魯振杰，李 娟，陳正行，李 誠，李亞男

（江南大學食品學院，糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122）

麥麩是小麥精細面粉加工的副產物，其含有豐富的碳水化合物、蛋白質、礦物質和維生素等營養(yǎng)素，具有重要的利用價值，我國麥麩年產量可達3 000萬 t以上[1-2]。目前，麥麩主要被用作飼料，而關于麥麩的高產值利用則成為谷物精深加工領域的研究熱點。

麥麩中含有約46%的非淀粉多糖，其中約70%是阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）[3-4]。AX是存在于包括小麥在內的谷物細胞壁中的半纖維素，它們是以β-(1,4)-糖苷鍵連接D-吡喃木糖（xylose，Xyl）殘基為主鏈，α-L-阿拉伯呋喃糖（arabinose，Ara）殘基為側鏈所形成的聚合物[5-6]。研究表明，從谷物中提取的AX具有良好的生理功能特性，如促進排便、降低血糖水平和抑制膽固醇升高等[7-9]。此外，谷物AX還是一種性質優(yōu)良的功能性聚合物，被認為是制備用于藥物遞送載體、組織工程和食品包裝的水凝膠、納米顆粒和可食用膜的合適材料[10-11]。然而，天然提取的AX由于溶解度低、功能基團含量少，從而限制了其作為功能聚合物的實際應用[12]。因此，為了更好的利用AX作為新型功能性材料，可對其進行化學修飾，以增加其功能基團。羧甲基化是最常用的修飾手段之一，它可增加材料中的羧基基團，提高其溶解性，改善材料的成膜、凝膠、乳化、持水和吸附等有價值的功能[13]。

目前，羧甲基化改性在淀粉、纖維素等聚合物中已有較多的報道，其改性過程通常是在堿性介質中，聚合物中的羥基和氯乙酸發(fā)生雙分子親核取代反應，產物以鈉鹽的形式存在[13]。通過類似的反應機理，Petzold等[13]研究了不同工藝和不同漿料介質對樺木木聚糖羧甲基化的影響，結果表明將木聚糖先溶解在NaOH溶液中，再加入漿料介質的一步反應可獲得取代度（degree of substitution，DS）最高為1.22的羧甲基化木聚糖。Peng Xinwen等[14]利用微波誘導增強化學反應的方式在較短的反應時間內獲得了最高DS為1.02的羧甲基化小麥秸稈半纖維素，但其分子質量減小較大。Konduri等[15]制備了最高DS為0.21的羧甲基化山毛櫸木聚糖，并表明其作為分散劑對黏土懸浮液具有良好的分散性能。Bhatia等[16]獲得了DS為0.74的車前草羧甲基化阿拉伯木聚糖（carboxymethylated arabinoxylan，CMAX），并表明CMAX和殼聚糖的復合納米顆粒作為遞送載體對布洛芬具有良好控釋效果。Alekhina等[17]研究了堿法提取的樺木木聚糖的羧甲基化修飾，并探究了DS為0.36、0.58和1.13樣品的成膜性能，結果表明這些膜具有適當的阻隔性能，可用于水果和蔬菜的包裝或涂層。然而，有關麥麩AX的羧甲基化改性還鮮有報道，因此有必要對麥麩AX的羧甲基化改性進行探究。

本研究以堿提取法制備麥麩AX，并對其進行羧甲基化改性，通過單因素試驗探究了不同反應條件對麥麩CMAX取代度的影響，并考察不同取代度CMAX的理化性質差異，為麥麩AX的羧甲基化改性提供了基礎理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥麩皮 中糧集團有限公司；A7595高溫淀粉酶（酶活≥250 U/g，最適催化溫度約為90 ℃）和P4860堿性蛋白酶（酶活≥2.4 U/g，最適催化溫度約為60 ℃）美國Sigma公司；葡萄糖（glucose，Glu）、木聚糖、阿拉伯糖、葡聚糖標準品 中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、氯乙酸鈉（sodium chloroacetate，SMCA）、碳酸鈣、硫酸銅、硫酸鉀、硝酸鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

