劉 月，高云云，李 珊，李王強(qiáng)，李寶坤,*，盧士玲，蔣彩虹，王慶玲，董 娟，李宇輝

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000）

益生菌被定義為足量攝入時能夠?qū)λ拗鞯慕】祹硪嫣幍幕畹奈⑸?，因此在食用時產(chǎn)品中的益生菌最低含量至少為106CFU/mL或106CFU/g[1]。益生菌主要包括乳酸桿菌和雙歧桿菌，而某些酵母菌如釀酒酵母、布拉迪酵母、馬克思克魯維酵母和庫德畢赤酵母也具有潛在的益生特性[2-3]。酵母菌對病原微生物具有較強(qiáng)的抵抗力，較強(qiáng)的抗氧化能力以及對抗生素的不敏感性，可用于治療由抗生素引起的腹瀉[4-5]。研究表明，使用布拉迪酵母可能影響肥胖和II型糖尿病小鼠的腸道菌群，并減輕體質(zhì)量，以及治療肝脂肪變性和全身性炎癥的發(fā)生[6]。據(jù)報道，庫德畢赤酵母可以提高大鼠模型的血漿抗氧化活性水平并降低血清脂質(zhì)水平[7]。但在發(fā)酵、分離、貯藏和食用過程中，菌株活力的降低不可避免地會影響其對功能性食品的實際功效。當(dāng)菌株處于胃腸道條件或其他不利環(huán)境中時，在胃液中低pH值誘導(dǎo)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化（例如，酵母菌細(xì)胞壁在酸性條件下幾丁質(zhì)的含量降低），對細(xì)胞壁的破壞可能暴露出細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞膨壓的降低，可能引起細(xì)胞裂解，降低細(xì)胞活力[8-9]；在腸液中膽鹽（特別是膽酸）使細(xì)胞產(chǎn)生形態(tài)變化，引起細(xì)胞腫脹和塌陷，影響菌株的生長[10]。因此，維持菌株的活力對于其對宿主發(fā)揮有益作用至關(guān)重要。

近年來，包埋法被認(rèn)為是提高微生物對不利環(huán)境抵抗力的有效方法之一，使用藻酸鹽包埋微生物的方法簡單、經(jīng)濟(jì)且不需要加熱，因此對微生物的損傷較小[11]。然而，通過離子凝膠法形成的藻酸鹽顆粒表面有較多的孔隙，不能有效地保護(hù)微生物免受不利環(huán)境的影響[12]。使用不同的材料包埋益生菌，或者使用可食用基質(zhì)對微膠囊進(jìn)行包衣可以提高菌株的穩(wěn)定性，從而在微膠囊解崩前保護(hù)菌株的活性[13]。因此，益生元[14]和乳制品[15]等多種材料可作為藻酸鹽微膠囊的保護(hù)性包埋材料。研究表明，使用益生菌和益生元（稱為“合生元”食品）的組合開發(fā)功能性食品可以有效地調(diào)節(jié)血壓，降低血清膽固醇水平以及改善動物模型的消化能力[16]。益生元包括低聚果糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS）、菊粉、低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）、異麥芽寡糖以及多糖類（例如抗性和改性淀粉）等，可以選擇性地刺激益生菌在胃腸道中的生長和活性[17]。據(jù)報道，低聚糖與藻酸鹽結(jié)合使用可以改善微膠囊的抗性[18-19]。低聚糖（不高于3%）與藻酸鹽可能通過氫鍵在生物聚合體系中相互作用，低聚糖填充了微膠囊的凝膠網(wǎng)絡(luò)的間隙空間，形成具有自由連接位點的鍵，減小凝膠的孔徑，形成致密的相互連接結(jié)構(gòu)，并通過增加微膠囊的強(qiáng)度和密度增強(qiáng)菌株對胃腸道的抵抗力[20]。Krasaekoopt等[18]報道在微膠囊中加入GOS為益生菌提供了更好的保護(hù)作用，不僅增強(qiáng)微生物在模擬消化系統(tǒng)中的活性，還在貯藏期間促進(jìn)酸奶和果汁中微膠囊化益生菌的生長。研究表明，將FOS添加至微膠囊基質(zhì)中，有助于在模擬胃腸道期間更好的保護(hù)并控制菌株的遞送，并提高益生菌在酸奶中的生存能力[19]。

