劉愛平 劉俊 謝蕾 柏正平

摘要：目的觀察探討復方葶藶子湯對低氧性肺動脈高壓（HPH）大鼠平均肺動脈壓力（mPAP）的影響，針對HPH的發(fā)病機制，探索有效防治方法，為臨床應用提供一定的試驗依據(jù)。方法將健康雄性SD大鼠50只，分為正常組、HPH模型組、強的松組、復方葶藶子湯中、高劑量組，各組10只，分別于每日給藥后放入低氧艙8 h，連續(xù)干預21 d后根據(jù)改良右心導管術測大鼠平均肺動脈壓力并記錄，同時光鏡下觀察大鼠肺動脈HE染色及彈力纖維染色并記錄。結果實驗測得結果提示HPH模型組mPAP明顯高于正常組，且高于其他3組。復方葶藶子湯中、高劑量組大鼠mPAP較西藥強的松組大鼠有所降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）與HPH模型組相比，復方葶藶子湯組大鼠肺血管管壁較薄，管腔變寬;與復方葶藶子湯組相比，強的松組大鼠肺動脈管壁增厚，管腔變窄。結論“飲瘀同治”的復方葶藶子湯可抑制甚或部分逆轉低氧性肺動脈高壓大鼠的肺血管重構，從而降低低氧性肺動脈高壓大鼠的肺動脈壓力。

關鍵詞：復方葶藶子湯;低氧性肺動脈高壓;肺脹

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2021）02-0067-04

低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPH）是多種肺系疾病長期反復發(fā)作，引起肺血管阻力及肺動脈壓力升高，據(jù)統(tǒng)計，HPH普通人群患病率約為1%，而65歲以上人群的患病率高達10%[1]，HPH患病率至少為15/100萬[2]，目前針對HPH的治療藥物不能預防或逆轉疾病的進展[3]，因此探索新的治療方法顯得十分必要。

中醫(yī)古籍中無低氧性肺動脈高壓的記載，臨床上我們根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其歸于“肺脹”范疇，肺脹的病機多屬“本虛標實、飲瘀互結”[4]。本虛主要為“陽虛”、“氣虛”，常貫穿于病程之中，標實主要為“痰濁”、“水飲”、“瘀血”，其在疾病過程中是不斷變化發(fā)展的[5]。痰飲之為病，影響廣泛，故有云“百病多因痰作祟”。又如《金匱要略》所述“血不利則為水”，《血證論》所述：“血積日久，亦化為痰水”。表明“痰濁”、“水飲、“瘀血”等病理因素相互影響，互為因果，痰瘀互結，膠著難解。復方葶藶子湯是由柏正平主任根據(jù)中醫(yī)基礎理論和臨床多年實踐而擬定的經(jīng)驗方，其臨床應用多年取得了較好的療效。本文實驗觀察大鼠平均肺動脈壓（mean Pulmonary artery pressure，mPAP）、及觀察大鼠肺動脈HE染色及彈力纖維染色出發(fā)，進一步探討“飲瘀同治”的復方葶藶子湯治療HPH的可能機制，為復方葶藶子湯臨床治療提供理論基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物及實驗條件健康清潔級雄性SD大鼠50只，鼠齡6～8周，體重約（230±20）g，湖南省中醫(yī)藥研究院動物實驗中心提供，合格證號：N0.43004700042712。動物房清潔消毒，控制室溫在20℃～25℃，相對濕度65%～75%，自由進食飲水，分籠飼養(yǎng)，動物飲水及飼料每日檢查添加。

1.2實驗藥品（1）強的松片 規(guī)格：5 mg×100片，批準文號：國藥準字H31020771，上海上藥信誼藥廠有限公司。（2）復方葶藶子湯的制備：葶藶子10 g，水蛭3 g，黃芩10 g，矮地茶15 g，桂枝10 g，茯苓10 g，白術10 g，干地龍10 g，甘草5 g，中藥先浸泡30 min，后煎熬45 min，過濾去渣，藥液濃縮至166 mL，即每mL含2 g生藥。放入冰箱保存?zhèn)溆?。中藥藥材購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院。