超級恒溫循環(huán)酶解罐 上海一恒科學儀器有限公司；磁力攪拌器 德國IKA儀器有限公司；Beta2-8 LD plus冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；Avanti J26XP高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；1200高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；1525高效液相色譜儀（配2410示差折光檢測器和Empower工作站）、DHR-3流變儀 美國Waters公司；IS10傅里葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司；TGA-2熱分析系統 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AX的提取

麥麩前處理：取粉碎后過80 目篩的麥麩，以料液比1∶10（g/mL）與去離子水混合，在酶解罐中93 ℃條件下，按每100 g麥麩加入0.6 mL高溫淀粉酶，攪拌反應3 h，然后降溫至63 ℃，按每100 g麥麩加入0.8 mL堿性蛋白酶，攪拌反應3 h，酶解過程結束后升溫至100 ℃，保溫10 min使酶滅活，最后酶解液以4 000 r/min離心10 min，用去離子水將所得沉淀洗滌3 次，凍干得脫淀粉、蛋白的麥麩[18]。

AX的堿提?。喝∩鲜鎏幚砗篼滬?，以料液比1∶20（g/mL）與濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液混合，于85 ℃酶解罐中攪拌條件120 min。反應結束后，待冷卻至室溫以4 000 r/min離心10 min，沉淀用少量去離子水洗滌3 次，收集所有上清液，以6 mol/L的鹽酸溶液將上清液pH值調至4.3，再以13 000 r/min離心15 min，取上清液加入3 倍體積的無水乙醇以沉淀AX，并于4 ℃靜置過夜。醇沉后倒去上清液，以75%乙醇溶液洗滌沉淀3 次，所得沉淀揮發(fā)除去乙醇，冷凍干燥得AX樣品[8]。根據前期研究結果，本實驗由前處理麥麩提取AX的得率為（32.80±1.30）%，AX含量為（88.72±0.17）%[19]。

1.3.2 CMAX的制備

取1 g（7.5 mmol，以糖單元摩爾質量為132 g/mol計算）AX懸浮在72 mL的無水乙醇中，磁力攪拌5 min（800 r/min），加入100 mg/mL的NaOH溶液6.0 mL后，室溫下強烈攪拌1 h（1 000 r/min）。再加入1.76 g的SMCA（15 mmol），使AX-SMCA-NaOH的物質的量比為1∶2∶2，繼續(xù)攪拌5 min。置于65 ℃的磁力攪拌水浴中，在攪拌條件下（600 r/min）醚化反應4 h。反應結束后，產物以2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，將沉淀懸浮在80%體積分數的甲醇溶液中，用稀醋酸溶液調至中性，然后以1 600 r/min離心5 min，并用無水乙醇洗滌沉淀5 次，將沉淀凍干得CMAX樣品[20]。

1.3.3 CMAX制備的單因素試驗

本實驗分別以NaOH質量分數、AX-SMCA物質的量比、AX-NaOH物質的量比、反應溫度和反應時間為因素自變量，通過單因素試驗考察不同條件對CMAX取代度的影響。

1.3.4 取代度測定

CMAX純化[12]：將0.5 g CMAX溶于10 mL水中，再加入10 mL 1 mol/L鹽酸溶液，攪拌至完全溶解，加入5 滴酚酞指示劑，再滴加1 mol/L氫氧化鈉溶液，攪拌至溶液的紅色消失。用攪拌法將50 mL 95%乙醇溶液慢慢加入混合物中，再加入100 mL 95%乙醇溶液，靜置15 min后離心（2 000 r/min，5 min），用80%乙醇溶液洗滌4 次，再用50 mL 95%乙醇溶液洗滌，將沉淀凍干備用。

DS測定[14]：將0.05 g上述樣品溶于50 mL蒸餾水中，并攪拌至完全溶解，酸堿調節(jié)溶液pH值至8.0，然后用0.05 mol/L H2SO4溶液滴定至pH值為3.74。DS值根據以下方程計算：