此外，微膠囊與具有乳化作用的其他材料的組合可進(jìn)一步增強(qiáng)包埋微生物的穩(wěn)定性。山羊乳由于其良好的特性（例如合適的pH值，良好的緩沖能力和高營養(yǎng)成分），被認(rèn)為是開發(fā)多種新型產(chǎn)品（例如微膠囊）的絕佳基質(zhì)。Ranadheera等[21]報道使用山羊乳制品作為益生菌的載體基質(zhì)可能會影響菌株在胃腸道的功能特性，因為這種產(chǎn)品在消化過程中可作為微生物的保護(hù)性基質(zhì)。羊乳中的蛋白質(zhì)由70%酪蛋白、25%乳清蛋白和5%脂肪球膜蛋白組成，這3 種蛋白質(zhì)已被用作微膠囊的載體[22-23]。乳蛋白（尤其是酪蛋白和乳清蛋白）具有雙親結(jié)構(gòu)和良好的表面特性，可促進(jìn)界面處的吸附并有助于穩(wěn)定乳劑。這些蛋白質(zhì)與其他聚合物結(jié)合使用時，由于其結(jié)構(gòu)、柔韌性和聚集狀態(tài)，可增加微膠囊表面的穩(wěn)定性[24]。酪蛋白與乳清蛋白可能具有協(xié)同作用，Burgain等[25]報道結(jié)合使用酪蛋白和乳清蛋白包埋鼠李糖乳桿菌比單獨使用其中一種蛋白對菌株的保護(hù)性和穩(wěn)定性更高。此外，Clark等[26]指出，山羊乳脂肪球的最大比例直徑小于4 μm，而牛乳的脂肪球直徑大于4 μm。山羊乳中由于缺乏凝集素使乳中的脂肪不會形成聚集體，而牛乳中的凝集素導(dǎo)致脂肪小球的聚集。據(jù)報道，山羊乳中含有酪蛋白的膠體顆粒比牛乳小[27]。因此，當(dāng)使用山羊乳對藻酸鹽微膠囊進(jìn)行包衣時，其通過對藻酸鹽的改性使微膠囊具有更均勻和致密的表面形態(tài)，防止干燥后微膠囊表面乳粉的聚結(jié)，且乳蛋白與藻酸鹽相互作用使微膠囊表面的孔隙率減少，降低了有害的環(huán)境因素對微生物的影響，增加了微膠囊的保護(hù)作用。Prasanna 等[15]報道使用山羊乳與藻酸鹽進(jìn)行包埋可以提高雙歧桿菌在不利環(huán)境下的存活率。研究表明，使用藻酸鹽-山羊乳-菊粉包埋雙歧桿菌可在模擬胃腸道條件（simulated gastro intestinal digestion，SGID）下和發(fā)酵山羊乳酸奶過程中提高菌株的活性[28]。

庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）又稱東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和克柔念珠菌（Candida krusei），在自然界廣泛分布（例如土壤、水果和各種食物），并且能夠從自然發(fā)酵的食品中分離得到菌株[29]。實驗室前期從新疆塔城地區(qū)傳統(tǒng)乳制品酸駝乳中分離得到一株具有潛在益生特性的庫德畢赤酵母DS8-1[30]，菌株表現(xiàn)出對于模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF ）較好的耐受性、自聚能力和疏水性，并且對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制能力。但庫德畢赤酵母DS8-1在模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）中不具有良好的穩(wěn)定性，Greppi等[31]從發(fā)酵谷物中分離得到54 株庫德畢赤酵母，其中69%的菌株活力在pH 2的條件下能夠被不同程度的抑制。因此需要對菌株進(jìn)行保護(hù)以提高酵母菌對胃腸道環(huán)境的抗性。據(jù)報道，使用殼聚糖外包衣的藻酸鹽微膠囊包埋具有潛在益生特性的酵母菌（巴氏畢赤酵母、解脂耶氏酵母、異常威克漢姆酵母）和釀酒酵母，能夠提高酵母菌在模擬消化液中的活性[32]。Kim等[33]通過藻酸鹽包埋并使用保護(hù)劑（10%的脫脂乳和10%不同糖溶液）浸泡有助于保護(hù)庫德畢赤酵母免受環(huán)境影響。研究表明，加入益生元能夠提高布拉迪酵母菌微膠囊在貯藏過程中細(xì)胞的活力[34]。

為了探究山羊乳-FOS/GOS-藻酸鹽微膠囊對庫德畢赤酵母的保護(hù)作用，以及在實際應(yīng)用中的價值，制備了使用羊乳外包衣并添加FOS/GOS和藻酸鹽復(fù)合凝膠包埋酵母菌，并研究凍干微膠囊暴露于模擬胃腸液以及在不同溫度貯藏過程中對酵母菌的保護(hù)作用，為新型具有潛在益生特性微膠囊的研發(fā)和體外評估提供參考與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

