孔凡建 劉然

摘要：目的建立一種高效液相色譜法來(lái)測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中木犀草苷的含量。方法采用Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm）為色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）為流動(dòng)相，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果在上述色譜條件下，復(fù)方金銀花顆粒中木犀草苷的含量在2.4076～38.5220μg·mL-1（R=0.9998）線(xiàn)性關(guān)系良好（R=0.9998），回歸方程為y=25.69x-18.127，測(cè)得平均加樣回收率為100.13%，RSD為1.48%（n=9）。結(jié)論所建立的方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可用于測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中木犀草苷的含量，可為其質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞：復(fù)方金銀花顆粒;木犀草苷;高效液相色譜;含量測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.11文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B文章編號(hào)：1007-2349（2021）02-0071-04

復(fù)方金銀花顆粒由金銀花、連翹、黃芩三味中藥組成，具有清熱解毒，涼血消腫的功效，用于風(fēng)熱感冒，喉痹，乳蛾，目痛，牙痛及癰腫瘡癤等癥[1]。處方中金銀花和連翹均為清熱解毒類(lèi)中藥的代表，兩者均有清熱解毒的功效，在抗菌、抗炎、抗病毒等方面效果顯著[2]。黃酮類(lèi)的木犀草苷和有機(jī)酸類(lèi)的綠原酸是金銀花中重要的活性成分，也是對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)的指標(biāo)成分。其中，木犀草苷具有較強(qiáng)的殺菌消炎，解熱鎮(zhèn)痛的功效，在抗病毒和抗腫瘤方面表現(xiàn)出較好的作用[3]，也具有較低的肝毒性，對(duì)肝細(xì)胞有保護(hù)作用。2005年版《中國(guó)藥典》把木犀草苷的含量列為了金銀花質(zhì)量的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一，并且首次確定了對(duì)金銀花藥材采用高效液相色譜法測(cè)定其中木犀草苷的含量;連翹中主要成分為連翹酯苷、連翹苷、皂苷等，有研究從注射用雙黃連（凍干）的連翹中共分離得到了39個(gè)化合物，黃酮類(lèi)化合物有8個(gè)，其中就包含木犀草苷，說(shuō)明連翹中也含木犀草苷[4];黃芩中富含多種黃酮類(lèi)化合物，其中包括黃芩苷及黃芩素等，但尚未報(bào)道其是否含有木犀草苷。黃芩具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤，心血管保護(hù)、抗高血糖及預(yù)防并發(fā)癥等作用[5]。

復(fù)方金銀花顆粒現(xiàn)收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑·第十冊(cè)》（WS3-B-1985-950），標(biāo)準(zhǔn)中僅收載有對(duì)該制劑進(jìn)行理化鑒別，黃芩苷的薄層色譜鑒別項(xiàng)以及常規(guī)檢查的方法，尚未收載含量指標(biāo)測(cè)定的方法，不利于質(zhì)量控制。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前已有一些學(xué)者對(duì)復(fù)方金銀花顆粒研究、建立了多種有效成分含量測(cè)定的方法。比如：何悅[6]、范婉思[7]、唐勵(lì)靜等[8]運(yùn)用HPLC法對(duì)其中10余種成分的含量進(jìn)行了測(cè)定，為復(fù)方金銀花顆粒的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量保證提供了理論依據(jù);楊志雄等[9]運(yùn)用RP-HPLC法對(duì)其中的黃芩苷進(jìn)行了含量測(cè)定，但相關(guān)資料中并未發(fā)現(xiàn)復(fù)方金銀花顆粒中的木犀草苷含量測(cè)定的具體方法。因此，為提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文以木犀草苷為復(fù)方金銀花顆粒的含量指標(biāo)，建立高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中木犀草苷的含量。

1材料

1.1儀器Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）色譜柱;Agilent高效液相色譜儀（型號(hào)：1260 Infinity）;北京賽多利斯BP211D電子分析天平;北京賽多利斯MSE224S-11CE-DU電子天平;上海必能信CPX5800H-C超聲波清洗儀;Carry60紫外分光光度計(jì)（安捷倫科技-中國(guó)有限公司）。

1.2試藥與試劑木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)：111720-201810，含量：93.5%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）;復(fù)方金銀花顆粒（廠(chǎng)家：廣州諾金制藥有限公司，批號(hào)：0271203、0271221、0271246，規(guī)格：10 g/袋，相當(dāng)于總藥材3.5 g）;乙腈、甲醇為色譜純（默克股份兩合公司），無(wú)水乙醇、磷酸為分析純（四川西隴科學(xué)有限公司）;水為純化水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm）;以乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）為流動(dòng)相;柱溫為30℃;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)350nm;進(jìn)樣體積為10μL。在此色譜條件下，供試品溶液B的色譜圖與對(duì)照品溶液A的色譜圖在相應(yīng)保留時(shí)間處顯相同的峰，陰性對(duì)照品溶液C與對(duì)照品溶液A相應(yīng)的保留時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)色譜峰，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2溶液的制備取木犀草苷對(duì)照品10mg，精密稱(chēng)定，置于100 mL的棕色量瓶中，加入70%乙醇30 mL，超聲溶解，用70%乙醇稀釋至刻度線(xiàn)，搖勻，即得100μg/mL的對(duì)照品貯備液，放在陰涼避光處進(jìn)行保存，備用。精密量取1 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，用70%乙醇稀釋并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，得到對(duì)照品溶液。