1.3主要實驗試劑蘇木素染色液（廣州市秀威貿易有限公司，BC-DL-066-50mL）;間苯二酚染液套裝（武漢谷歌生物科技有限公司，G1054）。

1.4主要實驗儀器測氧儀（上海嘉華公司，CY-12CB）;低氧艙（自制）;MP100多導電生理儀（美國BIOPAC公司，BioNomadix）;正置光學顯微鏡（日本Nikon公司，Eclipse Ci-E/L/S）;成像系統(tǒng)（日本Nikon公司，DS-U3）;顯微鏡（常州恒隆儀器有限公司，OPTEC CCD TP510 200×）;電子天平（上海精密科學儀器 JA1003N）;實驗室PH計（瑞士METTLER TOLEDO，S20），酶標儀（德朗Diatek公司，DR-200Bs）。

1.5實驗方法

1.5.1實驗動物分組健康清潔級雄性SD大鼠，采用隨機數(shù)字表法分組，分為正常組、HPH模型組、強的松組、復方葶藶子湯中、高劑量組，各組10只，大鼠自由進食飲水。

1.5.2給藥（1）正常組：大鼠于正常環(huán)境中活動及進食，每日生理鹽水（1mL/100g）灌胃，飼養(yǎng)21 d。（2）HPH模型組：大鼠根據(jù)彭公永等[6-7]方法進行造模，將大鼠置于常壓低氧艙內，設置并調控艙內氧濃度，向艙內輸入氮氣，調控艙內氧濃度為（10±0.5）%，每日缺氧8 h，低氧干預持續(xù)21 d。每日予生理鹽水（1 mL/100 g）灌胃30 min后放入低氧艙。（3）強的松組：本實驗選用強的松片作為西藥對照組，每日放入低氧艙前30 min灌胃;強的松片，5 mg/片，人最高用量為60 mg/d，大鼠用藥劑量按體表面積折算相當于人臨床用藥等效劑量為7.8 mg/d，實驗時使用2倍等效劑量15.6 mg/kg，用3mL蒸餾水配制[8]。其余同HPH模型組。（4）復方葶藶子湯中劑量組：根據(jù)大鼠表面積換算選定10 g/kg·d藥液為中劑量組，每日放入低氧艙前30 min灌胃。余同HPH模型組。（5）復方葶藶子湯高劑量組：根據(jù)大鼠表面積換算選定20 g/kg.d藥液為高劑量組，每日放入低氧艙前30 min灌胃。余同HPH模型組。

1.5.3一般情況觀察及肺動脈壓力測定（1）觀察一般情況：造模期間，每日對大鼠的精神狀態(tài)、活動狀況、呼吸、口鼻分泌物、進食等情況進行觀察并及時記錄，期間對死亡大鼠作相應處理和記錄。（2）肺動脈壓力測定：大鼠末次給藥后根據(jù)孫波[9]及黃曉穎等[10]插入導管法測定mPAP。首先大鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（2～4 L/kg），肝素（50u/mL）抗凝，仰臥位固定，剪除頸部鼠毛并消毒，暴露分離右側頸外靜脈，以醫(yī)用眼科剪于靜脈中上1/3處斜行剪開頸外靜脈，作“V”形切口，以鑷子稍提起近心端切口邊緣，插入測壓導管。導管插入時保持導管弧向上。經(jīng)右心房及右心室送到肺動脈，待肺動脈壓力波形穩(wěn)定后用生理記錄儀記錄mPAP。

1.5.4實驗動物處理、取材及標本制備

1.5.4.1蘇木素-依紅（hematoxylin-eosin，HE）染色測壓結束后處死大鼠，剖取肺臟。以生理鹽水漂洗肺組織，剪下右肺，取肺動脈行HE染色;待光鏡下觀察。

