致病細菌的最低抑制濃度(MIC)[8]。因此，ε-PL可作為食品中的天然食品添加劑，也可作為日常食品及其生產(chǎn)設備中抗單核細胞增生桿菌的消毒劑。李誠等在ε-聚賴氨酸抑菌性能的研究中表明ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黃曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、保加利亞乳桿菌6種供試微生物均有一定的抑制作用。與化學防腐劑相比，ε-PL因具有高效、低毒的優(yōu)勢而深受生產(chǎn)者青睞[9]。

1 抗菌特性及效果

ε-PL對不同菌種的最小抑菌濃度見表1和表2，菌種不同，最小抑菌濃度不同。造成這種現(xiàn)象的原因可能是制備ε-PL的環(huán)境不同，制備步驟有所不同；另一種原因可能是不同的菌種有不同的活性，具有不同的結構。

表1 ε-PL對不同細菌的最小抑菌濃度Table 1 The MICs of ε-polylysine to different bacteria

表2 ε-PL對不同真菌的最小抑菌濃度Table 2 The MICs of ε-polylysine on different fungi

李誠等對ε-PL的抑菌性進行了研究，對抑制常見微生物的效果進行了比較。研究表明，ε-PL對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、保加利亞乳桿菌的抑菌效果較好，對黃曲霉的抑菌效果較差，且加熱后對抑菌效果影響不大。研究還發(fā)現(xiàn)，ε-PL和甘氨酸、Nisin復配后，由于協(xié)同作用，抗菌效果明顯增強。倪清艷等經(jīng)過發(fā)酵后得到粗制ε-PL，測定了其對常見菌的抑菌特性，結果表明ε-PL具有廣譜抗菌性。G+菌、G-菌和真菌經(jīng)過ε-PL處理后生長都受到了一定的抑制，且加熱后對抑菌效果影響不大。

2 抗菌機制

2.1 ε-PL對白色念珠菌的作用機制

余甜等用不同濃度的ε-PL處理白色念珠菌浮游菌株，研究其的抑菌活性。結果表明，ε-PL的抑菌效果呈濃度依賴性，對浮游菌株和生物膜的抑菌作用明顯。白色念珠菌的毒力主要依靠它的菌絲，從而導致病菌感染。衡量ε-PL對白色念珠菌菌絲的抑制作用體現(xiàn)在它的出芽率和芽管長度。結果表明，低濃度對菌絲沒有明顯抑制作用，在最低抑菌濃度和最小殺菌濃度下ε-PL對白色念珠菌的芽管出芽率和長度有明顯的抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。本實驗還研究ROS的氧化損傷與ε-PL濃度的關系。白色念珠菌產(chǎn)生的ROS含量與ε-PL劑量濃度呈正相關。MDA是一個重要指標，是膜脂質過氧化的主要產(chǎn)物，也是膜系統(tǒng)遭受壓力的標志。研究表明，ε-PL可以引起菌膜出現(xiàn)脂質過氧化損傷且與濃度無關，ROS和MDA含量與ε-PL的劑量濃度有關。在加入抗氧化劑后，MDA含量均出現(xiàn)了顯著下降。經(jīng)ε-PL處理過白色念珠菌后導致菌體內(nèi)產(chǎn)生過量ROS，ROS對細胞膜有脅迫作用，隨著丙二醛含量增加，丙二醛可以與核酸和蛋白質反應，從而改變菌體的結構和生物學特征，引發(fā)抑菌作用。