式中：a為產品的純度；m和m’分別為純化前后樣品的質量；0.132為AX糖單元的毫摩爾質量（g/mmol）；0.08為每個被取代糖單元毫摩爾質量的凈增加（g/mmol）；M和V分別為滴定所用硫酸的濃度和體積；B為每克樣品所消耗H+的物質的量。該方法假設未經處理的半纖維素不含任何羧基，所有滴定一式三份，標準偏差小于4.0%。

1.3.5 紅外光譜分析

將干燥的樣品和溴化鉀以質量比1∶100進行混合，在紅外燈下于瑪瑙研缽中磨細，用壓片機在30 MPa的壓力下壓制5 min，通過傅里葉紅外光譜儀將所得樣品壓片進行紅外光譜掃描，掃描次數為32 次，分辨率為4 cm-1，掃描波數范圍為4 000～500 cm-1。

1.3.6 單糖組成測定

采用高效液相色譜法[21-22]測定AX和CMAX的單糖組成。樣品制備：稱取10 mg樣品于15 mL樣品瓶中，加入0.3 mL 13.2 mol/L H2SO4溶液，在30 ℃水浴中水解1 h，期間攪拌數次。加入8.4 mL去離子水，在121 ℃高溫鍋中水解1 h，取出冷卻至室溫。取上述冷卻液3 mL于10 mL離心管中，再稱取130 mg碳酸鈣分數次加入，以中和酸，離心（4 000 r/min，10 min）取上清液，經0.22 μm濾膜過濾后進行測定。標準曲線：配制Glu、Xyl、Ara質量濃度分別為1.5、1、0.5 mg/mL的標準溶液，以0.5、5、10、15、20 μL的梯度進樣，繪出3 種單糖的標準曲線。色譜條件：1200高效液相色譜儀，Hi-Plex H（300 mm×7.7 mm）柱，柱溫55 ℃，示差折光檢測器，檢測溫度30 ℃，流動相為超純水，流速0.6 mL/min，分析時間20 min。

1.3.7 分子質量測定

采用高效凝膠過濾色譜法[23]測定AX和CMAX的分子質量。樣品制備：用流動相溶解待測樣品，配制成質量濃度為10 mg/mL的溶液，離心（4 000 r/min，10 min）取上清液，經0.22 μm濾膜過濾后，進行測定。標準曲線：取已知相對分子質量的葡聚糖標準品（Glu180、MW2700、MW9750、MW135030、MW300600、MW2000000），經與上述相同處理后，測定并繪制標準曲線。色譜條件：Waters 1525高效液相色譜儀（配2410示差折光檢測器和Empower工作站），UltrahydrogelTMLinear色譜柱（300 mm×7.8 mm），柱溫、檢測器溫度均為35 ℃，流動相為0.10 mol/L硝酸鈉溶液，流速為0.8 mL/min。

1.3.8 黏度分析

采取AX和CMAX樣品制成質量濃度為20 mg/mL的溶液，在25 ℃條件下測定樣品的剪切黏度，流變儀模具為40 mm平板，測定間隙為800 μm，在剪切速率1～1 000 s-1范圍內進行剪切黏度的測定[24]。

1.3.9 熱重分析

通過熱重分析儀測定AX和CMAX的熱穩(wěn)定性。在進行熱分析之前，將樣品在80 ℃的真空烘箱中干燥24 h，準確稱取3～5 mg的樣品，在30 mL/min的氮氣流速下，以10 ℃/min的升溫速率測定25～650 ℃范圍內的熱力學性質[25]。

1.4 數據處理

采用Origin軟件進行數據作圖處理，采用SPSS軟件對數據進行ANOVA方差分析、Duncan多重比較，顯著性差異選用P＜0.05。每組實驗重復3 次，結果采用表示。

2 結果與分析

2.1 不同反應條件對CMAX取代度的影響

麥麩AX的羧甲基化采用了纖維素、淀粉等多糖羧甲基化的常用方法[16]。羧甲基化反應在乙醇為反應介質的非均質體系中進行，乙醇為反應介質具有價格低廉、無毒的優(yōu)勢[12]。通過改變反應參數對羧甲基化反應的參數進行優(yōu)化，以DS為指標，以NaOH質量濃度、物質的量比（AX∶SMCA、AX∶NaOH）、反應溫度和反應時間為因素變量進行單因素試驗，結果如表1所示。

