陳悅，胡璇，于福來(lái)，王凱，謝小麗，袁媛，徐子琪

(1.海南大學(xué) 林學(xué)院，?？?570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/海南省熱帶藥用植物工程研究中心，?？?571101；3.廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院， 廣州 510006；4.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250014)

芳香植物是指具有芳香氣味且可供提取植物精油的栽培植物和野生植物[1]。我國(guó)海南島自古以來(lái)就被稱為香島，相對(duì)于其他芳香藥用植物生產(chǎn)省份具有得天獨(dú)厚的環(huán)境和資源優(yōu)勢(shì)，但海南島芳香植物的開(kāi)發(fā)利用還不夠深入，其生物活性有待進(jìn)一步的挖掘和探索。植物精油又稱揮發(fā)油或香精油，是以植物的花、葉、根莖、果實(shí)等為原料,以蒸餾、壓榨、溶劑萃取等方式提煉出來(lái)的芳香味油狀液體[2]。2020年年初，新型冠狀病毒疫情暴發(fā)引起全世界的高度關(guān)注，在疫情防控過(guò)程中，消毒抑菌劑成為必需品。但近年來(lái)抗生素的長(zhǎng)期使用使得致病細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題日漸突出，尋求綠色、高效、安全且環(huán)保的植物抑菌原料已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[3-4]，對(duì)芳香植物精油進(jìn)行抑菌活性的研究，從中尋找具有良好抑菌活性的芳香植物精油，有利于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)抑菌產(chǎn)品的創(chuàng)新和研發(fā)[5-7]。基于此，本實(shí)驗(yàn)選擇了海南島18種常見(jiàn)芳香植物提取的精油，通過(guò)對(duì)5種需氧細(xì)菌進(jìn)行體外抑菌效果的對(duì)比研究，初步篩選出較佳抑菌活性的芳香植物精油，為海南島芳香植物資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供了一定的理論依據(jù)和參考。

1 材料

1.1 儀器

XFS-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋 浙江新風(fēng)醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州廣源凈化科技有限公司；DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Sartarius CPA225D電子分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DU-800紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 美國(guó)貝克曼公司。

1.2 藥材與試劑

18種芳香植物精油：均購(gòu)自海南萬(wàn)寧興隆南藥植物精油館，純度為100%，規(guī)格均為10 mL，于4 ℃儲(chǔ)存，其詳細(xì)信息見(jiàn)表1。鏈霉素S8290：購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇(分析純)：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 18種芳香植物精油信息Table 1 The information of 18 aromatic plant essential oils

續(xù) 表

1.3 菌株與培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC 6538、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisATCC 9372、大腸桿菌EscherichiacoliATCC 25922、銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC 27853：由青島大學(xué)藥學(xué)院李剛老師贈(zèng)送；肺炎克雷伯氏菌KlebsiellapneumoniaeBNCC 102997：購(gòu)自于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。MHA培養(yǎng)基(Mueller-Hinton Agar)和MHB培養(yǎng)基(Mueller-Hinton Broth)：均購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 供試菌懸液的制備

在無(wú)菌條件下，取甘油凍存的標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌分別接種至MHB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，于MHA培養(yǎng)基中劃線使其能形成單個(gè)菌落，將接種平板放置于37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取典型單個(gè)菌落接種至MHB培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度OD600為0.5～0.6之間，檢驗(yàn)純度后用MHB培養(yǎng)基分別將各菌液稀釋成1×106CFU/mL的菌懸液備用。

2.2 供試藥液的制備

將18種芳香植物精油(見(jiàn)表1)用無(wú)水乙醇稀釋配制成質(zhì)量濃度為500 mg/mL的樣品溶液，以溶劑無(wú)水乙醇為陰性對(duì)照，15 μg/mL的鏈霉素為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)前所有藥液均用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，置于4 ℃冰箱冷存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 抑菌圈測(cè)定

采用濾紙片瓊脂平板擴(kuò)散法[8]，在無(wú)菌條件下，將已滅菌并冷卻至50 ℃左右的MHA培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，水平放置凝固后，用移液槍分別吸取各菌懸液200 μL于培養(yǎng)基平板上，均勻涂布后備用。用移液槍分別吸取2.2項(xiàng)下濃度的各藥液20 μL滴于無(wú)菌濾紙片(d=6 mm)上，充分吸收后，將其貼在已涂布的各菌液培養(yǎng)基平板上，并標(biāo)記好各藥液的名稱，每個(gè)菌重復(fù)3次，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察并記錄抑菌圈的有無(wú)以及直徑大小作為判斷敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)，采用十字交叉法量取抑菌圈直徑大小，取其平均值作為測(cè)定結(jié)果。結(jié)果判定按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》為標(biāo)準(zhǔn)：直徑>20 mm為極敏，15～20 mm為高敏，10～15 mm為中敏，<10 mm為低敏。