具有潛在益生特性的庫德畢赤酵母DS8-1（GenBank登錄號為MT157508）為實驗室前期從新疆塔城地區(qū)傳統(tǒng)乳制品酸駝乳中分離得到，菌株的代謝產(chǎn)物具有α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，被用作本實驗的目標(biāo)菌株。實驗開始前將酵母菌活化3 次，后按4%（V/V）接種量接入YPD肉湯中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗。

液體酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）和YPD瓊脂培養(yǎng)基青島海博生物技術(shù)有限公司；海藻酸鈉 天津市福晨化學(xué)試劑廠；山羊乳 山東陽春羊奶乳業(yè)有限公司；FOS、GOS、菊糖、乳果糖、α-淀粉酶（3 700 U/g）、α-葡萄糖苷酶（360 000 U/g）和阿卡波糖 北京索萊寶科技有限公司；低聚異麥芽糖 上海麥克林生化科技有限公司；對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenylα-D-glucopyranoside，PNPG） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備公司；5417R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；EON多功能酶標(biāo)儀 美國BIOTEK儀器有限公司；S-4800掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立株式會社； VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 益生元存在下酵母菌生長分析

基于Kuerman等[35]方法并稍作修改。將培養(yǎng)24 h后的酵母菌以1%接入補充FOS、GOS、菊粉、乳果糖、低聚異麥芽糖和葡萄糖的無碳源YPD肉湯中，其中補充碳源的終質(zhì)量濃度為10 g/L。無補充碳源添加的YPD肉湯用作菌株生長的陰性對照。將含有1%酵母菌的培養(yǎng)物在37 ℃孵育48 h，每4 h取出菌懸液置于600 nm波長處測其吸光度。

1.3.2 酵母菌微膠囊的制備

基于Wang Lijun等[13]的方法制備微膠囊。將培養(yǎng)24 h后的酵母菌重懸于20 g/L海藻酸鈉溶液中，并在其中分別加入10 g/L FOS和GOS。將混合物使用磁力攪拌器充分混合后，通過針頭規(guī)格為0.45 mm的無菌注射器滴加到0.1 mol/L無菌CaCl2溶液中以制備酵母菌膠囊。固定30 min后，通過使用無菌濾紙（孔徑80～120 μm）和三角漏斗過濾收集微膠囊，使用1 g/L無菌蛋白胨溶液洗滌2 次，浸入山羊乳中并輕輕搖動。使用無菌生理鹽水將羊乳涂層的酵母菌膠囊洗滌3 次。于-80 ℃預(yù)凍12 h，并真空冷凍干燥12 h得到游離庫德畢赤酵母（FC）、干燥的藻酸鹽（SA）包埋庫德畢赤酵母、干燥的藻酸鹽-羊乳（SAM）包埋庫德畢赤酵母、干燥的FOS-藻酸鹽-羊乳（SAMF）包埋庫德畢赤酵酵母和干燥的GOS-藻酸鹽-羊乳（SAMG）包埋庫德畢赤酵母。

1.3.3 微膠囊的表征

1.3.3.1 包埋率

參考Wang Lijun等[13]的方法，并稍作修改。分別取4 種微膠囊各1 g加入至9 mL 0.1 mol/L無菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，使用搖床在200 r/min下振搖150 min。取菌懸液用8.5 g/L無菌生理鹽水梯度稀釋后涂布于YPD瓊脂上，28 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。

微膠囊的包埋率按照式（1）計算[36]。

式中：N為包埋于微膠囊中的活菌總數(shù)；N0為制備微膠囊時濃縮菌液中的活菌總數(shù)。

1.3.3.2 SEM分析

分別取4 種酵母菌微膠囊置于玻璃皿內(nèi)，用1%的四氧化鋨氣體固定，使用雙面膠將其粘在樣品臺上，在真空鍍膜機(jī)中噴金，然后用掃描電鏡觀察微膠囊的表觀形貌（加速電壓15 kV）。

1.3.3.3 FTIR分析

分別取4 種微膠囊以及各種包埋組分分別與干燥的KBr進(jìn)行混合，研磨、壓片。使用FTIR儀以2 cm-1的分辨率在4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)掃描樣品。

1.3.4 酵母菌微膠囊在SGF中的存活情況

SGF：參考Rodriguez等[37]的方法，在9 g/L NaCl溶液中加入3 g/L（3 000～3 500 NFU/g）胃蛋白酶，12 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0。取4 種包埋酵母菌樣品各0.1 g或0.01 g游離酵母菌，分別置于10 mL SGF中，37 ℃培養(yǎng)3 h。在0、1、2、3 h時，收集微膠囊或菌液和胃液的混合物1 mL，加入至9 mL 0.1 mol/L無菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，200 r/min搖動150 min。取菌懸液用8.5 g/L無菌生理鹽水梯度稀釋后涂布于YPD瓊脂上，28 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。以第0小時的活菌數(shù)為對照，根據(jù)式（2）計算菌株存活率：