2.2 ε-PL對柑橘酸腐菌的作用機制

肖媛等[12]研究了ε-聚賴氨酸對柑橘酸腐菌的抑菌活性及作用機制，發(fā)現(xiàn)柑橘酸腐菌菌絲體生長和孢子萌發(fā)率的抑制作用隨著ε-PL劑量濃度的升高而增強，呈現(xiàn)出明顯的量效關系。細菌細胞膜可以保護細胞免受周圍環(huán)境的侵害，并負責運輸細胞生長和代謝所必需的營養(yǎng)素。一旦細胞膜受損，細胞內(nèi)的電解質滲漏到培養(yǎng)液中，致使培養(yǎng)液的電導率升高，細菌的生長和代謝就會被破壞、被抑制。ε-PL處理可以加快菌絲體的胞外電導率上升，且上升趨勢與ε-PL的處理時間和濃度有關，呈正相關。當菌體處于不利環(huán)境中時，隨著濃度的增加，細菌受到的破壞更嚴重，并且大多數(shù)細胞膜不再完整，細菌被透明化，內(nèi)容物K+、PO43-等小離子物質和DNA、RNA等大分子物質被釋放出來。隨著ε-PL濃度的增加，細胞內(nèi)含物的泄漏速率也增加。病原菌菌絲體形態(tài)的改變是抑菌活性物質重要的作用途徑，柑橘酸腐菌的菌剛開始表面光滑且完整，隨著處理劑量濃度的增加，菌絲體表面變得粗糙、有褶皺，最后崩潰、坍塌，內(nèi)容物泄露。

2.3 ε-PL對李斯特氏菌的作用機制

革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌細胞膜成分的完整性是決定細菌存活的關鍵因素。Lin Lin等研究了ε-聚賴氨酸對單核細胞增生李斯特氏菌的抗菌機理，發(fā)現(xiàn)ε-PL對單核細胞增生李斯特氏菌細胞膜有破壞作用。未經(jīng)處理的細菌似乎具有天然和完整的細胞結構。經(jīng)過ε-PL處理的細菌的外膜從細胞質上剝離下來，導致細胞內(nèi)含物泄漏。細菌細胞膜受損的原因可能是ε-PL在單核細胞增生李斯特氏菌表面上的靜電吸收。它導致外膜剝離和細胞質分布異常，導致細胞生理受損。細胞膜通透性的增加可能是由ε-PL與細胞膜之間的相互作用引起的。ε-PL破壞細胞膜并抑制ATP酶活性，從而導致細胞內(nèi)部和外部ATP平衡的喪失。未處理的單核細胞增生李斯特氏菌的條帶明顯且集中，而處理的細胞條帶模糊且分散。ε-PL對己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶以及EMP途徑具有破壞作用。此外，EMP途徑和RM的阻滯導致ATP、NADH和生物量減少，最終造成細菌的凋亡。ε-PL對單核細胞增生李斯特氏菌的呼吸代謝具有抑制活性，直接反映了能量的產(chǎn)生和生物量的積累。

2.4 ε-PL對釀酒酵母的作用機制

薄濤等[13]研究發(fā)現(xiàn)，ε-PL對釀酒酵母的抑菌作用呈濃度依賴性。當ε-PL的劑量少于200 μg/mL時對釀酒酵母生長的抑制作用不大，當劑量為200～500 μg/mL時釀酒酵母的生長受到明顯的抑制作用，而當劑量大于500 μg/mL時可使釀酒酵母死亡。經(jīng)過濃度為500 μg/mL的ε-PL處理后細胞表面會皺縮并出現(xiàn)孔洞，進而造成磷脂雙分子層的彎曲。

Tan Zhilei等[14]研究了ε-聚-L-賴氨酸對釀酒酵母細胞壁的影響及其抗菌機制。眾所周知，磷酸甘露糖基是釀酒酵母細胞壁中甘露糖蛋白的主要成分。ε-PL顯著影響細胞壁的組成，如β-1,3-葡聚糖、甘露糖基磷酸酯和幾丁質，從而使細胞壁更脆弱，通透性顯著增加。此外，ε-PL誘導了釀酒酵母細胞內(nèi)活性氧(ROS)的積累，并致使DNA斷裂。ε-PL處理菌體后導致原生質通過孔泄漏，最終導致細胞死亡。這些結果表明ε-PL可能具有復雜的抗菌作用模式，并且具有針對啤酒糖酵母細胞的多靶點機制。