表 1 不同反應條件下CMAX的取代度Table 1 DS of CMAX under different reaction conditions

隨NaOH質量濃度的增加，DS呈現出先增加后減小的趨勢。當NaOH質量濃度由50 mg/mL增加到100 mg/mL時，所得CMAX的取代度由0.50增加至0.66。隨后NaOH質量濃度的增加導致DS的顯著降低，當NaOH質量濃度為200 mg/mL時，CMAX的DS僅為0.16。DS隨NaOH質量濃度的增加而升高是由于NaOH質量濃度的增加，減少了反應體系中的水分，從而增加了AX和反應試劑的濃度，提高了分子碰撞的機會，有利于反應的進行[26]。當NaOH質量濃度繼續(xù)增加時，反應體系中的水分含量降低，不利于醚化試劑和AX分子的擴散，也影響了AX分子的活化，阻礙了反應的進行[12]。

DS隨SMCA含量的增加而呈現出先增大后減小的趨勢，當AX∶SMCA的物質的量比由1∶1增加到1∶2時，DS由0.36增加到0.66，而隨SMCA含量的繼續(xù)增加，DS值逐漸減小，DS在AX-SMCA為1∶4時減小至0.54?？赡苁怯捎赟MCA含量的增加使其與AX分子的接觸增加，有利于反應的進行。反之，當SMCA含量過高時，有利于SMCA和NaOH生成乙醇酸鈉的副反應發(fā)生，從而導致DS值的降低[27]。

NaOH含量的增加對DS具有較顯著的影響，當AX-NaOH物質的量比由1∶1增加至1∶2時，DS由0.17增加至0.66。此后，DS隨NaOH含量的增加降低至0.45。由于NaOH含量的增加有利于AX的活化，使AX的分子鏈充分展開，提高了AX分子的親核反應活性[14]，從而獲得了較高的DS。當NaOH含量繼續(xù)增加時，過量的NaOH和SMCA發(fā)生副反應，產生乙醇酸鈉，影響羧甲基化反應的進行[28]。

反應溫度的升高有利于羧甲基化反應的進行，當溫度由45 ℃升高至65 ℃時，DS由0.44增加到0.66，此后，DS值隨溫度的升高而趨于穩(wěn)定。由于反應溫度的升高有利于AX的活化、反應組分的擴散和流動性，所以DS值隨溫度的升高而增加。然而，當溫度超過65 ℃時，AX在堿性反應介質中易發(fā)生分解，且副反應的反應程度也隨之增加，使DS趨于穩(wěn)定[29]。

DS隨反應時間的延長呈現出先增加后趨于平衡的趨勢，當反應時間由2 h增加至4 h時，DS由0.46增加至0.66，此后，DS不再隨反應時間的延長而增加。延長反應時間有利于反應組分的擴散，使醚化試劑和AX分子之間接觸的更充分，從而有利于反應的進行。反之，過長的反應時間也加劇了AX分子的降解和副反應的發(fā)生，所以DS不再隨反應時間的延長而增加[12]。

綜上所述，麥麩AX的羧甲基化取代度隨NaOH質量濃度及SMCA和NaOH物質的量比的增加均呈現出先增加后減小的趨勢，隨反應溫度和反應時間的增加呈現出先增加后趨于平衡的趨勢。當NaOH質量濃度100 mg/mL、物質的量比（AX-SMCA-NaOH=1∶2∶2）、反應溫度65 ℃、反應時間4 h時可認為是較優(yōu)的參數組合，在此條件下獲得DS為0.66的CMAX樣品。

2.2 紅外光譜分析

圖 1 AX和CMAX（DS 0.66）紅外圖譜Fig. 1 Infrared spectra of AX and CMAX (with DS of 0.66)