1.3.5 酵母菌微膠囊在SGID下連續(xù)培養(yǎng)后的存活及體外釋放

SIF（pH 8.0）[37]：使用3.0 g/L牛膽鹽，6.5 g/L NaCl，0.835 g/L KCl，0.22 g/L CaCl2，1.386 g/L NaHCO3和1 g/L（250 NFU/g）胰蛋白酶制成。取4 種包埋酵母菌樣品各0.1 g，分別置于10 mL SGF中充分混合，37 ℃培養(yǎng)2 h。在第0、1、2小時，收集微膠囊或菌液和胃液的混合物，按照1.3.4節(jié)的方法進(jìn)行計數(shù)。取2 h后SGF中的樣品，使用8.5 g/L無菌生理鹽水洗滌2 次，置于10 mL SIF中充分混合，37 ℃培養(yǎng)4 h。在第1、2、3、4小時取1 mL釋放介質(zhì)，使用8.5 g/L無菌生理鹽水梯度稀釋后涂布于YPD瓊脂上，28 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.3.6 酵母菌微膠囊在SGID條件下的生物活性

參考文獻(xiàn)[38]方法稍作修改。取4 種包埋酵母菌樣品各0.1 g或0.01 g游離酵母菌，分別懸浮在10 mL SGF中，37 ℃孵育2 h。收集樣品，置于10 mL SIF中，37 ℃孵育2 h，4 ℃、5 000×g離心10 min，使用無菌生理鹽沖洗3 次，并重懸于10 g/L無菌蛋白水溶液中。將細(xì)胞懸浮液在37 ℃進(jìn)一步孵育6 h以產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，冰浴中進(jìn)行超聲破碎30 min，10 000×g離心15 min除去細(xì)胞碎片，收集上清液保存在-20 ℃以進(jìn)行生物活性的測定。

1.3.6.1α-淀粉酶活性抑制活性的測定

參考Xiao Xiang等[39]的方法，取500 μLα-淀粉酶（5 U/mL）與100 μL樣品上清液混合，在37 ℃孵育10 min。加入500 μL 1 g/100 mL可溶性淀粉引發(fā)反應(yīng)， 37 ℃孵育10 min后加入500 μL二硝基水楊酸顯色劑終止反應(yīng)，沸水浴5 min并冷卻至室溫。將反應(yīng)物混合物用磷酸鹽緩沖液稀釋至5 mL并在540 nm波長測定其吸光度，3 次平行實驗。沒有樣品的反應(yīng)混合物用作對照，阿卡波糖用作陽性對照。計算公式如下：

1.3.6.2α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參考Xiao Xiang等[39]的方法，取100 μL樣品上清液與10 μLα-葡萄糖苷酶（5.7 U/mL）混合，在37 ℃孵育10 min。加入100 μL 6 mmol/L PNPG引發(fā)反應(yīng)，37 ℃孵育20 min后加入1 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。并在400 nm波長測定其吸光度，3 次平行實驗。沒有樣品的反應(yīng)混合物用作對照，阿卡波糖用作陽性對照。計算公式如下：

1.3.7 酵母菌微膠囊在不同溫度下的貯藏穩(wěn)定性

該方法基于Song Huiyi等[40]，并稍作修改。將冷凍干燥后的樣品于-20 、4 、25 ℃貯藏30 d。分別于第0、5、10、15、20、25、30天取出樣品，按1.3.3.1節(jié)方法進(jìn)行計數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行顯著性分析，所有實驗一式三份進(jìn)行，結(jié)果以表示。顯著性（P＜0.05）分析采用Duncan檢驗；采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生元對庫德畢赤酵母菌生物量的影響

益生元能夠在生產(chǎn)和貯藏過程中提高益生菌的生存能力[41]。為了測定庫德畢赤酵母對益生元的利用能力，使用益生元（菊糖、GOS、低聚異麥芽糖、FOS和乳果糖）和非益生元（葡萄糖）進(jìn)行了體外發(fā)酵實驗。如圖1所示，在培養(yǎng)48 h后菌株的生物量表現(xiàn)出不同程度的增加。與陰性對照相比，添加GOS、FOS和葡萄糖均能夠顯著促進(jìn)庫德畢赤酵母的生長（P＜0.05）。庫德畢赤酵母在FOS和GOS的作用下生長動力學(xué)曲線相似，發(fā)酵48 h后OD600nm的吸光度比0 h分別增加了28.86 倍和28.91 倍，顯著高于葡萄糖（P＜0.05）。圖1表示菊粉、低聚異麥芽糖和乳果糖不能促進(jìn)酵母菌的生長，說明庫德畢赤酵母對不同益生元表現(xiàn)出選擇性代謝，可能與菌株的代謝特性和菌株種類有關(guān)[42]。因此，選擇添加FOS和GOS進(jìn)行酵母菌微膠囊的制備。