2.5 ε-PL對粉紅聚端孢霉的作用機制

粉紅聚端孢霉是導致幾種水果和蔬菜收獲后腐爛的主要病原體。Wei Meilin等[15]研究了ε-PL對粉紅聚端孢霉的體外抑菌作用及其機理。結果表明，當ε-PL的濃度為100，200 μL/L時，粉紅聚端孢霉的菌絲體生長和孢子萌發(fā)受到明顯抑制。電導率和細胞外蛋白含量顯示，ε-PL處理分別破壞了菌絲體和孢子的質膜完整性，并降低了細胞外丙二醛(MDA)和糖含量。ε-PL處理還破壞了孢子的形態(tài)，由表面光滑變得粗糙，進而收縮。ε-PL嚴重破壞了粉紅聚端孢霉孢子的細胞壁和質膜，導致細胞質損失和液泡破裂。這些現(xiàn)象表明ε-PL有效地抑制了粉紅聚端孢霉的生長，其機制與細胞壁和細胞膜的損傷有關。

2.6 ε-PL對指狀青霉的作用機制

Liu Kewei等[16]研究了ε-聚賴氨酸對指狀青霉的抑制作用及其作用機理。在這項研究中，發(fā)現(xiàn)ε-PL對指狀青霉的抗真菌活性通過細胞膜損傷來表示。數(shù)據(jù)顯示，ε-PL顯著抑制了指狀青霉的菌絲生長、孢子萌發(fā)率和胚管長度。此外，ε-PL還有效減少了柑橘類水果的病變直徑。掃描電子顯微鏡顯示，ε-PL處理后菌絲體形態(tài)受到嚴重破壞。菌絲失去了光滑度，并顯示出不規(guī)則、皺縮和粗糙的表面，在較高濃度下會形成聚集和粘附。電導率測量和碘化丙啶測定表明，ε-PL處理指狀青霉使質膜喪失了完整性。丙二醛是膜脂質過氧化的主要產(chǎn)物，當膜系統(tǒng)遭受壓力時，它也是重要的標志之一。丙二醛的水平表明，ε-PL導致真菌病原體中脂質過氧化，且丙二醛水平與ε-PL濃度呈正相關。這些結果表明ε-PL可以作為化學農(nóng)藥的可持續(xù)的部分替代品。

2.7 ε-PL對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的作用機制

Li Yingqiu等[17]研究了ε-聚賴氨酸對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌特性及作用機制。經(jīng)ε-PL處理的金黃色葡萄球菌細胞表現(xiàn)出不規(guī)則褶皺的外表面，具有受損細胞或細胞碎片的破碎、粘附和聚集，而且這些細胞的大小和分布不均勻，但是，沒有ε-PL的細胞具有規(guī)則和球形形態(tài)，表面豐滿而光滑，大小和分布均一。類似地，未經(jīng)ε-PL處理的大腸桿菌細胞顯示出典型的桿菌狀形態(tài)，此外，表面顯得飽滿且有光澤。與對照相比，用ε-PL處理的大腸桿菌細胞具有不規(guī)則、干枯和粗糙的表面，形成聚集和粘附，此外，這些細胞的大小和分布不均勻。這些結果表明ε-PL處理導致對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌細胞的損害,抗菌活性隨著ε-PL濃度的增加而增加。ε-PL對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于大腸桿菌，這表明革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌對ε-PL的敏感性高于革蘭氏陰性細菌大腸桿菌。隨著ε-PL濃度的增加，菌體的電導率增加，這表明細胞質膜被破壞，從而引起細胞滲漏。此外，在前45 min，ε-PL對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用非常顯著。細菌細胞的泄漏可能是由于ε-PL和細胞質膜之間的相互作用引起的。金黃色葡萄球菌與對照相比，處理后的樣品中31 kDa以上的條帶種類和數(shù)量更多，這表明ε-PL可以通過破壞細胞蛋白來破壞細菌細胞。蛋白質條帶消失的原因可能是ε-PL干擾細菌細胞蛋白質的合成，也可能是由于細胞壁和細胞膜的損傷導致其泄露，出現(xiàn)新的蛋白條帶的原因可能是ε-PL引起細菌蛋白的聚集。