取裝量差異項(xiàng)下的復(fù)方金銀花顆粒，研細(xì)，取約3 g，精密稱(chēng)定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率350W，頻率50kHz）20 min，放至室溫，再稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，即得供試品溶液。

按處方比例稱(chēng)取不含金銀花和連翹的其它藥材，按其制法制備陰性制劑，依法制備成陰性對(duì)照品溶液。

2.3方法學(xué)考察線(xiàn)性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為2.5、5、10、20、30、40μg/mL的溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以木犀草苷對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明對(duì)照品濃度為2.4076μg/mL～38.5220μg/mL的范圍內(nèi)木犀草苷對(duì)照品的濃度和峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其回歸方程為：A=25.69C-18.127，R=0.9998（n=6）。

精密度試驗(yàn)：精密吸取上述對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10μL，記錄木犀草苷峰面積。結(jié)果木犀草苷的平均峰面積為253.20802，峰面積的RSD為0.23%（n=6），表明儀器的精密度良好，滿(mǎn)足測(cè)定要求。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次樣品（批號(hào)：271203）6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1”中所敘述的條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)檢測(cè)得到的峰面積進(jìn)行記錄，根據(jù)回歸方程計(jì)算木犀草苷的含量，結(jié)果木犀草苷的平均含量為0.1257mg/g，含量的RSD為0.99%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液于0、2、4、8、12、24小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，每次進(jìn)樣10μL，對(duì)檢測(cè)到的峰面積進(jìn)行記錄，計(jì)算木犀草苷的含量。結(jié)果木犀草苷的平均含量為0.1253mg/g，含量的RSD為0.25%（n=6），表明依上述方法制備的樣品溶液在24 h內(nèi)變化不明顯，測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定，能夠滿(mǎn)足正常測(cè)定需要。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱(chēng)取已知含量的樣品（批號(hào)為0271203，每份約1.5 g）9份，精密稱(chēng)定，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別在1、2、3號(hào)樣品中精密加入木犀草苷對(duì)照貯備溶液1.0 mL，在4、5、6號(hào)樣品中精密加入木犀草苷貯備溶液2.0 mL，在7、8、9號(hào)樣品中精密加入木犀草苷貯備溶液3.0 mL，依法得到供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，計(jì)算得復(fù)方金銀花顆粒中木犀草苷的回收率。結(jié)果木犀草苷的平均回收率為100.13%，RSD=1.48%（n=9），詳見(jiàn)表1。

樣品含量測(cè)定取3個(gè)不同批次的復(fù)方金銀花顆粒（批號(hào)為271203、271221、271246），每批平行2份，依法制備供試品溶液，按擬定色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，并計(jì)算樣品中木犀草苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3結(jié)論與討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取木犀草苷對(duì)照品適量，用70%乙醇配制成3μg·mL-1木犀草苷對(duì)照品溶液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（《中國(guó)藥典》2015版四部），在200～600nm范圍下掃描，如圖2，結(jié)果顯示木犀草苷紫外最大吸收為350nm，參考文獻(xiàn)、藥典及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm。

3.2耐用性試驗(yàn)本研究選用C18柱進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)中考察了不同品牌的C18色譜柱的分離效果，Phenomenex luna C18（250×4.6mm，5μm），漢邦Kromasil C18（250mm×4.6 mm，5 μm），Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm），結(jié)果木犀草苷在三種色譜柱的分離度分別為1.85、1.61和2.12，分離度均大于1.5，結(jié)果表明不同品牌的色譜柱均能滿(mǎn)足檢測(cè)的需求。

3.3提取溶劑和時(shí)間選擇試驗(yàn)通過(guò)比較70%甲醇50 mL、70%乙醇50 mL作為提取溶劑，超聲提取20min，測(cè)定木犀草苷含量，發(fā)現(xiàn)兩種溶劑提取測(cè)得木犀草苷含量無(wú)差別，同時(shí)，對(duì)比25 mL70%乙醇和50 mL 70%乙醇，發(fā)現(xiàn)加入50 mL70%乙醇后，木犀草苷提取率相對(duì)較高，因此，最終選擇70%乙醇50 mL作為溶劑。試驗(yàn)還考察了加入70%乙醇后分別超聲10min、20min和30min對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示超聲10min，測(cè)定木犀草苷的含量偏低，超聲20min和超聲30min，測(cè)得樣品中木犀草苷的含量基本一致，考慮到節(jié)省時(shí)間，因此選擇超聲20min。

目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上已有30多家獲批生產(chǎn)藥企生產(chǎn)復(fù)方金銀花顆粒，但是《中國(guó)藥典》還未將復(fù)方金銀花顆粒收載記錄，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)其有效成分的含量測(cè)定并未收載檢測(cè)方法，缺少對(duì)主要有效成分的指標(biāo)控制。金銀花和山銀花的化學(xué)成分、藥理作用有所差別，金銀花中木犀草苷的含量高于山銀花，解熱抗炎效果也比山銀花好，山銀花和金銀花的價(jià)格相差較大，部分商人為謀取更大的利潤(rùn)，用山銀花代替金銀花，臨床用藥時(shí)出現(xiàn)藥效不足、用藥過(guò)多等問(wèn)題[10]。為避免用山銀花代替金銀花來(lái)使用的現(xiàn)象，有必要對(duì)該制劑中木犀草苷的含量進(jìn)行檢測(cè)，以控制金銀花的質(zhì)量而使該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有所提高。

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（收稿日期：2020-07-15）