圖 1 庫德畢赤酵母DS8-1在補充益生元的YPD肉湯中生長Fig. 1 Pichia kudriavzevii DS8-1 growth curves in YPD broth supplemented with prebiotics

2.2 酵母菌微膠囊包埋的活菌數(shù)及包埋率

如表1所示，4 種微膠囊的包埋率為（86.11±0.24）%～（89.27±0.71）%，包埋的活菌數(shù)為7.77～8.07（lg（CFU/g））。其中，SA微膠囊和SAM微膠囊的包埋率分別為（86.11±0.24）%和（86.24±0.59）%，說明使用羊乳包衣對微膠囊的包埋率影響較小，可能在包衣的過程中使用溫和的條件降低了細(xì)胞活力的損失。在添加FOS和GOS后，酵母菌微膠囊包埋的活菌數(shù)達(dá)到了8（lg（CFU/g））以上，顯著高于其他微膠囊（P＜0.05）。該結(jié)果與Liao Ning等[43]添加寡糖的微膠囊結(jié)果相似，可能是由于添加了FOS和GOS增加了微膠囊的黏度以及藻酸鹽網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而減少了細(xì)胞的損失。

表 1 微膠囊中包埋的活菌數(shù)Table 1 Numbers of viable yeast cells in suspensions and microcapsules lg（CFU/g）

2.3 酵母菌微膠囊SEM

SEM分析可以很好的了解微膠囊的均勻性和微觀結(jié)構(gòu)。如圖2所示，4 種微膠囊的直徑相似，平均大小為1.0～1.5 mm，說明添加益生元和使用羊乳包衣對微膠囊的尺寸影響較小。實驗制備的酵母菌微膠囊的大小在5 μm～4 mm的可接受范圍內(nèi)，可添加至食品中使用[44]。

如圖2所示，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)藻酸鹽（低于5%）經(jīng)過制備產(chǎn)生球形微膠囊，在冷凍干燥后收縮，由于其在膠囊表面產(chǎn)生低濃度的羧基，在干燥過程中會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的部分坍塌[45]。4 種酵母菌微膠囊在冷凍干燥后均具有不規(guī)則的形狀，包括一些凸起和溝壑，內(nèi)部結(jié)構(gòu)粗糙且?guī)в旭薨櫤涂斩碵46]。SA微膠囊表面較為粗糙，存在明顯的裂縫（圖2A3），而使用羊乳包衣的微膠囊表面較為連續(xù)和均勻（圖2B3、C3、D3），說明藻酸鹽、羊乳和FOS/GOS具有一定的相容性。羊乳包衣覆蓋了殘留在微膠囊表面的菌株，因此當(dāng)暴露于不利環(huán)境時包衣可以提高酵母菌的生存能力[11,47]。

圖 2 4 種不同微膠囊的SEM圖Fig. 2 SEM images of four different microcapsules

2.4 酵母菌微膠囊FTIR結(jié)果分析

FTIR用于鑒定官能團(tuán)并表征膠囊中各種成分之間的關(guān) 系[48]。如圖3所示，由于—OH伸縮振動的存在，藻酸鹽的FTIR光譜包括在3 419 cm-1處有顯著吸收帶，在1 033 cm-1處存在C—O—C伸縮振動，以及在1 612 cm-1和1 427 cm-1處為COO—的不對稱和對稱伸縮振動，這與之前研究結(jié)果相似[49]。羊乳中主要包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)以及這些成分的混合物，其中在1 654 cm-1和1 544 cm-1左右的吸收峰分別為酰胺I帶（C＝O伸縮振動）和酰胺II帶（—NH彎曲振動）與乳蛋白有關(guān)，乳糖和乳脂中由于—OH和甘油三酯的酯基—C＝O的存在，分別在1 074 cm-1和1 745 cm-1處有顯著吸收帶，在形成SAM微膠囊后，SA微膠囊中對應(yīng)的COO—的不對稱伸縮振動移至較高波數(shù)，而羊乳中酰胺I帶和—OH的吸收峰峰移至較低波數(shù)，表明藻酸鹽的羧基可能通過分子間氫鍵與羊乳中蛋白質(zhì)的酰胺I帶和乳糖的羥基相互作用，這與之前的研究結(jié)果相似[50-51]。