如圖1所示，在3 432、2 920、1 650、1 448、1 243、1 045、897 cm-1處具有明顯的吸收峰[30]。897 cm-1處出現的吸收峰，是由于糖基之間的β-糖苷鍵所致，表明構成麥麩AX骨架的木糖殘基由β-糖苷鍵連接[31]。在1 045 cm-1處的強吸收峰由C—O—C和C—O拉伸振動產生，1 045～1 448 cm-1之間的峰與C—H和C—O鍵伸縮頻率有關；1 650 cm-1處的一個強吸收峰與樣品中的水分有關；2 920 cm-1處的峰由亞甲基的C—H彎曲和C—H拉伸振動引起，3 432 cm-1附近的峰由氫鍵羥基振動產生[32]。由CMAX圖譜可知，圖譜中出現了1 602、1 423、1 329 cm-1三個新典型峰。1 602 cm-1處的強吸收峰表明COO-基團的存在，1 423 cm-1和1 329 cm-1處的吸收峰分別由—CH2剪式彎曲振動和—OH的彎曲振動產生[33]。綜上可知，CMAX圖譜中新吸收峰出現證明了羧甲基化的發(fā)生。

2.3 不同取代度CMAX的單糖組成分析

表 2 AX和不同取代度CMAX單糖組成Table 2 Monosaccharide compositions of AX and CMAX with different degrees of substitution %

由于麥麩AX樣品中阿拉伯半乳糖、鼠李糖等單糖含量較少[19]，因此本實驗主要對Glu、Xyl、Ara 3 種主要單糖進行測定。由表2可知，AX樣品的各種單糖含量均為最高，且具有較高的Ara/Xyl值，表明其具有較高的支鏈程度[34]。隨改性樣品DS的增加，Glu、Xyl和Ara的含量均隨之減少，由于該單糖測定方法僅針對這3 種單糖進行檢測，而不能檢測其衍生物的含量，因此單糖含量的減少可能是生成了其衍生物。此外，Ara/Xyl值隨DS的增加而減小，說明麥麩AX在羧甲基化過程中支鏈Ara上的接枝反應比主鏈Xyl更易發(fā)生，所以高支鏈度AX的羧甲基化反應會優(yōu)先發(fā)生在支鏈糖單元上，可能是由于側鏈Ara的存在使主鏈Xyl的親核反應位阻增大，所以支鏈單元上的反應更易發(fā)生[15]。當DS為0.66時，Xyl的含量仍有11.79%，可能是由于AX中部分主鏈Xyl的O2和O3位—OH均被Ara所取代，導致這部分Xyl難以發(fā)生反應，這一推測和Beaugrand等[35]所揭示麥麩AX具有較高的支鏈度相符合。

2.4 不同取代度CMAX的分子質量分布分析

表 3 AX和不同取代度CMAX分子質量分布Table 3 Molecular mass distribution of AX and CMAX with different degrees of substitution

通過測定不同取代度CMAX的分子質量，探究麥麩AX在羧甲基化反應中分子質量的降解情況。如表3所示，聚合物分散系數表示聚合物分子質量的分布寬度，其值越大，分子質量分布越寬，表明分子鏈分布的不均勻程度越高[36]。本實驗所測定的分子質量均有2 個峰，峰1為大分子質量分子的出峰，峰2為小分子質量分子的出峰，所有樣品的峰1面積比例均在86%以上，表明所測樣品的分子質量分布具有較好的均一性。隨改性樣品DS的增加，CMAX的數均分子質量和重均分子質量均隨之減小，可能是由于在堿性活化和醚化反應過程中樣品分子發(fā)生了降解[12]。此外，所有CMAX樣品峰1的聚合物分散系數值均高于AX樣品，而峰2的聚合物分散系數值均低于AX樣品，表明經改性后樣品分子質量大的分布變寬，而分子質量小的分布變窄。同時，所有CMAX樣品的大分子質量峰面積均大于AX樣品，表明改性反應對小分子質量分子的降解程度較大。綜上可知，在改性過程中樣品分子會發(fā)生一定的降解，導致改性后樣品的分子質量有所減小。