Hyldgaard等[18]也對ε-PL作用于大腸桿菌的抑菌機制進行了研究，他們測定了大腸桿菌細胞膜表面的Zeta電位，并研究了二價陽離子對抗菌活性的影響，同時通過原子力顯微鏡觀測了ε-PL對細胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)在對細胞膜進行熒光標記后，有熒光小囊泡的形成，這進一步驗證了ε-PL的抑菌機理可能與抗菌肽抑菌機理中的氈毯模型類似。

3 ε-PL在食品中的應用

3.1 ε-PL在飲料中的應用

呂志良等[19]研究了ε-PL在玉米汁飲料中的防腐效果。最佳效果是在玉米汁飲料中添加30 mg/kg的ε-PL，這樣在37 ℃的條件下可以至少保存30 d，使得貨架期延長，且有復合穩(wěn)定劑的飲料中ε-PL依舊有顯著的防腐效果。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)0.1%蔗糖脂肪酸酯、0.1%卡拉膠和0.2%羧甲基纖維素是最佳的復合穩(wěn)定劑。吳勤等[20]對ε-PL在藍莓汁飲料中的效果進行了研究，發(fā)現(xiàn)ε-PL對藍莓汁飲料的pH、色澤、總酸含量沒有顯著性影響，但是對可溶性固形物含量的影響很大。ε-PL在未經(jīng)過殺菌處理的藍莓汁飲料中的最高抑菌率為79.7%，且抑菌效率一般。ε-PL對經(jīng)過低溫巴氏殺菌的藍莓汁飲料進行處理，發(fā)現(xiàn)尚有微生物存活。綜上所述，在藍莓汁飲料中ε-PL的抑菌效果受到明顯影響，可以防腐劑復配來發(fā)揮其的抑菌作用。鄭柏根[21]研究了ε-聚賴氨酸鹽酸鹽在蘇打水飲料中的作用，聚賴氨酸鹽酸鹽添加在蘇打水飲料中可以顯著抑制微生物的增長，使貨架期得到延長。作為一種天然防腐劑，對蘇打水的口感也沒有明顯的影響。徐紅華等[22]研究了ε-PL在牛奶保鮮中的作用，通過雙因素交互作用發(fā)現(xiàn)聚賴氨酸與甘氨酸復配可以使牛奶得到更好的保鮮，使其貨架期得到延長。最佳配比為420 (mg/L)的PL與2%的甘氨酸，可以延長保質期至11 d。PL與其他天然抑菌劑復配，有明顯的協(xié)同增效作用，可以大大提高其抑菌能力，為之后在食品中的應用奠定了基礎。

3.2 ε-PL在水產(chǎn)及魚糜中的應用

Cai Luyun等研究了ε-聚賴氨酸與海藻酸鈉復合處理對日本鱸魚冷藏過程中理化及微生物特性的影響。對新型ε-聚賴氨酸/海藻酸鈉(PLSA)處理的日本鱸魚在(4±1) ℃貯藏16 d的感官和理化特性的影響進行了研究，測定了鱸魚的pH值、總揮發(fā)性堿氮、游離脂肪酸、K值、硫代巴比妥酸活性物質、色澤、質地、微生物和感官質量。研究發(fā)現(xiàn)，用PLSA包衣的鱸魚保持了肉的色澤和組織硬度，并顯示出較對照組低的微生物數(shù)量，包括中溫菌、嗜冷菌、腸桿菌、乳酸菌和酵母菌。此外，PLSA涂層還延緩了脂質氧化、蛋白質降解和核苷酸分解的變化。結果還表明，PLSA涂膜能有效地保持鱸魚在貯藏期間的感官品質，其效果優(yōu)于單獨用PL或SA處理。因此，PLSA涂層可用于鱸魚的保鮮，以延長其貨架期，提高其保鮮質量。