2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

采用微量二倍稀釋法[9]，在96孔板上進(jìn)行，從A1開(kāi)始為第1孔，從左到右，每個(gè)板上1～10孔為藥液，11，12孔分別為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)板只能加1種菌。首先用移液槍向每排1～12個(gè)孔各加入100 μL各菌懸液，再分別吸取2.2項(xiàng)下濃度的各精油樣品溶液100 μL至第一孔，依次對(duì)第1～10孔做梯度稀釋，使其精油濃度分別為250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98，0.48 mg/mL，11，12孔分別加入5 μL的無(wú)水乙醇溶液和3 μg/mL的鏈霉素溶液，充分混勻，每種細(xì)菌3個(gè)重復(fù)。最后將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，比較檢測(cè)組與對(duì)照組渾濁度差異，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC。

2.5 最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

采用瓊脂培養(yǎng)基平板法，取MIC以上未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的孔內(nèi)混合液于MHA培養(yǎng)基中均勻涂布，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以菌落數(shù)不超過(guò)5個(gè)的平板所對(duì)應(yīng)孔中的最低濃度為該藥物的MBC。

3 結(jié)果

3.1 藥敏試驗(yàn)

由表2可知，18種芳香植物精油對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌具有不同抑制作用，其中月桂、羅勒、香茅和馬郁蘭精油對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為高度敏感，巖蘭草精油和廣藿香精油無(wú)抑菌圈出現(xiàn)，其余12種精油分別表現(xiàn)為9種低度敏感和3種中度敏感；巖蘭草精油和廣藿香精油對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均未檢測(cè)出抑菌圈，其余16種精油對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均表現(xiàn)為低度敏感和中度敏感；18種芳香植物精油對(duì)銅綠假單胞菌均具有一定的敏感反應(yīng)，其中百里香精油和羅勒精油為高敏反應(yīng)，其余精油分別表現(xiàn)為9種低度敏感和7種中度敏感；百里香、天竺葵、羅勒、依蘭、香茅和馬郁蘭6種精油對(duì)肺炎克雷伯氏菌表現(xiàn)為高度敏感，廣藿香精油無(wú)抑菌圈出現(xiàn)，其余11種精油分別表現(xiàn)為9種低敏和2種中敏反應(yīng)。抑菌效果見(jiàn)圖1。其中羅勒精油對(duì)5種細(xì)菌表現(xiàn)出的藥敏作用最好，抑菌圈大小分別為金黃色葡萄球菌16.31 mm、枯草芽孢桿菌14.5 mm、大腸桿菌14.65 mm、銅綠假單胞菌16.76 mm、肺炎克雷伯氏菌17.09 mm；廣藿香精油和巖蘭草精油對(duì)5種細(xì)菌表現(xiàn)出的藥敏作用較差，其中廣藿香精油的敏感度最差，僅對(duì)銅綠假單胞菌具有作用，抑菌圈為8.10 mm。

表2 18種芳香植物精油對(duì)5種細(xì)菌的抑菌圈直徑Table 2 The inhibitory zone diameters of 18 aromatic plant essential oils to 5 bacteria

續(xù) 表

圖1 18種芳香植物精油對(duì)5種細(xì)菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effect of 18 aromatic plant essential oils to 5 bacteria

3.2 MIC值測(cè)定結(jié)果

表3 18種芳香植物精油對(duì)5種細(xì)菌的MIC值(n=3)Table 3 The MIC values of 18 aromatic plant essential oils to 5 bacteria (n=3)

由表3可知，18種芳香植物精油中巖蘭草精油、廣藿香精油和葡萄柚精油無(wú)抑菌活性，其他15種植物精油對(duì)5種細(xì)菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用，MIC在0.49～62.5 mg/mL之間，其中月桂、百里香、羅勒和馬郁蘭精油對(duì)5種細(xì)菌的抑菌效果最強(qiáng)(MIC均為0.49 mg/mL)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同芳香植物精油對(duì)不同細(xì)菌的抑菌強(qiáng)度具有一定的差異，茉莉精油對(duì)銅綠假單胞菌無(wú)抑菌活性，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制活性較弱(MIC為62.5 mg/mL)，但對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌則表現(xiàn)出較好的抑菌活性(MIC均為7.81 mg/mL)；佛手柑精油則僅對(duì)枯草芽孢桿菌和肺炎克雷伯氏菌具有較弱的抑菌活性(MIC均為62.5 mg/mL)。