圖 3 4 種不同微膠囊的FTIR譜圖Fig. 3 FTIR spectra of four different microcapsules

FOS和GOS的FTIR光譜在1 200～900、3 000～2 700 cm-1和900～600 cm-1區(qū)域有顯著吸收帶，在1 200～900 cm-1之間為C—C和C—O的伸縮振動以及C—O—H和C—O—C彎曲振動吸收峰[52]。在形成SAMF和SAMG微膠囊后，F(xiàn)OS和GOS在1 200～900 cm-1之間的吸收峰逐漸減少，移位或丟失。FOS和GOS是多羥基化合物，在1 641 cm-1和1 419 cm-1處COO—的不對稱和對稱伸縮振動分別向較低波數(shù)移動，表明在制備微膠囊的過程中FOS-藻酸鹽-羊乳和GOS-藻酸鹽-羊乳之間可能通過氫鍵相互作用而形成聚合物鏈[53]。由于酵母細(xì)胞壁的甲殼質(zhì)中酰胺基R—NH—C—O—CH3的存在，在1 647 cm-1和1 548 cm-1處有顯著吸收帶。4 種酵母菌微膠囊的FTIR光譜在1 548 cm-1左右存在—NH彎曲振動吸收峰，這表示微膠囊中存在酵母細(xì)胞壁的酰胺基[54]。以上均可說明SA、SAM、SAMF和SAMG對酵母菌進(jìn)行了有效的包埋。

2.5 酵母菌微膠囊在冷凍干燥后的存活能力

研究表明，在冷凍干燥過程中菌株的生理狀態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致活力降低[55]。如表1所示，使用羊乳包衣后的酵母菌均具有較高的存活能力，存活率均高于（92.15±0.90）%，顯著高于未包衣酵母菌（存活率為（84.76±1.03）%）（P＜0.05）。其中，SAMG微膠囊和SAMF微膠囊的菌株存活率分別為（95.16±0.82）%和（94.30±0.37）%，顯著高于SAM微膠囊（92.15±0.90）%（P＜0.05）。表明在微膠囊中添加FOS和GOS以及使用羊乳包衣能夠提高冷凍干燥過程中微生物的活力?？赡苁翘妓衔铮‵OS/GOS）內(nèi)含多個羥基，在凍干的過程中可替代部分水分子通過氫鍵與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或菌體蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)結(jié)合，降低了對細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性的破壞[56]，而FOS和GOS表現(xiàn)出不同的保護(hù)能力可能與它們與水結(jié)合的能力以及防止細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成的能力有關(guān)[57]。

2.6 SGF對庫德畢赤酵母菌的影響

在胃液中較低的pH值環(huán)境下，胃蛋白酶可以分解微生物細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)而降低益生菌的生存能力[58]。如圖4所示，游離酵母菌的活力在孵育3 h后降低了45.69%，而SA和SAM微膠囊的活細(xì)胞數(shù)量分別降低了15.2%和11.88%，說明游離的酵母菌對低pH值環(huán)境較為敏感，而羊乳蛋白較高緩的沖能力以及膠囊表面低孔隙率能夠減少外界環(huán)境對細(xì)胞的影響[13]。SAMF和SAMG微膠囊中的酵母菌在低pH環(huán)境下得到更好的保護(hù)作用，在孵育3 h后活細(xì)胞數(shù)分別降低了5.2%和10.48%，具有良好的耐胃酸效果。因此，添加FOS和GOS可以在酸性條件下增強(qiáng)微膠囊對庫德畢赤酵母菌的保護(hù)作用，這可能是由于低聚糖FOS/GOS填充了藻酸鹽微膠囊凝膠網(wǎng)絡(luò)間隙，減小凝膠的孔徑，增加了微膠囊的密度，導(dǎo)致胃液在膠囊內(nèi)的滲透受到了限制，從而有效的降低了高酸度對酵母菌活力的影響[20]。

圖 4 酵母菌微膠囊在SGF中菌株活力的變化Fig. 4 Changes in microencapsulated yeast viability in simulated gastric juice