李唐飛等[23]研究了聚賴氨酸對冷藏魚糜制品在保存期間的影響。魚糜制品在保存期間容易腐敗，使其品質受到影響。為了新鮮的魚糜制品能得到很好的保存，研究了聚賴氨酸在其貯藏期間對微生物的抑制作用，以及對魚糜制品質構、持水性、白度等方面的影響進行了研究。假單胞菌屬為魚糜制品冷藏前期的優(yōu)勢菌群，后期為芽孢桿菌。聚賴氨酸對它們都有抑菌作用并且添加一定濃度的聚賴氨酸能增加魚糜的凝膠性能。

3.3 ε-PL在濕面條中的應用

李維娜等[24]研究了ε-PL在濕面條中的防腐作用。濕面條水分含量多，容易滋生細菌。研究表明，ε-PL對濕面條的抑菌效果很明顯。ε-PL通過浸泡的方式對面條進行處理，最佳濃度為0.15%；當ε-PL與醋酸復配使用時最佳配比為0.1% ε-PL和0.25%醋酸，也是通過浸泡處理。ε-PL溶液浸泡熟面條比直接添加到面粉中防腐效果好且成本低，為ε-PL在面條防腐中的應用提供了依據(jù)。張春紅等[25]也對ε-PL在濕面條中的防腐性能進行了研究，最大使用量為200 mg/kg。聚賴氨酸的復配防腐劑比常用的化學保鮮劑成本低、保存期長且防腐效果好。

3.4 ε-PL在肉制品中的應用

肉制品中使用最多的仍然是化學防腐劑，但天然防腐劑要更安全一些[26]。賀羽等[27]對冷卻豬肉用一種或復配的保鮮劑的保鮮效果和品質的變化進行了研究。研究表明，4 ℃時用不同濃度的ε-PL處理冷卻豬肉，能有效抑制細菌總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮、pH值的升高。此外，還發(fā)現(xiàn)ε-PL對豬肉具有一定的護色作用，但是ε-PL對豬肉的保水能力不好，基本上沒有改善，ε-PL的最佳保鮮濃度為0.24%。還研究了乙酸的防腐效果，發(fā)現(xiàn)乙酸減緩了細菌總數(shù)的上升，有一定的防腐作用，但在護色方面作用不明顯。研究了復配保鮮劑殼聚糖和ε-PL的防腐效果，處理后的豬肉同ε-PL處理效果一樣，但抑制效果更明顯，在護色方面發(fā)揮了一定的作用。復配劑比單一的防腐劑防腐性能要好。浸泡處理后不但能夠有效地延緩樣品的細菌總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮數(shù)值以及 pH 值的上升，最佳配比為0.24% 的ε-PL和1.8%的殼聚糖。

Li Yingqiu等[28]研究了ε-PL對儲存的冷凍豬肉的物理化學特征的影響，用ε-PL處理在貯藏期間冷凍豬肉的TBC、pH值、TVB-N、高鐵肌紅蛋白含量顯著減少(p<0.05)，并且感官評分顯著提高，TBA沒有改變。研究表明，1.25%的 ε-PL能有效地抑制細菌的生長和繁殖，增強對冷凍豬肉的防腐性能，因此，ε-PL對冷凍豬肉有良好的潛在的防腐和延長貨架期的能力。

4 結論

ε-聚賴氨酸作為一種新型的天然抑菌劑，由鏈霉菌好氧發(fā)酵產(chǎn)生，對一些細菌和真菌的生長和繁殖有抑制作用。ε-PL會破壞它們的細胞結構，如：細胞膜、細胞壁和細胞器等，會影響細胞正常的功能代謝，造成一些物質的泄露，從而導致細胞的死亡。ε-PL對乳制品、肉制品、海產(chǎn)品和淀粉食品有良好的防腐效果，且制備過程簡單、成本低、效果好，在將來食品防腐中占有重要地位。