2.5 不同取代度CMAX的黏度分析

通過AX和CMAX溶液的剪切黏度測定，分析羧甲基化對麥麩AX溶液流變性質的影響。如圖2所示，AX樣品隨剪切速率的增加具有輕微程度的剪切變稀，而DS為0.36的CMAX樣品，其剪切黏度在剪切速率由1 s-1增加到7 s-1時迅速減小，呈現出顯著的剪切變稀現象，此后隨剪切速率的增加其剪切黏度趨于平衡；當DS為0.66時，也具有與DS 0.36樣品類似的趨勢。改性樣品溶液的黏度性質變化可能是由于改性樣品中的羥基被羧甲基所取代，導致樣品溶液的氫鍵結合減少，在低剪切速率時網絡結構便被破壞，因此呈現出顯著的剪切變稀現象[37]。此外，CMAX溶液的剪切黏度隨取代度的增加而減小，與AX樣品相比，當DS為0.36時，CMAX樣品的剪切黏度顯著減?。欢鳧S由0.36增加至0.66時，其剪切黏度的變化較小。與AX相比，羧甲基化改性降低了樣品的分子質量，且CMAX樣品中羥基的減少和羧基的增加使樣品溶液分子鏈的纏結減少，降低了分子間的相互作用，從而導致CMAX溶液的黏度較低[14]。

圖 2 AX和不同取代度CMAX溶液的剪切黏度Fig. 2 Shear viscosities of AX and CMAX

2.6 不同取代度CMAX的熱重分析

圖 3 AX和不同取代度CMAX的熱重質量損失（a）和質量損失速率（b）曲線Fig. 3 Thermogravimetric mass loss (a) and mass loss rate (b)curves of AX and CMAX

通過熱重分析法對AX和CMAX的熱穩(wěn)定性進行分析，結果表明在25～650 ℃的范圍內，樣品的熱穩(wěn)定曲線呈現出失水和熱分解2 個步驟。由圖3a可知，在250 ℃之前3 個樣品均表現出輕微的質量損失，是由于樣品中水分的損失產生的。此后，所有樣品均發(fā)生急劇的質量損失，此階段是由于樣品分子間和分子內的氫鍵斷裂以及分子側鏈的斷裂所致[17]。在質量損失為50%時，AX、DS 0.36和DS 0.66樣品所對應溫度分別為296、364、393 ℃，表明隨DS的增加，CMAX的熱穩(wěn)定性隨之增加。由圖3b可知，AX、DS 0.36和DS 0.66樣品在最大熱分解速率時所對應的熱分解溫度分別為285、300、306 ℃，也說明了改性后樣品具有較高的熱穩(wěn)定性，可能是由于羧甲基的引入提高了樣品的熱穩(wěn)定性，同時樣品中羥基的減少和羧甲基的增加，使改性樣品中的氫鍵結合減少，從而使改性樣品具有較好的熱穩(wěn)定性[12,38]。

3 結 論

通過優(yōu)化實驗所得麥麩CMAX的最大DS為0.66，經紅外光譜分析表明羧甲基化反應的成功。單糖組成分析表明麥麩AX的羧甲基化優(yōu)先發(fā)生在支鏈上，且側鏈Ara的存在會影響主鏈Xyl的羧甲基化。隨DS的增加，CMAX的分子質量由6.07×105Da降低至4.18×105Da，且改性反應對小分子質量分子的降解程度較大。與AX相比，CMAX溶液的剪切黏度顯著降低，而其熱穩(wěn)定性則顯著增加，最大熱分解速率所對應的溫度由285 ℃增加至306 ℃。

本實驗通過對麥麩AX進行羧甲基化改性獲得了黏度低、流動性好的聚陰離子性麥麩CMAX，為麥麩AX的羧甲基化改性提供了基礎理論。麥麩CMAX可認為是一種可降解和高生物相容性的功能性材料，其含有豐富的功能性基團，具有制備可食用膜、水凝膠等生物材料的應用潛能，也為麥麩AX的應用提供了新的思路。