2.7 酵母菌微膠囊在模擬胃腸液中連續(xù)培養(yǎng)后的活力與釋放

如圖5所示，在SGF中培養(yǎng)120 min后，4 種微膠囊中酵母菌擴(kuò)散釋放少于3（lg（CFU/g）），隨后轉(zhuǎn)移至SIF 30 min后，酵母菌的活力達(dá)到5（lg（CFU/g））以上。說明微膠囊壁材在酸性環(huán)境中較為穩(wěn)定，而轉(zhuǎn)移至弱堿環(huán)境時能夠被解崩后導(dǎo)致菌株的釋放，這是由于在pH值為8.0的SIF中，藻酸鹽微膠囊中Ca2+與膽鹽中的Na+之間發(fā)生離子交換，在較高pH值下會增加藻酸鹽中羧基的離子化，且羧基之間的靜電排斥作用會導(dǎo)致微膠囊解崩并加快細(xì)胞的釋放速度[59]。如圖6所示，在轉(zhuǎn)移至腸液30 min后胰蛋白酶和膽鹽能夠不同程度的破壞4 種微膠囊的結(jié)構(gòu)，SA微膠囊的結(jié)構(gòu)嚴(yán)重坍塌，而其余3 種微膠囊的表面覆蓋了羊乳包衣，由于羊乳對藻酸鹽的改性使微膠囊的表面均勻致密，改性的壁材表面可以一定程度上減少膽鹽對微膠囊的擴(kuò)散，降低微膠囊解崩的速度，增加酵母菌的活力[15]。此外，庫德畢赤酵母可以在轉(zhuǎn)移至SIF 60 min內(nèi)從微膠囊中完全釋放出來，這與Wang Lijun等[13]的研究結(jié)果類似。4 種微膠囊中的菌株在模擬胃腸道的過程中均具有快速釋放的特性，說明在攝入體內(nèi)過程中菌株可能持續(xù)存在?？梢钥闯觯砑覨OS和GOS共包埋的酵母菌微膠囊的活力均高于SAM微膠囊。其中，SAMF在4 h后的活力最高（活菌數(shù)為8.14（lg（CFU/g））），說明SAMF微膠囊在模擬消化道體系中對庫德畢赤酵母菌酵母具有最佳保護(hù)作用。

圖 5 酵母菌微膠囊在模擬胃腸液中的釋放Fig. 5 Release of yeast microcapsules in simulated gastrointestinal fluid

圖 6 從SGF轉(zhuǎn)移至SIF 30 min時4 種酵母菌微膠囊的SEM圖Fig. 6 SEM images of four yeast microcapsules pretreated with simulated gastric fluid after 30 min exposure to simulated intestinal fluid

2.8 酵母菌微膠囊在模擬消化培養(yǎng)后對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制實驗是評估生物活性物質(zhì)在體外降血糖活性的有效手段[60]。通常對這2 種酶的抑制活性可歸因為生物活性肽（蛋白水解酶產(chǎn)生的小肽）和胞外多糖的生物活性（由微生物產(chǎn)生）[61]。如表2所示，與未經(jīng)過SGID相比，游離酵母菌經(jīng)過SGID后對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性顯著降低，抑制率分別降低了11.11%和17.09%（P＜0.05）。這可能是由于胃腸道條件惡劣，導(dǎo)致細(xì)胞死亡并降低了菌株在宿主體內(nèi)產(chǎn)生代謝物質(zhì)的能力[62]。而包埋酵母菌經(jīng)過SGID處理后對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性分別為17.42%～22.51%和31.30%～40.13%，表明包埋對酵母菌在模擬胃腸道環(huán)境中具有保護(hù)作用，因此與游離酵母菌經(jīng)過SGID后相比，對這2 種酶的抑制活性保持在較高的水平（P＜0.05）。與SA微膠囊相比，SAM、SAMF和SAMG微膠囊中酵母菌對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性顯著升高（P＜0.05），低于陽性對照阿卡波糖（75.63%和98.24%）這可能是由于在模擬消化培養(yǎng)的過程中，不同的蛋白酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）水解微膠囊表面的羊乳蛋白產(chǎn)生較短鏈長的生物活性肽，肽抑制酶可能的作用機(jī)制是它們能夠通過酶活性位點上的疏水鍵相互作用[63]。Ahmad等[64]使用駱駝乳清蛋白和牛乳清蛋白包埋乳酸片球菌能夠提高菌株對α-葡萄糖苷酶抑制活性，與本實驗結(jié)果一致。并且益生元（FOS和GOS）和羊乳包衣中的乳糖可作為底物為酵母菌的生長和生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生提供碳源，羊乳蛋白在消化液中被消化，釋放出有利于酵母菌生長的肽和氨基酸[64]。因此，對微膠囊使用羊乳包衣和添加FOS/GOS能夠在模擬胃腸道中為酵母菌的活性以及菌株對代謝物的分解提供保護(hù)作用。

表 2 包埋對庫德畢赤酵母菌生物活性的影響Table 2 Effect of microencapsulation on digestive enzyme inhibitory activity of P. kudriavzevii