1.5.4.2彈力纖維染色（1）肺動脈石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。（2）酸化高錳酸鉀（高錳酸鉀：硫酸=1∶1混合）氧化5 min，水洗后，用草酸溶液漂白1～2min。（3）流水沖洗2min。（4）切片放入裝有間苯二酚品紅染色液中加蓋浸染染色，室溫下3～4 h，流水沖洗。（5）鹽酸酒精分化至無染液脫下，彈力纖維清晰的紫紅色，背景近乎無色。（6）將飽和苦味酸與酸性品紅9∶1混合成VG染液，切片水甩干，染3 min，快速水洗，正丁醇透明。（7）透明，封片處理;（8）顯微鏡圖像采集分析。

1.6統(tǒng)計學方法各分組所得計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，各組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析。P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1大鼠一般情況（1）正常組大鼠精神好，毛發(fā)光澤、活動度高，進食正常，反應敏捷，實驗期間未出現(xiàn)死亡。（2）HPH模型組、強的松組、復方葶藶子湯中、高劑量組大鼠在低氧環(huán)境中出現(xiàn)不同程度的精神欠佳，毛發(fā)雜亂，呼吸急促，口鼻分泌物增加，昏昏欲睡，少動少食。其中HPH模型組大鼠死亡3只;強的松組大鼠死亡3只;復方葶藶子湯中劑量組大鼠死亡3只、復方葶藶子湯高劑量組大鼠死亡2只;大鼠死亡原因考慮如下：①灌胃操作存在失誤，導致誤入肺組織而死。②低氧狀態(tài)下肺部炎癥及呼吸困難而致死亡。③個別大鼠體質弱，對實驗藥物不耐受。④踩踏。⑤其他。

2.2大鼠mPAP的變化造模結束后測得大鼠mPAP的情況，（1）與正常組大鼠mPAP相比，HPH模型組、強的松組、復方葶藶子湯中、高劑量組大鼠mPAP均增高，差別具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;結合造模組大鼠的一般情況，可表明低氧性肺動脈高壓大鼠的造模是成功的。（2）與HPH模型組相比，其余4組大鼠mPAP均降低，差別具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;其中強的松組大鼠mPAP較復方葶藶子湯中、高劑量組增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），中劑量組大鼠mPAP較復方葶藶子湯高劑量組增高，差異亦具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（見表1）

2.3大鼠肺血管組織學改變光鏡下觀察大鼠肺動脈HE染色及彈力纖維染色發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠肺小動脈管壁薄且均勻，管腔大且通暢，內皮細胞連續(xù)性較好;HPH模型組大鼠肺小動脈管壁明顯增厚，管腔狹窄明顯，內皮細胞的連續(xù)性破壞，管腔內見彈力纖維增生及受損，血管結構變化較明顯（見圖1B及圖2）。與HPH模型組相比，強的松組大鼠肺小動脈管壁稍薄，管腔略有增寬;復方葶藶子湯中、高劑量組大鼠的肺小動脈管壁薄，管腔增寬。結合彈力纖維染色，復方葶藶子湯高劑量組大鼠肺小動脈形態(tài)幾乎恢復至正常組的狀態(tài)，我們可認為肺小動脈重構得到抑制甚或部分逆轉。（見圖1、圖2）

3討論

現(xiàn)階段研究認為，低氧性肺動脈高壓的發(fā)病機制主要因缺氧而致肺血管異常收縮、肺血管阻力增加引起肺小動脈痙攣、收縮，肺阻力增加，肺血管重構，進而導致肺血流動力學的改變。中醫(yī)古籍中無低氧性肺動脈高壓的記載，臨床上根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其歸于“肺脹”范疇，肺脹的病機多屬“本虛標實、飲瘀互結”。本虛主要為“陽虛”、“氣虛”，常貫穿于病程之中，標實主要為“痰濁”、“水飲”、“瘀血”，其在疾病過程中是不斷變化發(fā)展的。痰飲之為病，影響廣泛，故有云“百病多因痰作祟”。又如《金匱要略》所述“血不利則為水”，《血證論》所述“血積日久，亦化為痰水”。表明“痰濁”、“水飲、“瘀血”等病理因素相互影響，互為因果，痰瘀互結，膠著難解。而陽虛又可致水泛，導致水飲凌心，從而出現(xiàn)一系列癥狀。