3.3 MBC值測(cè)定

18種芳香植物精油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的殺菌效果均不理想，其中僅有依蘭精油對(duì)大腸桿菌具有殺菌作用，MBC值為250 mg/mL；月桂、百里香、天竺葵、依蘭和馬郁蘭5種精油對(duì)金黃色葡萄球菌具有殺菌作用，其中百里香精油和馬郁香精油的MBC值為125 mg/mL，其余精油的MBC值均為250 mg/mL；依蘭、香茅和天竺葵3種精油對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的殺菌作用相同，MBC值均為250 mg/mL。18種芳香植物精油對(duì)肺炎克雷伯氏菌的殺菌效果比較理想(見(jiàn)表4)，其中巖蘭草、廣藿香和葡萄柚3種精油對(duì)肺炎克雷伯氏菌無(wú)殺菌效果，其余15種精油的殺菌效果表現(xiàn)為：月桂=羅勒=馬郁蘭>百里香>安息香>金盞花=芹菜=依蘭>羅馬洋甘菊=茉莉>天竺葵>佛手柑>茶樹(shù)=迷迭香=香茅。

表4 18種芳香植物精油對(duì)肺炎克雷伯氏菌的MBC值(n=3)Table 4 The MBC values of 18 aromatic plant essential oils to Klebsiella pneumoniae (n=3)

4 討論

本研究采用體外抑菌試驗(yàn)方法，對(duì)海南島常見(jiàn)18種芳香植物精油體外抑菌活性進(jìn)行測(cè)定和分析，實(shí)驗(yàn)選擇了5種需氧細(xì)菌，包括了革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌，MIC和MBC數(shù)據(jù)與抑菌圈直徑數(shù)據(jù)趨勢(shì)一致，說(shuō)明所選芳香植物精油中具有良好抑菌效果的精油。MIC實(shí)驗(yàn)中月桂精油、百里香精油、羅勒精油、馬郁蘭精油對(duì)5種細(xì)菌均表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑菌性，與前人[10]報(bào)道的月桂精油具有良好的抑菌效果一致，與Singh等、丁華等報(bào)道的羅勒具有較強(qiáng)抑菌作用的結(jié)論相符合[11-12]；其中香茅精油對(duì)3種細(xì)菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑菌性，最小抑菌濃度均為0.49 mg/mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這幾種芳香植物精油具有一定的廣譜抑菌效果。但有些精油僅對(duì)單一細(xì)菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑菌性，如安息香精油對(duì)金黃色葡萄球菌、依蘭精油對(duì)大腸桿菌。MBC實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)18種芳香植物精油僅對(duì)肺炎克雷伯氏菌表現(xiàn)出明顯的殺菌作用，其中月桂精油、羅勒精油和馬郁蘭精油的殺菌作用最強(qiáng)，最小殺菌濃度均為0.49 mg/mL。肺炎克雷伯氏菌是引起肺炎的主要致病菌，屬于革蘭氏陰性桿菌，這一結(jié)果可為芳香植物精油在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用提供一定的參考。18種芳香植物精油對(duì)其他4種細(xì)菌無(wú)殺菌作用或殺菌作用弱，大部分精油對(duì)一些細(xì)菌只具有抑菌活性，不具備殺菌作用，這可能與精油的組成成分和抑菌機(jī)制相關(guān)。植物精油為一類(lèi)化學(xué)成分復(fù)雜的揮發(fā)油類(lèi)成分，為芳香植物的精制粗提物，不如單一化學(xué)藥物具有強(qiáng)有力的殺菌效果，但是其綠色天然，無(wú)毒安全，來(lái)源廣泛，提取工藝簡(jiǎn)單可取，其通過(guò)抑菌作用發(fā)揮生物活性，在抑菌領(lǐng)域仍然具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值[13]。

綜上所述，月桂、羅勒和馬郁蘭3種芳香植物精油是綜合抑菌效果最好的3種精油，其次是百里香精油，其他精油也對(duì)不同菌種表現(xiàn)出一定的抑菌活性。植物精油可以通過(guò)破壞細(xì)胞膜功能、影響脂質(zhì)層穩(wěn)定及溶解胞體中的脂肪體、抑制菌體中DNA和RNA等物質(zhì)的合成、影響能量代謝途徑和破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)這5種途徑發(fā)揮抑菌和殺菌作用[14]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)精油抑菌機(jī)制的報(bào)道相對(duì)較少，值得進(jìn)一步的探索和深入研究，為植物精油的抑菌作用提供了理論支撐。