2.9 酵母菌微膠囊的貯藏穩(wěn)定性分析

冷凍干燥是保存益生菌產(chǎn)品為干燥粉末中的常用方法之一，其易于處理，貯藏和運輸。但是，在貯藏過程中會有水蒸氣、空氣和有機(jī)小分子物質(zhì)滲透進(jìn)入這些產(chǎn)品中，從而影響細(xì)胞活力。如圖7所示，包埋和游離酵母菌在3 種不同的溫度（-20、4 ℃和25 ℃）的細(xì)胞活力隨著貯藏時間的升高而呈現(xiàn)出不同程度的下降。在貯藏30 d后，游離酵母菌在-20、4 ℃和25 ℃的活菌數(shù)迅速減少，分別降低了2.86、2.92（lg（CFU/g））和3.64（lg（CFU/g）），而SA微膠囊中酵母菌分別降低了0.90、1.99（lg（CFU/g））和2.53（lg（CFU/g））。說明在酵母菌周圍形成藻酸鹽多糖對菌株提供了保護(hù)作用，因此不利的外界環(huán)境因素（例如氧氣）需要穿過藻酸鹽層才能影響菌株的活性。并且貯存溫度能夠影響酵母菌的穩(wěn)定性，低溫可以降低脂肪氧化等反應(yīng)的速率，減少自由基的形成，而有利于維持細(xì)胞的活力[65]。因為當(dāng)自由基擴(kuò)散到細(xì)胞中時，可能會誘導(dǎo)細(xì)胞DNA受損，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[66]。在-20 ℃貯藏30 d后，SA微膠囊中菌株活力為6.11（lg（CFU/g）），顯著低于其他酵母菌微膠囊（P＜0.05）。說明羊乳包衣在微膠囊的最外層，由于乳蛋白與藻酸鹽相互作用致使微膠囊的外表面連續(xù)且均勻，可能減少凍干微膠囊的水分活度的增加，有助于維持酵母菌的活性[11]。而水分活度可能會影響微生物的生存能力，因為高水分活度時菌株保持代謝活性，低水分活度時菌株保持休眠狀態(tài)[67]。這與Hugues-Ayala等[11]使用酪乳蛋白包衣的鼠李糖乳桿菌微膠囊貯藏的結(jié)果相似?？梢钥闯?，SAMG微膠囊和SAMG微膠囊在-20、4 ℃和25 ℃貯藏30 d后酵母菌的活力緩慢降低，菌株活力均在6（lg（CFU/g））以上，顯著高于其他包埋酵母菌（P＜0.05）。說明4 種酵母菌微膠囊的細(xì)胞活性之間的差異可能也與壁材的氧氣滲透性有關(guān)，觀察到SA微膠囊表面存在裂縫（圖2A3），這可能有助于氧氣通過膠囊擴(kuò)散，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而SAMF微膠囊和SAMG微膠囊中FOS和GOS與藻酸鹽之間的相互作用可以增加微膠囊的密度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使用羊乳外包衣微膠囊獲得了較為致密和連續(xù)的表面形態(tài)，在貯藏的過程中為酵母菌提供了保護(hù)性屏障，降低氧氣向酵母菌細(xì)胞膜的擴(kuò)散。因此，在包埋過程中添加GOS和FOS在3 種不同溫度的貯藏期內(nèi)均能良好的維持酵母菌的穩(wěn)定性。

圖 7 酵母菌微膠囊的在－20（A）、4 ℃（B）和25 ℃（C）條件下的貯藏穩(wěn)定性Fig. 7 Storage stability of yeast microcapsules at ?20 (A),4 (B) and 25 ℃ (C)

3 結(jié) 論

本實驗以庫德畢赤酵母DS8-1為研究對象，成功制備了具有潛在益生作用的羊乳-FOS/GOS-藻酸鹽微膠囊，利用FTIR和SEM表征手段證明微膠囊的形成。當(dāng)暴露于不利環(huán)境時，使用羊乳包衣和添加FOS/GOS可提高庫德畢赤酵母的活力。微膠囊在SGF中較為穩(wěn)定，在SIF中可以緩慢釋放活細(xì)胞，且SAMF微膠囊比SAMG微膠囊的菌株具有更好的生存能力。而SAMG微膠囊比SAMF微膠囊對菌株提供了更好的貯藏穩(wěn)定性。在SGID后微膠囊化可增強(qiáng)酵母菌對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用。羊乳-FOS/GOS-藻酸鹽微膠囊可以作為庫德畢赤酵母的保護(hù)和遞送載體，以期發(fā)揮其潛在的益生作用。