復方葶藶子湯是由恩師柏正平根據(jù)以上中醫(yī)基礎理論和臨床多年實踐而擬定的經(jīng)驗方，由葶藶子、水蛭、黃芩、矮地茶、桂枝、茯苓、白術、干地龍、甘草組成。該方中葶藶子瀉肺逐水、止咳平喘，為君;其可宣通肺部壅滯，加強肺氣的宣發(fā)肅降之能，使水濕得以布散周身并下輸于腎及膀胱，達到瀉肺逐水之效;水蛭活血逐瘀，為臣，助其藥效直達病所，并助葶藶子宣肺行氣;黃芩清肺化痰、止咳平喘;茯苓、白術、桂枝共奏溫脾化飲之效，脾陽得溫，脾氣得升，則痰飲得化，故絕其“生痰之源”。矮地茶長于化痰止咳，兼能平喘、利濕、活血化瘀;血液得行，瘀血得通，血利則水消氣順，故諸癥自除。地龍具有通絡平喘，利尿之效;甘草健胃和中，調和諸藥;方中諸藥使“痰飲”、“瘀血”等病理產(chǎn)物無所遁形，分利而出。中醫(yī)學認為肺動脈壓力增高是痰、飲、瘀相互作用的結果。故我們采取“飲瘀同治”之法，飲去則痰無生化之源，瘀行則肺絡通暢，共奏瀉肺逐飲、祛瘀通絡、溫陽化氣之效。

實驗觀察到大鼠低氧1周后，造模組大鼠開始出現(xiàn)不同程度的精神欠佳，毛發(fā)雜亂，呼吸稍促，口鼻分泌物增加，少動少食，其中以HPH模型組更為明顯，表明在常壓低氧的情況下大鼠的一般情況及進食受到影響。與此同時復方葶藶子湯組大鼠精神稍好，活動較多，進食較HPH模型組大鼠增加。表明“飲瘀同治”的復方葶藶子湯能改善其癥狀。

感染、缺氧等因素導致肺血管收縮，肺阻力增加，肺血管重構，進而導致肺血流動力學的改變。實驗測得結果提示HPH模型組mPAP明顯高于正常組，且高于其他三組。復方葶藶子湯中、高劑量組大鼠mPAP較西藥強的松組大鼠有所降低，說明復方葶藶子湯組與強的松組比較，其降低肺動脈壓力的療效較好，其中復方葶藶子湯高劑量組大鼠mPAP低于復方葶藶子湯中劑量組。表明復方葶藶子湯預防或治療本病需達一定劑量。復方葶藶子湯復方湯劑的成分較為復雜，藥味不單一，結合本方藥物組成及中藥現(xiàn)代藥理研究，“飲瘀同治”的復方葶藶子湯可能是通過多方面、多靶點減輕肺小動脈收縮、痙攣，擴張肺血管，改善肺血管阻力，增加肺血管順應性而降低肺動脈壓力。

低氧性肺動脈高壓的肺血管重構是以血管壁增厚為主要結構的改變，尤以中膜平滑肌增厚為主。我們從HE染色及彈力纖維染色觀察到正常組大鼠肺血管管壁薄，管腔大，內皮細胞連續(xù)性較好;而HPH模型組大鼠肺血管管壁明顯增厚，管腔明顯變窄甚或閉塞，內皮細胞的連續(xù)性被破壞，彈力纖維受損或增生，肺血管結構改變。與HPH模型組相比，中藥組大鼠肺血管管壁較薄，管腔變寬;與中藥組相比，強的松組大鼠肺動脈管壁增厚，管腔變窄。表明“飲瘀同治”的復方葶藶子湯可抑制甚或部分逆轉低氧性肺動脈高壓大鼠的肺血管重構。

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（收稿日期：2020-09-09）